材料和试剂

培养瓶（1 ，000毫升）（VWR，目录号：29136-106）
封口膜（Sigma-Aldrich，目录号：BR701605）
FISHERBRAND TM 再生纤维素透析管（6 ，000-8 ，000 d ）（Fisher Scientific公司，目录号：21-152-4）
Slide-A-Lyzer TM MINI透析仪，7K MWCO，0.1 ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：69560）
玻璃经济柱（伯乐，目录号：7374156）
Amicon Ultra-15离心过滤器单元，3kDa（Millipore Sigma，目录号：UFC900324）
Amicon Ultra-15离心过滤器单元，10kDa（Millipore Sigma，目录号：UFC901024）
Amicon Ultra-15离心过滤器单元，50kDa（Millipore Sigma，目录号：UFC905024）
E. 大肠杆菌BL21 DE3 pLysS细胞（赛默飞世尔科技，产品目录号：C602003）
pET-3a质粒（Sigma - Aldrich，目录号：69418）
pET-22b质粒（Sigma - Aldrich，目录号：69744）
pGEX-4T3质粒（GE Healthcare，目录号：28954552）
氨苄西林（Goldbio，目录号：A-301-5）
快速入门布拉德福德蛋白质测定试剂盒（Bio- R ad，目录号：5000201）
氯霉素（Goldbio，目录号：C-105-5）
完全，无EDTA的蛋白酶抑制剂（Sigma - Aldrich，目录号：11873580001）
腺苷5 ' 三磷酸二钠盐水合物（西格玛- Aldrich公司，目录号：A26209）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma - Aldrich，目录号：276855）
DTT（RPI，目录号：D110000-25.0）
EDTA（RPI，目录号：E57020-500.0）
甘油（Fisher，货号：633-4）
胰蛋白（（Sigma-Aldrich，目录号：T7293）
Tris HCl pH 7.5 （Sigma-Aldrich，目录号：T5941）
β- 巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
醋酸钾（Sigma-Aldrich，目录号：P1190）
醋酸镁（Sigma-Aldrich，目录号：M5661）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I5513）
鸟苷5'-三磷酸钠（Sigma - Aldrich，目录号：G8877 ）
谷胱甘肽琼脂糖4B（GE Healthcare，目录号：17075601）
盐酸胍（RPI，目录号： G49000-100 ）
HEPES （RPI，目录号：H75030-500.0 ）
IPTG（黄金生物技术，目录号：I24816100）
氯化镁（MgCl 2 ）（Sig ma - Aldrich，目录号：M8266）
Ni-NTA琼脂糖（Qiagen，目录号：30320）
醋酸钠（Sigma - Aldrich，目录号：S8750）
氯化物钠È （氯化钠）（RPI，目录号：S23020-5000.0 ）
TCEP（黄金生物技术，目录号：TCEP25）
Tris羟甲基氨基甲烷（RPI，目录号：T60040-5000.0）
的Triton X - 100（Sigma公司- Aldrich公司，目录号：T878 - 100ML）
尿素（RPI，货号：U20200）
β-巯基乙醇（Sigma - Aldrich，目录号：M6250）
酵母提取物（Sigma - Aldrich，目录号：Y1625）
LB介质（1 L）（请参阅食谱）
2x YPT介质（1 L）（请参阅食谱）
清洗缓冲液（请参阅配方）
展开缓冲区（请参见食谱）
重新折叠缓冲区（请参见食谱）
醋酸钠尿素缓冲液200（SAU 200）（请参阅食谱）
醋酸钠尿素缓冲液600（SAU 600）（请参阅配方）
AUC缓冲区（请参阅食谱）
Imp9裂解缓冲液（请参阅食谱）
Imp9清洗缓冲液（请参阅配方）
氯化钠Q缓冲液（请参阅食谱）
Imp9-SEC缓冲区（请参阅食谱）
溶血缓冲液（请参见配方）
冲洗缓冲液（请参见食谱）
Ran洗脱缓冲液（请参见配方）
氯化钠SP缓冲液（请参阅配方）
跑GTP 交换缓冲区（请参阅食谱）

