材料和试剂

注意：所有化学药品均存放在专用室和安全柜中，并根据产品安全数据表（SDS）进行操作，并遵循制造商的保存期限说明（有关存放温度，请参见下文–RT =室温）。

消耗品：

1 ml注射器（Terumo，货号：SS + 01T1）
26 g ^ ½英寸的绒毛（Terumo，目录号：AN-2613R1）
移液移液器（杆量3 ml ）（Biosigma ，目录号：390514）
微量离心管（1.5 ml SafeLock ）（Eppendorf，目录号：7953691744）
聚丙烯15 ml离心管（Sarstedt，目录号：62.554.502 ）。

寄生虫和小鼠
1. 疟原虫柏氏疟原虫ANKA寄生虫（从O.博士惠赠Silvie ，CIMI，巴黎，储存于液氮中，在室温下RPMI后解冻是之前稀释IP -injected小鼠）

2. CD-1小鼠（25-30g的雄性CD-1 ® IGS，查尔斯河）

小鼠被ip 感染了10 6个被感染的红细胞，并通过薄血涂片监测了寄生虫病。对于以下详细步骤，被感染小鼠的寄生虫病应在5％至10％之间，通常在感染后第5至10天获得。

3. 苏打肝素（25,000 UI / 5 ml，赛诺菲，在室温下保存）

iRBC （感染的红细胞）的顺序裂解
Tris Base（Euromedex ，目录号：200923-A，在RT存放）
氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：60128，在RT储存）
CaNa 2 · EDTA（Sigma - Aldrich，目录号：ED2SC，在室温下储存）
NaCl（Euromedex ，目录号：1112，在RT储存）
MgSO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：M7506，在室温下保存）
Triton X-100（Euromedex ，目录号：EU2000-B，在RT存放）
D-山梨糖醇（Sigma - Aldrich，目录号：S1876，在室温下储存）
Nycodenz ® 粉末（EUROBIO 不收，目录号：1002424，储存于RT）
10x PBS（Euromedex ，目录号ET330-A，在RT存放）
不含cOmplete TM EDTA的抗蛋白酶混合物（Roche，目录号：5056489001，在4°C下储存）
Percoll 解决方案（GE Healthcare，目录号：17-0891-01，在4 °C下存储）
带有HEPES的RPMI介质1640 （Thermo Fisher Scientific，目录号：12017599，在4°C下储存）
Equinatoxin II酶（来自斯洛文尼亚卢布尔雅那国家化学研究所的Gregor Anderluh 教授的礼物，等分试样保存在-80°C的PBS中）
皂素裂解液（Sigma Aldrich，目录号：S7900，粉末在室温下保存）
60％Nycodenz 解决方案（有关存储条件，请参阅食谱）
Nycodenz 缓冲介质

Nycodenz 股票解决方案

60％Nycodenz 溶液（新鲜配制）

Equinatoxin II（EQT）裂解缓冲液（请参阅食谱）
皂素裂解液（请参见食谱）
皂素10倍原液

1x皂素裂解液（新鲜配制）

Triton裂解缓冲液（请参见配方）
Percoll 渐变图层（请参见食谱）
90％Percoll 储备溶液

80％Percoll 层

70％Percoll 层

60％Percoll 层

40％Percoll 层

SDS-Page和W 酯印迹分析
Tris Base（Euromedex ，目录号：200923-A，在RT存放）
SDS 20％溶液（Sigma-Aldrich，目录号：05030，在室温下保存）
甘氨酸（Euromedex ，目录号：26-128-6405，存放在RT）
甘油（Euromedex ，目录号：EU3550，在RT存放）
Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：8221840500，在室温下存储）
凝胶聚丙烯酰胺（Bio-Rad公司的Mini-PROTEAN ® TGX TM 预制胶，目录号的：4561043，在保存在4℃）
PageRuler 预染蛋白质梯（Thermo Scientific的，目录号：26619，储存在-20℃）
低脂奶粉（Régilait ，脱脂牛奶0.8％脂肪，在室温下储存）
Western印迹检测试剂盒（SuperSignal TM West Dura延长底物，Thermo Fisher Scientific，目录号：34075，在4°C下储存）
抗体（一抗和二抗列于表1）
3x样品缓冲液（请参见配方）
运行缓冲区（请参见食谱）
传输缓冲区（请参阅食谱）
阻止解决方案（请参阅食谱）
Western blot洗涤缓冲液（请参见食谱）

