材料和试剂

生物材料
质粒（表1）
细胞系（表2）

表1. 用于产生诱导性细胞的可用质粒列表及其Addgene ID

Addgene ID

质粒

132388

AAVS1 Kan R 基础熏氧盒

132389

AAVS1 CAG rtTA 3 Tau WT 2N4R-EGFP

132393

AAVS1 CAG rtTA 3 Tau P301L 2N4R-EGFP

132394

AAVS1内含子1 gRNA as2

132395

AAVS1内含子1 gRNA s3

132396

AAVS1内含子1 gRNA as2

表2. 可用细胞系列表

细胞系

基础熏衣草，HEK293

AAVS1 lox / lox ，转基因插入纯合子，Kan R 片段完整

基础熏鲑鱼IMR-32

AAVS1 WT / lox ，杂合子插入转基因，Kan R 片段完整

基础lox，ReN VM

AAVS1 lox / lox ，用于转基因插入的纯合子，通过优化的Flippase （Flp o ）去除了Kan R 片段

诱导型3RWT / 4RWT Tau-EGFP，IMR-32

4R WT Tau-EGFP等位基因：Puro R 被Flp o 移除； rtTA 3 完整

3R WT Tau-EGFP等位基因：Puro R 完整；去除了rtTA 3

诱导型3RWT / 4RP301L Tau-EGFP，IMR-32

4R P301L Tau-EGFP等位基因：Puro R 被Flp o 移除； rtTA 3 完整

3R WT Tau-EGFP等位基因：Puro R 完整；去除了rtTA 3

克隆化
注意：所有克隆酶和PCR试剂均在-20°C下保存，稳定1年。

Q5 ® 热启动高保真2 X 预混（新英格兰生物实验室，目录号：M0494S）
底漆：订购为Value Oligos或Custom Oligos ，25 nmole ，脱盐（Invitrogen）。用水稀释至100μM 储备液，在-20°C下储存
Q5 ® 定点突变试剂盒（新英格兰生物实验室，目录号：E0554S ）
EZ-10离心柱PCR产物纯化试剂盒（BioBasic ，目录号：BS664-250preps）
带CutSmart缓冲液的限制酶BbvCI （新英格兰生物实验室，目录号：R0601S）
带CutSmart缓冲液的限制性酶NheI -HF（New England Biolabs，CutSmart，目录号：R3131S）
快速AP热敏碱性磷酸酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：EF0651）
PureLink 快速凝胶提取试剂盒（Invitrogen，目录号：K210012）
T4 DNA连接酶（新英格兰生物实验室，目录号：M0202S）
的Endura TM 化学感受态大肠杆菌细胞（Lucigen ，目录号：60241-2）店铺在。
-80℃
10自旋EZ柱质粒DNA 小量制备试剂盒（BioBasic ，目录号：BS614-250preps）
的PureLink ® HiPure 质粒筛选马克西试剂盒（Invitrogen，目录号：K210026）
氨苄西林钠盐粉，91.0-100.5％，经过细胞培养测试（Sigma-Aldrich，目录号：A1066-5G）。在4°C下保存，稳定1 年

诱导细胞生成
paavCAG-iCre 质粒（Addgene ，目录号：51904，Jinhyn Kim 的礼物）
jetPRIME （PolyPlus ，目录号：114-07）.S在4°C时撕裂，稳定1 年
TransfeX 转染试剂（ATCC，目录号：ACS-4005）.S在4°C撕裂，稳定1 年
新型Millex -HA注射式过滤器，0.45 Myuemu 孔径（Millipore公司，目录号：5010-SLHA033SS）
新型Millex -GP注射式过滤器，0.22 Myuemu 孔径（Millipore公司，目录号：SLGP033RS）
6孔组织培养板（Falcon，目录号：353046）
24孔组织培养板（Falcon，目录号：353047）
嘌呤霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P7255-25MG）。调配至10 mg / ml储备液，过滤灭菌，等分，在-20°C储存
强力霉素（BioBasic ，目录号：DB0889-25G）。重新配制为10 mg / ml的储备液，等分，在-20°C下储存