设备

Q-500声波发生器（Q Sonica，目录号：Q500-110）
Emulsiflex– C5细胞匀浆器（Avestin，目录号：Emulsiflex C5）
Oakridge管– 50 ml管（Thermo Fisher Scientific，目录号：3119-0050）
AKTA pure（色谱系统）（GE Healthcare，目录号：29046665）
HiTrap Q HP（GE Healthcare，目录号：17115301）
HiTrap SP HP（GE Healthcare，目录号：17115201）
Superdex 200增加10/300 GL（GE Healthcare，目录号：28990944）
NanoDrop（Thermo Fisher Scientific，目录号：ND-2000C）
冻干机（Labconco，目录号：7740020）
阿凡提J-301高性能离心机（贝克曼Ç oulter，目录号：363118）
JA-20贝克曼转子（贝克曼C oulter，目录号334831）
八孔An-50Ti转子（Beckman C oulter，目录号：363782）
AUC（分析型超速离心机）核心组件，包括木炭填充的Epon中心焦点，蓝宝石窗口，aluminu 米外壳，和填充端口插头（贝克曼Ç oulter，目录号：A37299）
Beckman-Coulter Optima XL-1分析超速离心机（AUC）（Beckman C oulter，目录号：B86437 ）

软件

SEDNTERP 1（http://www.jphilo.mailway.com/download.htm）
SEDFIT（http://www.analytical.ultracentrifugation.com）
REDATE（http://biophysics.swmed.edu/MBR/software.html）
GUSSI（http://biophysics.swmed.edu/MBR/software.html）

程序

注意：组蛋白纯化和H 2A-H2B复杂组装方案改编自先前公布的方案（Luger等，1997 b和1999 ）。该协议已进行了略微更改，以适应当前实验的要求。Ť 他的协议描述的方法进行Imp9分析- H2A-H2B复合物，可用于研究不仅其他输入蛋白–组蛋白复合物，还有各种组蛋白伴侣复合物。该协议的流程图如图1所示。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902971--1384 Abhilash Padavannil 755428 \ Figs jpg \图1.jpg

图1.气流C HART描绘各种步骤小号蛋白纯化和分析的一升超速离心

组蛋白H2A / H2B的表达
变换E. 大肠杆菌BL21 DE3 plysS中与组蛋白表达质粒的细胞（含有PET-3A H2A / H2B基因）和板对2X YPT琼脂含有合适的抗生素（氨苄青霉素和氯霉素）的板。在37孵育 ℃下过夜（12-15 1H）。新鲜转化将确保更好的蛋白质表达。
挑选单个菌落，并在含有适当抗生素的2x YPT培养基中开始3-5 ml预培养。将它们在37 °C下生长过夜。
在100 ml 混浊的预培养物中接种100 ml 2x YPT培养基的抗生素，并孵育直至OD达到0.4-0.5。
用来自步骤A3的培养物均匀接种六种含有抗生素的1 L 2x YPT培养基，并在37°C下生长直至OD达到0.4-0.5，并在37°C下用250μMIPTG诱导4 h。
4之后小时，在4收获细胞，通过离心，000 X 克20分钟，在4 ℃。
将细胞沉淀重悬于35 ml / L的洗涤缓冲液（细胞培养液）中。
闪冻在液氮中，存储中的细胞悬浮液在- 80℃。将冷冻的细胞悬浮液可在贮存一周- 80℃。