版权所有©20 20 的作者;专用特许生物协议LLC 1

说明：logonew

表1.本研究中使用的一抗和二抗列表

抗原A

（分子量）

一抗

二抗

描述

募集中

存储

工作稀释

制造商（产品目录号）或提供商

描述

（稀释）

制造商

（目录编号：）

存储

本地化（参考）

鼠标TER119

（52 kDa ）

单克隆的

克隆TER119

鼠

4°摄氏度

1/1000

干细胞

（60033）

抗鼠

（1 / 20,000）

西格玛奥德里奇

（A5795）

-20°摄氏度

红细胞膜（Kina et al。，2000）

人PP1c（39 kDa ）

单克隆的

克隆E9

老鼠

4°摄氏度

1/1000

圣克鲁斯生物技术（sc-7482）

防鼠

（1 / 20,000）

西格玛奥德里奇

（A9044）

-20°摄氏度

红细胞溶质（Blisnick et al。，2006）

恶性疟原虫EXP2

（31 kDa ）

抗血清

兔子

-20°摄氏度

1/1000

詹姆斯·伯恩斯博士

反兔

（1 / 20,000）

西格玛奥德里奇

（A0545）

-20°摄氏度

寄生虫（幼年期），PV膜，被感染红细胞中的寄生虫囊泡（Meibalan 等，2015）

恶性疟原虫醛缩酶（40 kDa ）

抗血清

兔子

-20°摄氏度

1/5000

Jude Przyborski博士

反兔

（1 / 20,000）

西格玛奥德里奇

（A0545）

-20°摄氏度

寄生虫的细胞质和寄生虫的膜（非活性形式）（Knapp 等，1990）

恶性疟原虫HSP70（70 kDa ）

抗血清

兔子

-20°摄氏度

1/5000

Jude Przyborski博士

反兔

（1 / 20,000）

西格玛奥德里奇

（A0545）

-20°摄氏度

寄生虫（Hliscs et al。，2013）

一个的疟原虫抗原来自P. 约氏疟原虫（EXP2）或恶性疟原虫（醛缩酶，HSP70）。然而，针对这些抗原的所提出的抗血清交叉反应，与P. 疟原虫EXP2，醛缩酶和HSP70 respectively.The抗体还靶向人PP1c识别鼠标PP1c。

版权所有©20 20 的作者;专用特许生物协议LLC 1

说明：logonew

设备

实验室旋转轮（Stuart，型号：SB3）
50 ml Nalgene橡树岭高速离心管 s，带密封盖，PSF（Thermo Fisher Scientific，目录号：3137-0050）
微量离心管冷冻离心机（Eppendorf，型号：5427R）
离心15毫升试管（Eppendorf，型号：5810R）
超高速离心机（带定角转子F20-12x50 LEX的Sorvall Lynx 4000离心机，ThermoScientific ）
超声处理设备（Bioruptor plus，Diagenode，目录号：B01020001）
整体加热器（Stuart，型号：SBH200D）
凝胶电泳和转移室（Bio-Rad Miniprotean Tetra细胞系统）
用于西方过滤器印迹转移的纸张（Whatman 3MM CHR，GE H Ealthcare，目录号3030-917）
硝酸纤维素膜（Amersham protran Premium 0.45硝酸纤维素，Thermo Fisher Scientific，目录号：15269804）
真空封口机（KitchenGynti ）
摇杆平台（Labnet 往复，3D或摇杆振动台）
分子成像仪（Bio-Rad ChemiDoc XRS +）

