材料和试剂

（可选）保暖袋
取样管无菌（吨他体积大小不应该从1.5米BE在0.2 升）（例如，0.2米升管，生物碧，目录号的：133003 1.5 米升管，VIOLAMO ，目录号的：1-1600-1）
35mm培养皿（例如，IWAKI，目录号：1000-035）
不含酚红的DMEM（Sigma-Aldrich，目录号：D2902）
DMEM（Nacalai ，目录号：08456-94）
尽管可以使用其他供应商提供的DMEM替代这些DMEM，但不能排除次要成分的浓度差异会影响成功率和结果的可能性。

碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8761）
HEPES（Nacalai ，目录号：17557-94）
D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8769）
青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，目录号：15070-063）
L- 谷氨酰胺（Nacalai ，目录号：16948-04）
丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8636）
萤光素（WAKO，货号：126-05116）
矽胶（信越（Shin-Etsu），目录号：KS-64）
注意：试剂＃6 -1 3 ：其他供应商的类似物品代替。

携带萤光素酶（腺病毒载体LUC ）基因通过昼夜启动子驱动/增强子元件（例如，BMAL1-LUC ，Per2基因-luc的和的Per3-luc的），我们构建和沉积。有的进入载体可从RIKEN银行如下：
小鼠RDB15083 Period2 （-2.8〜Tasu0.1 Kb）- 荧光素酶/ PENTR-1A

人RDB15084 Period3 （-3.1〜Tasu0.2 Kb）- 荧光素酶/ PENTR-1A

人RDB15085 Bmal1 （-1.7〜Tasu0.1 Kb）- 荧光素酶/ PENTR-1A

需要使用ViraPower 腺病毒网关表达试剂盒（K4940-00，Thermo Fisher Scientific）才能使用这些进入载体生成腺病毒，必须在P2区域内进行使用腺病毒的程序高压灭菌并丢弃任何传染性废物。

感染介质（请参见食谱）
预培养培养基（请参见食谱）
冲洗介质（请参阅食谱）
含萤光素的培养基（请参见食谱）

设备

防滑，COS metic使用镊子（例如，资生堂，眉钳211）
镊子（例如，FST，目录号：18132-12）
块培养箱设置为36.5°C（例如，ASTEC，型号：BI-516C）
层流室中（例如，三洋，型号：MCV-B131F）
注意：设备1-4：其他供应商的类似物品可以替代。

在35-36.5°C和5％CO 2的培养箱中（例如，ASTEC，型号：SCA-165DRS）
使用CO 2 培养箱，该培养箱应安装一个不受箱内湿度影响的红外传感器（请参阅步骤18中的详细信息）。

光电倍增管（滨松，型号：LM2400）
发光显微镜（奥林巴斯，型号：LV200）
小号oftware

Cosinor 软件（可从网站免费下载：https : //www.circadian.org/softwar.html）。

程序

体外人类毛囊的文化研究节律基因expressio ñ ：

人体研究必须按照《赫尔辛基宣言》进行并得到机构审查委员会的批准。
招募受试者并获得每个受试者或受试者家庭的知情同意。
（可选）尽管取决于研究目标，但可能会要求志愿者遵循既定的计划安排一到几周的时间，例如，可以根据每个志愿者的生活习惯来设置起床时间和进餐时间，或者问从消耗过量的醇和小吃和采取长小睡不要。个别chronotypes可以使用评估克清晨型-eveningness 问卷（MEQ）或慕尼黑chronotype问卷（MCTQ ）（Zavada 等人。，2005）。
通过将含有由昼夜节律启动子/ 增强子元件驱动的荧光素酶基因的腺病毒以1:20的稀释度添加到新鲜的DMEM中来制备感染培养基（请参见食谱），我们的腺病毒原液的滴度在1.24 x 10 9 -1.47 范围内×10 9 感染单位/ M 大号。使用腺病毒载体携带的Per3吕克可能被推荐（小号的Ee 下面的N 大手这个原因）。载体构建，我们使用的ViraPower 腺病毒网关表达试剂盒（山口等。，2017）。简而言之，将时钟基因的转录调节区域与萤光素酶基因一起亚克隆到pENTR-1A进入载体中，然后通过LR重组引入pAd / PL-DEST载体中。
注意：我们之前比较了三种携带Bmal1-luc，Per2-luc和Per3-luc的腺病毒载体的周期长度，稳健性和标准差（SD）（Yamaguchi et al。，2017），尽管平均周期长度几乎相同这三个载体的Per3的周期长度的SD始终小于其他载体，另外，Per3的周期长度在最小的SD值时最稳健，因此我们优选使用携带Per3-luc的腺病毒载体我们的实验条件。