从包涵体纯化组蛋白
在室温（25 °C）下解冻细胞悬液，然后将装有细胞悬液的试管放入冰杯中，并在其中放置超声探头。
将超声仪设置为脉冲模式（1秒钟打开和1秒钟关闭）。在50％振幅下以脉冲模式溶解细胞3分钟，重复3-4次或直到细胞悬液变粘稠为止。脉冲模式和烧杯有助于防止样品过热。
将裂解液转移到Oakridge管中，并在4 °C下以25,000 xg 旋转20分钟。弃去上清液，并用35 ml / L（细胞培养物）含有1％（v / v）Triton X-100的洗涤缓冲液重悬沉淀。
在4 °C下以25,000 xg 旋转20分钟。丢弃洗涤缓冲液。
用不含Triton X-100的洗涤缓冲液重复上述洗涤两次。旋转后丢弃洗涤缓冲液（在4 °C下25,000 xg，持续20分钟）。收集最后的沉淀。沉淀包含蛋白质（H2A / H2B）包涵体。
包涵体沉淀可以储存在- 20 ℃下一周。
首先在室温下解冻包涵体沉淀，方法是将沉淀溶解在1ml的二甲基亚砜（DMSO）中，然后将其充分悬浮在20 ml的展开缓冲液中。在室温下将其在摇杆上轻轻孵育（10-15 rpm）30分钟。
在4 °C下以25,000 xg 旋转悬浮液20分钟，以去除所有颗粒。
将上一步骤中的上清液小心地转移至透析管（截止6-8 kDa）。
在SAU-200（4 x 1 L）中将样品透析过夜，在前三轮中每小时更换一次缓冲液，而在最后一轮中过夜。所有透析步骤均在4 °C下进行。
小心地将渗析的样品转移到Oakridge管中，并在2 ° x 25,000 x g 下在4 °C 下旋转20分钟，以除去所有颗粒。
将HiTrap SP HP（阳离子交换色谱）色谱柱连接到FPLC系统（纯AKTA），并用SAU-200平衡。设置FPLC程序以进样并在10倍柱体积和40％SAU 600（60％SAU 200）中运行从0％SAU 600（100％SAU 200）到40％SAU 600（60 ％SAU 200）的逐步梯度）至10柱体积的100％SAU 600（0 ％SAU 20 0）。SAU200和SAU600各自200毫升应足以在5 毫升HiTrap SP HP色谱柱中形成阶梯梯度。
将透析后的样品注入用SAU-200预平衡的HiTrap SP HP色谱柱中。
洗脱组蛋白结合到使用在步骤梯度设置的SP的HiTrap HP柱小号TEP B12。
H2A / H2B的洗脱浓度约为SAU 600的38-42％。汇集HiTrap SP HP色谱柱的峰馏分，小心地转移至透析管（截止6-8 kDa），并在冰冷的水中透析（水+ 5 mMβ-巯基乙醇）过夜（4×4 L），在前三轮中每小时更换一次水，并在最后一轮中过夜。
通过使用NanoDrop 测量在280 nm处对水的吸光度并应用比尔定律中已知的消光系数和光程长度，确定透析样品中组蛋白的浓度，然后将透析后的样品分装到冷冻管中，每份等分试样的总蛋白量约为1 mg。可以使用实验原型工具（http://ca.expasy.org/tools/protparam.html）获得理论上的摩尔消光系数。
准备一个有干冰的冰柜，然后装满冰冷的乙醇。
从转移的冷冻管小号TEP B16到冰箱闪烁冻结。
取下冷冻管的盖子，用封堵膜密封并穿刺封堵膜。
打开冻干机并关闭镇流器。等待真空访问< 100 MT和冷凝器温度至- 40 ℃。
将样品装入冻干瓶。打开真空阀，使其运行一整夜。
运行后，关闭真空并取出样品。取下封口膜并盖上盖子。
商店在- 80 ℃，直至准备组装复杂。冻干可将组蛋白的保存期限延长数月。

组蛋白二聚体H2A-H2B复合体
将冻干的组蛋白等分试样溶解在展开缓冲液中，使其浓度约为2 mg / ml，并在室温下孵育至少30分钟但不超过一小时。通过使用NanoDrop测量针对展开缓冲液在280 nm处的吸光度并应用比尔定律中已知的消光系数和光程长度，确定展开的组蛋白的浓度。
混合重悬的H2A和H2B等摩尔混合物，并在展开缓冲液中将其稀释至1 mg / ml，然后在室温摇床上以10-15 rpm孵育1小时。
在4 °C下以25,000 xg 离心样品10分钟，以除去所有沉淀物，并将上清液转移至透析管（截止6-8 kDa）。
在重新折叠的缓冲液中于4 °C 过夜透析，在前三轮中每小时更换缓冲液至少四次（4×2 L），最后一轮过夜。
在4 °C下以25,000 xg 离心透析的样品10分钟，以去除任何颗粒，然后在10 kDa Amicon离心浓缩器中将样品浓缩至适当的进样量（建议每次进样最大量为0.5 ml 10 mg总蛋白以获得在S200 Superdex增加色谱柱上的良好分离度）。
将样品注入Superdex S200增加柱中，并用重折叠缓冲液预平衡。H2A-H2B二聚体在24 ml Superdex S200增大柱中以大约16.5 ml的洗脱体积洗脱。
合并峰级分，在10 kDa Amicon离心浓缩器中浓缩至约10 mg / ml。
分装成100 μ升等分试样，闪存冻结并将其存储在-80 ℃。