软件

Image Lab 5.0（Bio-Rad）

程序

注意：此PROC Edure包含3 小号挠度S（A，B和C）。第A和B必须进行不中断（总持续时间约1天）获得在最后的样品。部分B可以被冷冻去之前C 节

收集和隔离P. 疟原虫感染的红细胞
用5 ml 60％的Nycodenz 溶液准备两个15 ml 聚丙烯管（请参阅配方1），并在室温下放置1-2 h 。
让80％，70％，60％和40％的percoll 溶液在室温下（1-2小时）放置。
心脏流血2个CO 2 -euthanized（参见协议批准“论”一节）P. 伯氏疟原虫-感染的小鼠（5-10％之间的寄生虫血症），使用26 ģ ½ “针用含有0.15 ml肝素附1毫升注射器。
层1毫升轻轻肝素化血就60 Pasento Nycodenz ® （一只小鼠每Nycodenz ® 层;肝素化血液可能音量改变从800 Myueru至1.2ml）。
在室温下以450 xg离心20分钟，无制动且加速度最小。
小心收集棕色组成的层（图1中示出）P. 疟原虫感染的红细胞在上部层和之间的界面Nycodenz 层用移液管到新的15ml试管。
在每个试管中加入10 ml 1x PBS（保留在室温下）。
在室温下以450 xg离心10分钟。
丢弃目标。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902908--1430 Christine Pierrot 804729 \ Figs jpg \ fig1.jpg

1.图形摘要图的分离和鉴别分级P. 疟原虫感染的红细胞。结果后Nycodenz ® 和珀梯度，和分数要收集（感染红细胞和 ， 而 ）所示。在在该过程的每个步骤结束时，每个部分都用灰色框表示。这些派别的Western印迹分析总结于图2。

的顺序裂解P. 疟原虫感染的红细胞
注意，步骤B1-B8是在室温进行（抓紧加速度和制动条件下）一个第二即步骤B9-B16必须在冰上进行（在离心4 ℃，最大加速和制动）。

准备EQT裂解缓冲液（请参见配方2 ）。
在每个感染的红细胞沉淀上添加1 ml EQT裂解缓冲液。
在室温（20-25 rpm）的旋转轮上孵育15分钟（可使用薄薄的血涂片监测裂解）。
在50 ml Nalgene Oak Ridge高速离心管中准备Percoll 梯度：轻轻凝结加入：8 ml 80％Percoll 溶液，6 ml 70％Percoll 溶液，6 ml 60％Percoll 溶液和6 ml 40％Percoll 解决方案（小心地将每一层都放在另一层之上）。立即使用渐变。
合并两管经EQT裂解的感染红细胞（总体积2-3 ml）。
缓慢吸移Percoll 梯度顶部的EQT裂解的感染红细胞并密封管。
立即在室温下以10,000 xg离心30分钟，加速度最小且无制动。
使用移液管，收集仔细每层所示的图1至新的1.5毫升管。收集级分1（上清液），而不与所述层2到达界面并继续到小号TEP B9。收集级分2和3并继续到小号提示B10（有关层/分数的数字，请参见图1）。
在4°C下以18,000 xg的速度将组分1 离心30分钟，收集沉淀物（颗粒P1），将上清液收集到新的1.5 ml试管中并重复离心，收集上清液（上清液SN1）。
笔记：