GFP 纳米阱进行亲和捕获
15厘米组织培养板（Sarstedt ，目录号：83.3903 ）。
琼脂糖偶联的GFP 纳米捕集阱（Chromotek ，目录号：gta -10）。在4°C下保存，稳定1 年

细胞培养
C 6 米组织培养板（Sarstedt的，目录号码：83.3901）
1.5 ml 离心管（Sartsted t ，目录号：72.690.300）
那么-12 组织培养板（萨尔斯塔特，目录号：83.3921）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（D-PBS），不含氯化钙和氯化镁，液体磷酸盐缓冲盐水（Sigma-Aldrich，目录号：D8537-500ML）。储存于4°C，稳定1 年
含EDTA 4Na的0.25％胰蛋白酶（Gibco，目录号：25200072）。等分试样，-20°C长期保存。4°C短期保存，稳定6 个月
的StemPro ® 的Accutase ® 。细胞解离试剂（GIBCO，目录编号：A1110501）分装，储存在-20°C的长期储存储存在4℃下短期使用，稳定6个月
基质胶，生长因子降低（Corning，目录号：354230）。等分试样，储存在-20°C，稳定1 年
Recovery TM 细胞培养冷冻培养基（Gibco，目录号：12648010 ）。等分试样，在-20°C下储存，稳定1 年
具有高葡萄糖，L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的DMEM（Gibco，目录号：11995073）。可在4 °C下保存，稳定1年
合格的10％胎牛血清（Gibco，目录号：12483020）。分装后，可在-20°C长期保存
％1 的GlutaMAX TM -I补充剂（Gibco公司，目录号的：35050061 ）。储存在4℃下，稳定1年
DMEM / F12，1：1，包含L-谷氨酰胺，但不含HEPES（Gibco，目录号：21041025）。在4 °C下储存，可稳定1年
2％N21-MAX补充剂（R＆D Systems，目录号AR008）或2％B-27无血清补充剂（Gibco，目录号：17504044）。储存在-20 °C下，稳定1年
成纤维细胞生长因子基本（GIBCO，目录号：PHG0261）。存储在-80 ℃下，稳定1叶氩
表皮生长因子（Reprokine ，目录号：RKP01133）。储存于-80 °C ，稳定1年
肝素（Sigma-Aldrich，目录号：H3149-10KU）。储存于-80 °C ，稳定1年
2 ng / ml胶质细胞源性神经营养因子（Gibco，目录号：PHC7045）
500 MYU 中号丁酰-环-磷酸腺苷（Sigma-Aldrich公司，目录号：D0627-250MG）
IMR-32和HEK-293细胞的增殖培养基（请参阅食谱）
ReN VM单元的增殖介质（请参阅食谱）
ReN VM细胞的神经元分化培养基（请参阅食谱）

细胞裂解
注：Ø .. Riginal试剂存放在室温下复原库存保存在4℃，持续3个月，所有缓冲器（见食谱）准备从新鲜试剂股票立即使用之前。

Tris-HCl，> 99％（BioShop ，目录号：TRS002.5），用水稀释至1 M
NP-40（BioShop ，目录号：NON505.500）。用水稀释至10％
脱氧胆酸钠（DOC），> 99％（BioShop ，目录号：DCA333.50）。重新配制为pH 8.0的10％w / v的水
氯化钠（NaCl），> 99％（BioShop ，目录号：SOD002.205）。用水稀释至500万
乙二胺四乙酸盐（EDTA），> 99％（BioShop ，目录号：EDT001.500 ）。重新配制为水中的0.5 M储备液
钠原钒酸盐（钠3 VO 4 ）（BioShop ，目录号：SOV664.25）。重新构建为0.1M的库存在水
氟化钠（NaF ）（BioShop ，目录号：SFL001.100 ）。重新配制为水中的1 M库存
苯甲基磺酰氟（PMSF）（BioShop ，目录号：PMS123.5 ）。配制为0.5M 乙醇库存
cOmplete 蛋白酶抑制剂（Roche，目录号：11836170001）
PhosStop 磷酸酶抑制剂（Roche，目录号：4906837001）
HEPES（Bioshop ，目录号：HEP001.500）。用水重新配制为0.1万库存
三氟乙酸（TFA），> 99％，HPLC级（Sigma-Aldrich，目录号：302031-100ML ）。
乙腈（ACN），HPLC级（Caledon，目录号：1401-7-40）
裂解缓冲液（请参见食谱）
洗涤缓冲液（请参见食谱）
洗脱缓冲液（请参见配方）