Imp9的表达
变换E. 大肠杆菌BL21 DE3细胞用GST- Imp9表达质粒（改性的pGEX-4T3（凝血酶位与TEV取代蛋白酶切割位点[ Chook和布洛贝尔，1999 ] ）含有Imp9 基因）（Padavannil 等人，2019）和板上含有氨苄青霉素的LB琼脂平板。在37 °C下孵育过夜。新鲜转化将确保更好的蛋白质表达。
挑选单个菌落，并在含有氨苄青霉素的LB培养基中开始3-5 ml预培养。将它们在37 °C下生长过夜。
用0.5-1 ml混浊的预培养物向100 ml LB培养基中加入氨苄青霉素，并孵育直至OD达到0.4-0.5。
用来自步骤D3的培养物均匀接种4 x 1 L 含氨苄青霉素的LB培养基，并在37°C下生长直至OD达到0.6，然后在20°C下用500μMIPTG诱导12 h。
收获通过离心将细胞在4 ，000 X 克20 分钟，4 ℃。

Imp9的纯化
将收获的细胞悬浮在Imp9裂解缓冲液中。
用Emulsiflex– C5细胞匀浆器裂解细胞。
将裂解物转移到Oakridge管中，并在40,000 x g 下于4°C 旋转30分钟，并收集上清液。
设置了在冷室（4玻璃Econo柱柱重力流动℃）和平衡1.5毫升（每1 升ITER细胞培养物）的谷胱甘肽琼脂糖4B树脂与Imp9裂解缓冲液中。
从S tep E4 洗脱平衡裂解缓冲液，并添加S tep E3 的上清液。通过重力流使上清液通过树脂几次。
用Imp9洗涤缓冲液洗涤GST –Imp9结合的树脂两次。
用Imp9-ATP洗涤缓冲液洗涤GST –Imp9结合的树脂一次（Imp9-ATP洗涤缓冲液是含5 mM ATP的裂解缓冲液）。
用附加的Imp9洗涤缓冲液洗涤与GST –Imp9结合的树脂。
检查珠子上融合蛋白的浓度（使用Bradford试剂进行粗略估计即可），以确定要添加的TEV蛋白酶的量。
上通过温育柱劈裂GST标签GST- Imp9结合的树脂与TEV蛋白酶含有IM9洗涤，在4缓冲液过夜℃（一个DD100μl的TEV蛋白酶（100μM）对每50毫克融合蛋白的）。轻轻混合一次并在4 °C 下孵育。加入TEV蛋白酶后，请勿摇动色谱柱。
从列中洗脱Imp9。GST标签保持与树脂的结合。
将HiTrap Q HP（阴离子交换色谱）色谱柱连接至FPLC系统（纯AKTA），并用100 mM 的氯化钠Q缓冲液平衡。设置一个Ñ FPLC程序注入样品和从100％运行的线性梯度的100mM 小号裂果氯化物Q-缓冲至100％1 中号小号在20个柱体积裂果氯化物Q-缓冲。每个缓冲液150 ml应该足以在5 ml HiTrap Q HP色谱柱中形成线性梯度。
注入Imp9从小号TEP E11到的HiTrap Q HP柱预平衡用100mM 小号裂果氯化物Q缓冲器。
使用100％100 mM s 氯化钠Q缓冲液到100％1 M s 氯化钠Q缓冲液的设定线性梯度从色谱柱上洗脱蛋白质（Imp9以大约22％B [ 78％A和22％B ] 洗脱峰非常明显，并且峰内的分数合并在一起。
合并含Imp9的馏分，并使用50 kDa Amicon离心浓缩器将蛋白质浓缩至合适的进样量（建议每次进样最大装载0.5 ml 10 mg总蛋白，以在S200 Superdex增加柱上获得良好的分离度）。
将蛋白从S tep E15 注入用大小排阻缓冲液（Imp9-SEC缓冲液）预先平衡的n S200 Superdex增加柱中。Imp9 在24 ml色谱柱中以大约13 ml 的洗脱体积洗脱。
收集色谱柱中的峰级分，并使用50 kDa Amicon离心浓缩仪将蛋白质浓缩至所需浓度（Imp9可以浓缩至20 mg / ml。浓缩的样品可以在液氮中快速冷冻并在-80 °C下保存C，直到可以使用为止）。