在对毛囊进行采样之前，请准备一个无菌采样管，其中应包含80 Myu L 的预培养培养基，冲洗培养基或感染培养基（每种培养基的成分请参见配方），每个毛囊需要一根包含相应培养基的试管。并使用分块培养箱将培养基保持在36.5°C。
（可选）在寒冷的冬季，通过在颈部的两侧安装口袋加热器来加热颈动脉可以提高毛囊采样的成功率。
如图1所示，用防滑镊子（美容用）牢固地握住并拉动根部的单根头发，收集几根头皮（或面部）头发。为避免干燥导致的毛囊细胞死亡，请快速浸泡将毛囊细胞放入未预热的预温育培养基中，不移开发干，将样品保持在36.5°C直至下一步（感染：步骤11）。尽管收集头发不一定需要无菌环境，但步骤11 之后的程序建议在无菌条件下进行。

1图。收集绞股Ø ˚F头皮。A.紧握并使用防滑镊子取出每个股的头发逐根。B. 用弹拨毛发的根表面大部分或完全覆盖着毛囊细胞。C.将毛囊细胞快速浸入预热的预温育培养基中，而无需去除毛干。

剪掉发干，留下约10至20毫米。
为了获得强的生物发光信号，请使用拔毛的头皮（或面部）毛，其根表面大部分或完全被毛囊细胞覆盖。代表性图像显示成功携带Per2-luc 的腺病毒感染到大部分被毛囊覆盖的发根上细胞在我们的原始论文中显示（图1B，Yamaguchi 等人，2017）。我们之前研究了毛发阶段的差异对昼夜节律周期长度的影响，发现阶段之间的周期长度没有显着差异（Yamaguchi 等人，2017）。）。
（可选）在实验室外采样的情况下，将样品运输到实验室时应将样品放在不带CO 2 的保暖袋中。我们确认，运输时间长达10小时对昼夜周期长度没有明显影响时钟基因表达。
在层流柜内，使用消毒镊子拾起发干，将毛囊浸入预热的漂洗介质中，然后将毛囊转移并完全浸入块温箱（36.5°C）的预热感染介质中。使用腺病毒的程序必须在P2区域内进行。高压灭菌并丢弃任何传染性废物。
关闭管盖，在36.5°C和5％CO 2 下孵育24小时。
第二天，为制备含预温冲洗介质的无菌取样管（在36.5℃）的祛瘀的人viruses.Two 管所必需的洗涤两次。
注射器并将硅酮推入35毫米培养皿底部的土墩中（图2和视频1）。将硅酮稍微偏心放置，以利于将毛囊定位在培养皿的中央，因为这可以缩短毛囊之间的距离PMT表面和受感染的细胞会增加生物发光计数。每个毛囊只能使用一碟。有机硅的灭菌不是必不可少的，但是我们建议使用未开封包装中指定用于培养的有机硅。此外，准备并预热含萤光素的培养基（参见浓度为0.1 mM 的每种培养基的配方。

视频1.在培养皿底部的土堆中放置有机硅

使用无菌镊子通过杆柄拾起头发并转移毛囊感染了 80 兆升的预热冲洗液，孵育一分钟后再次转移将感染的毛囊放入相同体积的新鲜漂洗介质中，并孵育相同的时间，以尽可能完全地去除腺病毒。
将毛囊转移到35毫米培养皿中的硅土堆中以进行生物发光监测（视频2）。为避免在测量过程中漂浮，请将发干推入硅树脂中，以便将发干棒固定在硅树脂上并固定在底部将毛囊放置在靠近培养皿中心的位置，以进行有效的生物发光检测。