配套设备

-80 °C冰柜（Thermo Fisher，型号：标准性能超低冰柜）
冷冻微型离心机（Eppendorf，型号：5424R，目录号：5404000138）
Avanti J-26S系列高速离心机（贝克曼库尔特，目录号：B22984）
Ø Rbital振荡器（JEIO 技术，型号：ISF-7000系列）
˚F Luorescence显微镜（Leica Microsystems公司，型号：徕卡DMI 6000乙）
NanoDrop 分光光度计（Thermo Fischer Scientific，目录号：ND-1000 ）。
ESBE Scientific Save细胞紫外线细胞培养培养箱（Panasonic，目录号：MCO-19AIC）
SterilGARD 生物安全柜（贝克公司，目录号：SG603A-HE）

软体类

Snapgene（GSL Biotech LLC，https: //www.snapgene.com/ ）
Snapgene Viewer（GSL Biotech LLC，https: //www.snapgene.com/snapgene-viewer/ ）
Tm计算器（新英格兰生物实验室，https： //tmcalculator.neb.com/#！/ main ）。
NEBioCalculator （New England Biolabs ，https: //nebiocalculator.neb.com/#!/ligation ）。
NanoDrop 1000 （Thermo Fischer Scientific，https://www.thermofisher.com/ca/en/home/industrial/spectroscopy-elemental-isotope-analysis/molecular-spectroscopy/ultraviolet-visible-visible-visible-spectrophotometry-uv-vis-vis /uv-vis-vis-instruments/nanodrop-microvolume-spectrophotometers/nanodrop-software-download.html）。
程序

该协议旨在在不到一个月的时间内（图2 ）生成神经细胞模型以进行目标蛋白质的功能分析。该系统可通过程序并行化进行扩展。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902994--1381 Gerold Schmitt-Ulms 846733 \图jpg \图2 rev.jpg

图2.该协议中描述的程序的执行时间表。协议中描述的所有步骤都需要大约一个月的时间来实现。编码可诱导表达的目的蛋白的载体的生成大约可以完成如果选择并验证了阳性克隆，则可以并行进行基于细胞的分析和生化分析。如果计划进行复杂的后续下游分析，则自然会超过一个月的时间表。

第一周。将目的基因克隆到IEX
注意事项：

可以使用Snapgene 和Snapgene Viewer 模拟，验证和可视化克隆策略。
可以使用独特的限制性酶切位点BbvCI 和KpnI 将新的目标蛋白的编码序列（CDS）克隆到IEX中：
BbvCI ：位于新CDS起始密码子的5' 。

KpnI ：存在于将EGFP连接到新蛋白质C末端的接头区域中。

其他独特的限制酶多点（如，NheI位，BstBI位，KflI ，等等。）也可以使用。

订购引物，分别将BbvCI 和KpnI 限制性酶切位点附加到目标蛋白质CDS的5'和3'末端。
范例：

引物名称序列

插入BbvCI 网站5 ' ... CC V TCAGC ... 3' 5 ' ñ 8 CCTCAGC GCCACC ATG X 20-25 3 '

插入KpnI位网站5 ' ... GGTA V CC ... 3' 5 ' ñ 8 GGTACCX 20-25 3 '

N 8 代表8个随机核苷酸，用作限制性酶有效消化所需的突出端。
X 20-25 代表目标蛋白质的CDS序列。
蓝色：翻译需要的Kozak序列，包括ATG 起始密码子。
如果新蛋白要表达为EGFP融合蛋白，请不要在用于设计“插入KpnI ”引物的X 20-25 序列中包含终止密码子。
遏制煤矿退火温度引物使用新英格兰生物实验室ŧ 中号计算器工具，它返回此信息在引物序列进入了在线表格字段在：Https://Tmcalculator.Neb.Com/#!/Main。