Ran [ 酵母Gsp1（1-179，Q71L ）]的表达
变换E. 大肠杆菌BL21 DE3细胞用冉[ GSP1（1-179，Q71L）] 表达质粒（含酵母冉的pET-22b的[ GSP1 （1-179，Q71L）基因] 和板在LB琼脂含有氨苄青霉素平板上。在温育37 °C过夜，新鲜转化可确保更好的蛋白质表达。
挑选单个菌落，并在含有氨苄青霉素的LB培养基中开始3-5 ml预培养。将它们在37 °C下生长过夜。
用0.5-1 ml混浊的预培养物向100 ml LB培养基中加入氨苄青霉素，并孵育直至OD达到0.4-0.5。
用来自步骤F3的培养物均匀接种4 x 1升含氨苄青霉素的LB培养基，并在37°C下生长直至OD达到0.6，然后在20°C下用300μMIPTG诱导12 h。Ran表示为Ran–His 6 。在纯化过程中，His 6 标签没有被切割。
收获通过离心将细胞在4 ，000 X 克20 分钟，4 ℃。

Ran的纯化和GTP负载
将收集的细胞悬浮在Ran裂解缓冲液中。
用Emulsiflex– C5细胞匀浆器裂解细胞。
将裂解物转移到Oakridge管中，并在40,000 x g 下于4°C 旋转30分钟，并收集上清液。
设置了在冷室（4玻璃Econo柱柱重力流动℃）和平衡1.5毫升（每1 升ITER细胞培养物）的Ni-NTA琼脂糖以冉裂解缓冲树脂。
从S tep G4 洗脱平衡裂解缓冲液，并添加S tep G3 的上清液。通过重力流使上清液通过树脂几次。
用Ran洗涤缓冲液洗涤Ran结合的树脂两次。
用Ran洗脱缓冲液从色谱柱上洗脱Ran。
通过在冰上与40 mM GTP（最终浓度）一起孵育30分钟，将洗脱的Ran装载GTP（从100 mM GTP储备溶液中添加GTP至所需浓度）。
将HiTrap SP HP（阳离子交换色谱）色谱柱连接到FPLC系统（纯AKTA），并用50 mM 的氯化钠SP缓冲液平衡。设置n FPLC程序以进样，并在20倍柱体积中从100％50 mM s 氯化钠SP缓冲液到100％1 M s 氯化钠SP缓冲液运行线性梯度。每个缓冲液150 ml应该足以在5 ml HiTrap SP HP色谱柱中形成线性梯度。
将载有GTP的Ran注入预先平衡的HiTrap SP HP色谱柱。
使用100％的50 mM s 氯化钠SP缓冲液到100％1 M s 氯化钠SP缓冲液的设定线性梯度洗脱蛋白质[ Ran以40％SP缓冲液B（40％B和60％A）洗脱峰非常明显，峰内的馏分汇集在一起。
合并含有Ran-GTP的馏分，并使用3-kDa Amicon离心浓缩器将蛋白质浓缩至10 mg / ml 。等分试样浓缩的蛋白质至100μl等分试样并储存一吨-80℃ 。

AUC的样品制备
在1升1 M NaCl复性缓冲液（2 h），1升500 mM NaCl复性缓冲液（2 h）和2升AUC缓冲液（过夜）中于4°C 依次透析预组装的组蛋白。组蛋白二聚体倾向于在突然暴露于低盐下时解离和聚集。随时间顺序稀释有助于维持二聚体。组蛋白四聚体和组蛋白八聚体的行为可能相同，应进行类似处理。
在AUC缓冲液中于4 °C 过夜透析纯化的Imp9 。
在AUC缓冲液中于4 °C 透析纯化的Ran GTP 过夜。
将蛋白质（分别为H2A-H2B二聚体，Imp9和Ran GTP）注入Superdex S200增加柱中，并用AUC缓冲液预先平衡。从运行中保存AUC缓冲液以进行稀释并用作AUC中的参考缓冲液。
组蛋白二聚体（H2A-H2B）和Imp9在24 ml Superdex S200增加柱中的洗脱体积分别为16 ml和13 ml。Ran GTP在24 ml Superdex S200增加柱中以18 ml洗脱体积洗脱。合并峰级分，并使用Amicon离心过滤器将蛋白质浓缩至约10 mg / ml。这些蛋白质可以在-80 °C 下保存一周。还要在-80 °C 下存储用于运行Superdex S200色谱柱的AUC缓冲液，以避免任何缓冲液不匹配。