经宿主毒素PP1的检测证明，经Equinatoxin 裂解和Percoll 梯度洗脱后收集到的SN1 包含红细胞胞浆，必须小心收集该色素而不干扰沉淀，并在18,000 x g下离心两次30分钟。重要的是要注意，在15分钟内进行了Equinatoxin 裂解，因为较短的孵育时间可能无法完全溶解被感染的红细胞，而较长的孵育时间可能会增加寄生虫含量的泄漏，如在某些情况下观察到的寄生虫HSP70离散染色所示。
SN1首次离心后获得的沉淀P1含有红血球鬼影（TER119阳性信号），该沉淀应为红色，红色沉淀底部存在黑色沉淀表明存在寄生虫污染，在W中观察到EXP2信号。P1的西部时代印迹分析可对应于寄生虫囊泡在红血细胞中存在，作为用于描述P. 约氏疟原虫-感染的细胞，这将具有在离心过程中鬼一起沉淀（Meibalan 等人，2015）。
将组分2和3以18,000 xg 的速度在4°C下离心30分钟，并用1 ml的1x PBS洗涤3次以除去percoll。请注意，在前两次离心之后，这些组分可能无法正确沉淀，请丢弃所有污染物。
注意：在percoll 梯度后获得的级分2和3 可能对应于感染了不同阶段的寄生虫的红细胞（如在Heiber 和Spielmann ，2014中观察到的），即使在涂片上分析这些级分时尚不清楚。请注意，我们一直在这两个部分中观察到EXP2，HSP70和醛缩酶表达的相同特征，并且在感染伯氏疟原虫的小鼠中，在循环血液中仅观察到了环至滋养体阶段（Janse 等人，2004）。。

准备1x皂素裂解液（请参阅第3章）。
在沉淀2和3上加入1 ml 1x皂素裂解液（步骤B10），在冰上孵育10分钟。
在4°C下以18,000 xg的速度将皂苷裂解的级分2和3 离心30分钟。收集沉淀物（将在步骤B15中处理）。将沉淀物收集到新的1.5 ml管中并重复离心。 SN2和SN3总数）。
请注意，皂苷裂解后收集的SN2和SN3与PV含量相对应。重要的是，将这些馏分以18,000 xg的速度离心两次至少30分钟，以避免被PV和/或寄生虫膜污染。由不存在的检测EXP2中W¯¯ 西部时代印迹analysis.However，在这些确认确认所观察到的HSP70信号以前的结果显示，使用皂苷裂解PV膜不会阻止寄生虫隔室泄漏（Burghaus 和Lingelbach ，2001; Nyalwidhe and Lingelbach ，2006）。在缺乏能够特异性裂解PV膜的更特异性洗涤剂或酶的情况下，对这种在寄生虫生长和与其宿主细胞通讯中起关键作用的区室的研究仍然非常复杂（综述在Matz 等人，2020年）。

准备Triton裂解液（请参见第4章）。
在步骤B13的沉淀2和3上加入200 µl Triton裂解液，并在冰上孵育5分钟。
将Triton裂解的级分2和3在4°C下以18,000 xg离心30分钟。收集沉淀（沉淀P2t和P3t）。将沉淀收集到新的1.5 ml管中并重复离心。在冰上收集新的印迹（上清液） SN2t和SN3t）。
笔记：

Triton X-100裂解后收集的污染物SN2t和SN3t对应于寄生虫胞质溶胶，通过检测寄生虫醛缩酶和HSP70证明，这些馏分中EXP2信号的检测可能对应于PV膜中嵌入的EXP2蛋白（并在Triton X-100裂解过程中释放）以及寄生虫的胞浆EXP2（已在该寄生虫的年轻阶段进行了观察）（Meibalan 等，2015）。
沉淀物P2t和P3t对应于PV膜和寄生虫膜。在这些沉淀物中醛缩酶的检测可以通过与寄生虫膜相关的无活性形式的存在来解释（Knapp 等，1990）。
在每个部分中添加所需量的样品缓冲液：将100μl的1 x 样品缓冲液添加到沉淀P1，P2t和P3t中，并将100μl的3 x 样品缓冲液添加到200μl上清液SN1，SN2s，SN3s，SN2t和SN3t中。
注意：甲LL的级分SN1，P1，SN2s，SN3s，SN2t，SN3t ，P2T和P3T可以被存储在-20℃下在样品缓冲液中事先W¯¯ 西部时代印迹分析）。所有收集到的馏分也可以在质谱法中使用analysis.In情况下免疫沉淀（IP）必须质谱之前或进行W¯¯ 西部时代印迹，不添加样品缓冲液，并使用该级分进行到IP。