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视频2 Transfe [R 环毛囊硅丘

COMPLE Tely盖固定化毛囊随着2-3米大号预热荧光素物的培养基。

图2 。Fixin G A毛囊底部培养皿。A.转移的毛囊硅土墩在35毫米的培养皿中。按发干到硅，从而轴粘在有机硅和被B.将毛囊放置在靠近盘子中央的位置。

如图3所示，measu 重新生物发光实时- 时间使用特别设计，以减少背景噪声，以检测超弱光子发射（LM2400，滨松，日本）暗箱内的光电倍增管或用于单细胞优化的发光显微镜在5％CO 2 下于35°C进行成像（日本奥林巴斯）。为避免生锈，LM2400位于低湿度条件下的CO 2 培养箱内。为了防止培养基变干，请不要用水从CO托盘2 培养箱中，使用LM2400.Use内的一个在CO 2 孵化器中提取未受到chamber.For测量内部湿度的红外线传感器，打开LM2400的顶部和简单地地方培养皿金属托盘：无毛囊的培养皿每分钟读数应为5,000-10,000 （背景对照）。成功的情况下，毛囊的生物发光应大于背景计数和超过四到五天的昼夜节律振荡。

图3 。监测生物发光的实时性。生物发光，可以实时测量使用光电倍增管（顶三面围板，LM2400）或荧光显微镜优化了对单细胞成像（底三面围板，LV200）35至36.5℃ 5％的CO 2。左面板，仪器的视角；中间面板，样品架的视角；右面板，样品架上的培养皿的视角。

数据分析

使用关联的软件“用于光子检测单元的软件C10749（LM2400v21）-JP”执行数据收集，要分析昼夜节律参数，需要删除基线变化，如图4所示，因此使用Microsoft Excel对数据集进行去趋势处理，方法是减去在24 h的速度行驶从原始数据平均值（A，原始数据; B，去趋势数据）。昼夜鲁棒性，昼夜节律阶段（角度）和昼夜周期长度是使用计算余弦软件，如由博士馈赠提供Refinetti .Oscillation 数据不仅在昼夜节律振荡持续≥4天时，而且在昼夜节律鲁棒性为70％或更高时，都被认为是可靠且有用的。

4图。实施例数据。数据集去趋势通过减去24 H运行平均从原始的DAT A A。。原始数据（软件，光子检测单元C10749（LM2400v21 -jP））; B 。除趋势数据（软件，Microsoft Excel中）。

笔记

尽管培养的毛囊中昼夜节律周期长度的绝对值与生理和行为研究获得的值不同，但我们证实了小鼠基因型的周期长度的相对差异在毛囊中的时钟基因表达与运动能力之间是相似的（Yamaguchi et al。等人，2017）。因此，我们的离体方法可能是估计体内昼夜节律特征的有用工具。
据报道，培养基的组成会影响周期的长短（Lee 等，2011; Noguchi 等，2012），例如，我们发现酚红的缺失会导致阻尼和较长的周期（Yamaguchi 等，2017）。因此，在所有实验组中使用相同的培养基成分和产品批号对于比较受试者之间的相对差异非常重要。
地塞米松（DEX）是外围时钟的著名同步器，在DEX处理后，通常在体外和离体监测外围时钟基因的表达，但是，腺病毒感染也可以同步时钟基因的表达，从而简化了实验方案并减轻了细胞压力因此，当使用腺病毒感染的毛囊时，排除DEX治疗。

菜谱

中度感染（每个毛囊80 Myu L 或更多）
DMEM（日本Nacalai ）

1％青霉素/链霉素

5％腺病毒

中温孵化（每个毛囊80 Myu L 或更多）
不含酚红的DMEM（Sigma-Aldrich）

0.035％碳酸氢钠

10毫米HEPES

4.5克/ 升D-葡萄糖

1％青霉素/链霉素

1 毫米L- 谷氨酰胺

1 mM丙酮酸钠

中度漂洗（每次洗涤80 Myu L 或更多）
DMEM（日本Nacalai ）

1％青霉素/链霉素

含萤光素的培养基（2-3 毫升升的毛囊）
DMEM（日本Nacalai ）

1％青霉素/链霉素

0.1 mM萤光素

致谢

我们感谢山口爱依（Ai Yamaguchi），冈本明彦（Akihiko Okamot O），松村梨子（Ritsuko Matsumura），佐藤美穗（Miho Sato），冈上理惠（Rie Okamitsu）和纯野纯子（Junko Sumino）的专业技术援助，并感谢山口老年医学研究所，赤田医学研究基金会，SENSHIN Me Dical的研究金支持。研究基金会和日本科学促进协会，作者宣称没有竞争的经济利益，该协议最初是由Yamaguchi 等人于2017年开发的。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或利益冲突。

伦理

这项研究是根据赫尔辛基宣言进行，并批准了山口大学的机构审查委员会（批准numbe [R ：H25-81-4）.Informed 所有受试者均获得同意。

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