样品加载到AUC池
根据其摩尔消光系数，计算AUC运行所需的每种蛋白质的浓度。
混合透析样品至最终体积为450μl ，以进行沉降速度实验。1）450 微升单独Imp9（3 μ M），2）450 微升RanGTP单独（10 μ M），3）450 微升H2A-H2B（10 μ M），4）3 μ 中号Imp9 + 3 μ 中号RanGTP在450的总体积微升，5）3 μ 中号Imp9 3 μ 中号H2A-H2B在450的总体积微升，6）3 μ 中号Imp9 + 3 μ 中号H2A-H2B + 10 μ 中号RanGTP在总体积450 微升。在AUC运行前一天，将蛋白质在4 °C下孵育过夜，以确保复合物正确平衡。
组装标准的Epon填充中心配件（Balbo 等，2009）（图2）。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902971--1384 Abhilash Padavannil 755428 \ Figs jpg \图2.jpg

图2. Epon填充中心件的组装。（a）未组装的牢房。零件包括（A）窗衬，（B ）窗壳（已安装窗垫），（C）蓝宝石窗，（D）电池壳，（E）螺丝环，（F）螺丝环垫片，（G）中心件，（H）填充口塞和（I）填充口垫片。窗口衬垫放入窗口壳体，使得在所述衬垫的间隙为相应的壳体（在顶部看到的登记槽相反在此视图中两个壳体的。窗户是插件erted到窗口的壳体中。其中一个窗口是将电池盖正面朝上放置，然后插入中心件，然后插入第二个窗口（正面朝下），在该位置上，拧紧螺丝环垫圈，然后拧紧螺丝环，拧紧螺丝环的扭矩在120至140英寸·磅。该电池通过外部填充口填充有溶液，然后将填充口密封垫随后加料口塞是我nstalled。详细AR E在巴尔博等人。（2009）。（b）在填充从电池的“顶部”看，它是组装好的电池。

设置用于沉淀速度实验的Beckman-Coulter Optima XL-1分析型超速离心机（AUC）（Balbo et al。，2008）。
将450μl的样品装入样品扇区，并将450μl的参考缓冲液（AUC缓冲区）装入双扇区中心件的参考扇区，并将其放入八孔An-50Ti转子中。将转子置于离心机中，并在真空中于20 °C 孵育2.5 h 。在50开始离心，000转。
使用280 nm（A 280 ）的吸光度监控沉降。尽快收集扫描。如果没有所有沉淀迹象，则可以停止离心。

数据分析

下面详细介绍的数据分析方法的最终结果是c （s ）分布（Schuck ，2000年）。因此，结果采取二维分布的形式，物种的单一种群根据其相应的沉降系数呈现。较大的蛋白质或装配体将具有较大的沉降系数s。该方法基于将Lamm方程（Lamm ，1929）的解直接缩放为数据（a （r，t ））的概念。

其中r 是距旋转中心的半径（以厘米为单位），s 是沉降系数，t 是自离心开始以来的时间（以秒为单位），D 是平移扩散系数，L 表示拉姆方程。这样可以直接拟合AUC 数据。数据中的噪声会导致c （s ）分布中不切实际的高频波动，因此它按照Provencher （Provencher ，1982 ; Schuck ，2000 ; Schuck et al。，2002）讨论的思路进行了正则化。数据中的系统噪声元素可以很容易地被检测和去除，从而获得更高质量的拟合度（Schuck and Demeler ，1999）。分布中的沉降系数，再加上分析中精确的摩擦比，可用于确定物质和配合物的摩尔质量，但在后一种情况下，仅应在预期配合物存在的情况下使用这些质量。在整个SV实验中完全被占用，并且可以安全地假定精细的摩擦比代表复合物的摩擦比（即，大多数信号来自复合物，或者检测到的所有物质都具有相似的摩擦比）。