蛋白质提取物的蛋白质印迹分析
SDS页面
将三个聚丙烯酰胺凝胶放入充满运行缓冲液的电泳室中。
在4 °C的超声处理设备中对样品进行超声处理（10个循环，每个10 s）
在分块加热器中将样品在95°C下孵育3分钟。
每条泳道将样品上样到三种提取物中，每条泳道分别提取30 µl聚丙烯酰胺凝胶（SN1除外：使用15 µl），3种相同的凝胶）。上样的蛋白梯（7 µl）。
在110 V下运行凝胶1小时30 分钟。
蛋白质印迹分析
使用海绵，滤纸，硝酸纤维素膜和SDS凝胶准备印迹，并在装有转移缓冲液的转移室中进行蛋白质转移（在4°C的房间中80 V进行1 h 30分钟）。
转移后用1x PBS冲洗三个硝酸纤维素膜（可以通过用Ponceau红染色硝酸纤维素膜来确认转移）。
准备100毫升的封闭液。
将膜在10 ml封闭溶液中于摇动平台上于室温孵育1 小时。
将膜放入三面密封的透明薄片中（切成膜的大小）。加入1 ml含一抗的封闭溶液（有关抗体的稀释度和特异性，请参见表1；注意抗Pf HSP70，抗Py EXP2可以与抗Pf Aldolase 抗血清结合在一起使用，因为它们都是在兔子体内繁殖的，而天然蛋白质的MW也不同）并密封透明片的最后一面。在旋转轮上于4°C孵育过夜。
将膜在Western印迹洗涤缓冲液中于摇动平台上于室温下洗涤五次，每次15分钟。
将二抗稀释在封闭溶液中（关于抗体的稀释度和特异性，请参见表1），并在摇摆平台上将膜在室温下孵育30分钟。
在RT平台上，在Western blot洗涤缓冲液中洗涤膜五次（每次15分钟）。
对于W 酯化印迹检测，根据制造商的说明将膜与检测试剂一起孵育（足够量以覆盖膜）。不同组分的W 酯化印迹分析和代表性W 酯化印迹的图形摘要如图2所示。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902908--1430 Christine Pierrot 804729 \ Figs jpg \ fig2.jpg

2.汇总馏分的W Estern印迹分析摘要。馏分名称用灰色框表示，并参考图1中所示的馏分。这些灰框下方显示了W Estern印迹分析摘要。黑体是主要信号观察到，灰色是检测到的其他抗原（低信号和/或无法系统获得），而透彻性状是未检测到的抗原。分别使用抗人PP1c和抗小鼠TER119检测宿主PP1和TER119（请注意，标记为“ TER119”的条带上方的条带可能是由于该蛋白与其他红细胞表面蛋白相互作用的能力所导致的复合物（Kina 等，2000 ），使用抗-P检测到了寄生虫EXP2，HSP70和醛缩酶。 .yoelii EXP2，抗恶性疟原虫HSP70和抗P. 疟原虫醛缩酶（参见表1）.Panels A，B和C显示代表W¯¯ 西部时代印迹宿主特异性的（A）或寄生虫特有的（B的分析， C）蛋白质。e这些W 酯化印迹不是定量的，并且B和C之间醛缩酶信号的强度差异可能对应于不同量的总提取物上样。

注意小号

由于我们最初的研究目标是研究输出到宿主细胞中的寄生虫蛋白，因此我们专注于改善宿主细胞与感染红细胞中寄生虫元素的分离，这意味着我们没有改进PV的顺序裂解/寄生虫区室（使用针对EXP2，Aldolase和HSP70的抗体在寄生虫细胞质和PV /寄生虫膜之间没有区别），然而，涉及使用生物素衍生物的优雅技术允许在分离PV和红细胞膜之前OMIC方法的研究（Nyalwidhe 和Lingelbach ，2006; Ravenhill 等人，2019）。我们的协议与这些技术的结合为在破红细胞周期内破译宿主/病原体相互作用的来龙去脉提供了新的视角寄主和寄生虫侧均存在疟原虫。

菜谱

60％Nycodenz 解决方案
Nycodenz 缓冲介质

5 mM Tris HCl，pH 7.5

3毫米氯化钾

0.3毫米CaNa 2· EDTA

Nycodenz 股票解决方案

将27.6 g固体Nycodenz 溶于60 ml缓冲液中，并用该介质补足至100 ml [ 密度（20°C）1.15 g / ml ]
高压灭菌并在4°C下储存
60％Nycodenz 溶液（新鲜配制）

将2毫升1x PBS加入3毫升Nycodenz 储备溶液中

Equinatoxin II（EQT）裂解缓冲液（需新鲜制备）
20 mM Tris pH 7.4

130毫米氯化钠

1毫米MgSO 4

6 µg / ml EQT

皂素裂解液
皂素10倍原液

将0.7 g皂苷溶于100 ml 1x PBS中;在4 °C下储存

1x皂素裂解液（需新鲜制备）

将1体积的皂苷原液与9体积的1x PBS混合

Triton裂解缓冲液（需新鲜制备）
50 mM Tris pH 7.4

100毫米氯化钠

1％的Triton X-100

0.5毫米EDTA

罗氏cOmplete TM 不含EDTA的抗蛋白酶混合物

0.2 U / ml的DN 一个SE，在冰上直到使用存储

Percoll 渐变层
90％Percoll 储备溶液

将45 ml Percoll 与5 ml 10x PBS混合

80％Percoll 层

将0.5 g D-山梨糖醇与8.9 ml 90％Percoll 储备液和1.1 ml RPMI混合

70％Percoll 层

将0.5 g D-山梨糖醇与7.8 ml 90％Percoll 储备溶液和2.2 ml RPMI混合

60％Percoll 层

将0.5 g D-山梨糖醇与6.7 ml 90％Percoll 储备液和3.3 ml RPMI混合

40％Percoll 层

将0.5 g D-山梨糖醇与4.4 ml 90％Percoll 储备液和5.6 ml RPMI混合

过滤所有溶液（0.22 µm）并储存在4°C

3x样品缓冲液（可在-20 °C 长时间保存-在室温融化以使用）
150 mM Tris pH 6.5

SDS 7.5％

15％β- 巯基乙醇

30％甘油

0.25％溴酚蓝

运行缓冲液（在4°C下存储了几周）
3.03克Tris Base

14.41克甘氨酸

5毫升SDS 20％

将H 2 O加到1 L

转移缓冲液（在4°C下存储了几周）
2.42克Tris Base

11.26克甘氨酸

200毫升乙醇

将H 2 O加到1 L

封闭液（在封闭前重新制备）
1x PBS中的5％低脂牛奶

Western blot洗涤缓冲液（在4°C下保存几周）
％0.4 Ť 在1×PBS吐温-20

致谢

这项工作是支持通过Üniversite电德里尔，CNRS，INSERM 和研究所巴斯德德里尔。这项工作是基于协议最初发表科研报告（Gnangnon 等，2019），作者要感谢医生。贾马尔Khalife的为关键阅读手稿。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

实验按照欧洲共同体理事会提出的建议（86/609 / EEC）动物experimentations.All动物程序被批准的原则进行，并监督当地伦理委员会的动物（CEEA-75 科米特D'Ethique EN 实验安尼米尔，法国北加莱（Nord-Pas de Calais）。有关小鼠操作规程和程序的道德批准编号为APAFIS＃18905-2019020111166978v2。

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