注意：作为文章的补充，提供了数据分析各个步骤的屏幕快照（图S1）。

沉降速度数据分析

使用SEDNTERP从缓冲液组合物中计算缓冲液密度和粘度。
使用SEDNTERP （Laue 等，1992 ）或SEDFIT （Zhao 等，2011）计算蛋白质的部分比容。
使用Schuck实验室（Zhao 等，2013）建议的算法，使用REDATE更改Beckman数据中的时间戳。
注意：REDATE可以选择为每个波长的数据采集创建文件夹。

启动SEDFIT
一个。选择“DAT 一→ 加载新文件”; 仅加载显示沉降迹象的数据扫描，即应排除没有沉降迹象的后期扫描。50-150次扫描就足够了，每次“第n次”扫描都可以加载以遵守此限制。

b。使用鼠标定义弯月面（红线），扇区底部（蓝线）和数据分析边界（绿线）的位置。

C。选择“模型→ 孔蒂nuous C（S）分配” （舒克，2000）。

d。选择“参数” ：

[R esolution 50/100
小号分钟0
ŝ 最大15/10
ř efine（激活全光照克相应的复选框） - 摩擦比（蛋白质1.2-2.0）
[R efine- 基线
c heck – 适合时间- 独立噪音
入住飞度RI ň 瓦兹只有分析干涉数据
提炼– 半月板
Ç onfidence级（F-比） - 设定在0.68进行1-Σ正规化。
我NPUT特定部分卷，溶液密度，并在其适当的位置的溶液粘度。
从主菜单中选择“运行”（即，优化所有线性参数）。
如果明显的数据/拟合不匹配，请调整参数。在此阶段最常见的问题是摩擦比和弯液面。重做运行，直到拟合线合理地类似于数据为止。
从主菜单中，选择“ Fit”（即迭代优化所有参数）。
评估合适的质量。均方根偏差（rmsd）应该低（通常小于0.01信号单位），并且在残差图中应证明最小的系统性。此阶段的值/外观差可能表示数据获取问题，湍流或对流，如果数据受到损害，则可能有必要重新做实验。默认的拟合选项是Simplex算法；将其更改为Marquardt Levenbe rg（“选项→拟合选项→ Marquardt Levenberg”），记下rmsd值，然后再次拟合数据。继续在Simplex和Marquardt Levenberg之间交替，直到rmsd值在拟合后不再改变为止。
在以下条件下：（a）感兴趣的物种占主导地位，或（b）所有物种的摩擦比均假定为相同，可以通过选择“显示→ 在c（s ）”，然后按c（s）分布图中出现的按钮。
在绘制之前，可能需要将分布的分辨率（在“参数”窗口中）提高到150，然后重新拟合。
对于第一个分布，选择“图→ GUSSI c（s）图”。对于将要覆盖的后续发行版，选择“复制→ 复制发行版”（从而将其放置在剪贴板上），然后将其粘贴（“发行版→ 粘贴发行版”）到包含先前发行版的GUSSI实例中。典型的GUSSI输出如图3所示。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902971--1384 Abhilash Padavannil 755428 \ Figs jpg \图3.jpg

图3 。典型的GUSSI输出。分析型超速离心产生了Imp9，H2A-H2B，RanGTP，Imp9和H2A-H2B二聚体的1：1摩尔比混合物，Imp9和RanGTP的1：1摩尔比混合物以及1：1：3摩尔比的沉降曲线Imp9，H2A-H2B二聚体和RanGTP的混合物。

在GUSSI中，选择“积分→ 全部积分”以同时获得所有物种的加权s 值（这也可以通过使用Ctrl-I求和的积分函数在SEDFIT中单独完成）。
加权s 值的置信区间（如有必要）（Schuck ，2016年）。
一个。在SEDFIT中，经过优化分析后，定义积分极限并记下值。

b。注意优化的弯液面值。

C。为68.3％的置信度选择“统计信息→ 计算方差比（F统计量）”，并记下目标均方根值。

d。选择“参数”：将弯液面固定为一个较低的值（例如，将其降低0.01厘米）并进行拟合；观察均方根值，看其是否超过目标值。如果不是，请降低固定的弯液面值，并重复进行，直到均方根值超过目标值。

e。保持固定在这个新的价值半月板中，选择“统计→ 蒙特卡洛的整合重→ 平均价值观”，并执行最小为1 ，在68.3％的置信水平000迭代。

F。注意程序返回的置信区间（两个值）。

G。重复，将弯液面固定为高于最佳弯液面的值。

H。选择程序返回的四个值中的最高值和最低值作为置信区间。

菜谱

LB介质（1升）
10克胰蛋白Try

10克氯化钠

5克酵母提取物

2x YPT介质（1 L）
16克Bacto胰蛋白p

10克酵母提取物

5克氯化钠

洗涤缓冲液
10 mM Tris HCl pH 7.5

1毫米EDTA

5mM的β 巯基乙醇

展开缓冲
7 M盐酸胍

20 mM Tris HCl pH 7.5

10毫米DTT

重新折叠缓冲区
2 M氯化钠

10毫米Tris HCl

1毫米EDTA

5mM的β 巯基乙醇

乙酸钠尿素缓冲液200（SAU 200）
尿素7 M

20 mM醋酸钠，pH 5.2

200毫米氯化钠

1毫米EDTA

5mM的β 巯基乙醇

醋酸钠尿素缓冲液600（SAU 600）
尿素7 M

20 mM醋酸钠pH 5.2

600毫米氯化钠

1毫米EDTA

5mM的β 巯基乙醇

AUC缓冲区
20 mM HEPES pH 7.3

200米中号小号裂果Ç hloride

2mM的米agnesium Ç hloride

2毫米TCEP

8％甘油

Imp9裂解缓冲液
50 mM的Tris-HCl pH 7.5

100毫米氯化钠

1毫米EDTA

2毫米DTT

20％甘油

完全，不含EDTA的蛋白酶抑制剂

Imp9清洗缓冲液
50 mM的Tris-HCl pH 7.5

100毫米氯化钠

1毫米EDTA

2毫米DTT

20％甘油

氯化钠Q缓冲液
20毫米Tris-HCl pH 7.5

100 mM氯化钠/ 1 M氯化钠

1毫米EDTA

2毫米DTT

20％甘油

Imp9-SEC缓冲区
20 mM HEPES pH 7.3

110 mM的p otassium乙

2mM的米agnesium乙

2毫米DTT

15％甘油

裂解缓冲液
50 mM HEPES pH 8.0

200毫米氯化钠

10％甘油

2mM的米agnesium 一个cetate

2 mMβ-巯基乙醇

5 mM咪唑

完全，不含EDTA的蛋白酶抑制剂

冲洗缓冲液
20 mM HEPES pH 8.0

200毫米氯化钠

10％甘油

2mM的米agnesium 一个cetate

2 mMβ-巯基乙醇

40mM的我咪唑的

洗脱洗脱缓冲液
20 mM HEPES pH 7.5

50毫米氯化钠

10％克lycerol

2mM的米agnesium 一个cetate

2 mMβ-巯基乙醇

300mM的我咪唑的

氯化钠SP缓冲液
20 mM HEPES pH 7.5

50 mM氯化钠/ 1 M氯化钠

4毫米agnesium 一个cetate

1毫米DTT

10％克lycerol

跑GTP交换缓冲区
20 mM HEPES pH 7.5

100毫米氯化钠

4毫米agnesium 一个cetate

1毫米DTT

10％克lycerol

注意：使用标准程序制作缓冲区。称量组分至小于最终体积的体积，在不断搅拌缓冲液的同时调节pH值，调节完pH值后，加水达到最终体积。在加水以达到最终体积之前，将介质的pH调节至7.0。

致谢

我们感谢李兵表达H2A和H2B的质粒。这项工作由美国国立卫生研究院的NIGMS资助，奖项包括R01GM069909（YMC），U01GM98256-01（YMC），Welch Foundation I-1532（YMC），白血病和淋巴瘤协会学者奖（YMC）以及德克萨斯大学西南捐赠基金学者计划（YMC）。组蛋白纯化和装配规程是Karolin Luger出版的著作中组蛋白纯化和装配规程的修改版本。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或利益冲突。

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