第一天。克隆

使用以下PCR反应执行PCR将BbvCI 和KpnI位点附加到目标蛋白的CDS上：
试剂50 Myueru 反应（Myueru）终浓度

Q5 HiFi热启动预混（2x）25 1x

模板DNA（20 ng）计算

'插入BbvCI '引物（10μM ）2.5 0.5μM

'插入KpnI '引物（10μM ）2.5 0.5μM

无核酸酶H 2 O 添加到50

总计50

执行以下PCR循环：
步进温度（°C ）时间

初始变性98 30 s

变性98 10 s

30个循环退火待定30 s

扩展72 10-20 s / kb

最后延期72 2分钟

保持4 直到样品存储

继续按照制造商的规程进行PCR纯化。按照制造商的规程在NanoDrop 1000 上测量DNA浓度。
使用以下反应设置IEX载体和新CDS插入的限制性酶切图：
试剂IEX载体新的CDS插入

BbvCI 4微升4微升

KpnI 4微升4微升

CutSmart缓冲液（10x）5 µl 5 µl

碱性磷酸酶1 Myueru -

DNA 最高5 µg 最高5 µg

无核酸酶的H 2 O 添加至50 µl 添加至50 µl

总计50 µl 50 µl

在37 °C 孵育1 h。
在孵育过程中，浇铸1％的琼脂糖凝胶以分离消化的产物。
用限制酶切消化混合物的全部体积进行凝胶电泳。
疑难解答：建议将未切割和单切割的IEX向量样本作为对照。

删除双重消化的IEX载体（7.0 kb）和新的CDS插入片段。
按照制造商的规程进行凝胶提取纯化，测量DNA浓度。

第1天。将新的CDS插入物连接到双重消化的IEX载体中

确定合适的向量：插入质量比以达到大约1：1的摩尔比，可以使用在线算法来简化此任务，包括NEBioCalculator 工具（1.10.0版; https：//nebiocalculator.neb.com/#！ /结扎）。
设置以下连接反应：
试剂仅限载体对照（µl）载体+插入（µl）

T4 DNA连接缓冲液（10x）2 2

T4 DNA连接酶2 2

矢量（100 ng）计算计算

插入（X伍，取决于比）- 计算

无核酸酶H 2 O 添加到20 添加到20

总计20 20

在室温下孵育15分钟。
按照制造商的规程进行细菌转化。
将琼脂平板上的细菌以100 µg / ml氨苄西林（对于涉及氨苄青霉素的所有应用使用相同的浓度）置于琼脂平板上，将平板在30 °C 下倒置孵育过夜。
Endura具有化学感受态的细胞可在琼脂生长温度为30 °C的情况下最大程度地减少复杂质粒的截短。琼脂平板可减少倒置，以减少过夜孵育过程中琼脂的水分蒸发。

第2天。选择转化菌落

比较“仅矢量”控制板上的菌落数（应该没有或只有很少的菌落）和“矢量加插入物”板上的菌落数应该有很多菌落。
6-10菌落从这里选择的“载体加插入”板要生长在3mL的LB培养基氨苄青霉素摇动以225rpm过夜37 ℃下。

第3天。提取DNA进行测序

将500 µl过夜细菌培养物保存为甘油储备液。
按照制造商的规程，通过微量制备方法从剩余的细菌培养物中提取DNA。
测量DNA浓度，然后将纯化的DNA质粒送去测序。
其他网站，如果定向诱变要求，进行使用的反应Q5 ® 定点突变试剂盒根据制造商的协议。

第4-5 天，Maxiprep 用于转染的新IEX和iCre 载体

使用具有正确测序结果的细菌储备液，使其在含有氨苄青霉素的125-250 ml培养物中生长，然后按照制造商的说明进行DNA maxiprep。
注：这是林Portant使用大量制备试剂盒，去除内毒素从细菌中，以尽量减少不需要的细胞毒性在未来的转染。

同时在，大量制备的ICRE 向量未来的转染。

第2周。使用新的IEX载体生成诱导型细胞
通过将IEX载体和iCre 载体共转染，然后进行嘌呤霉素选择和强力霉素（Dox）处理确认可诱导性，设计了下一步步骤以创建可诱导细胞。

提前8天

在37度的细胞培养培养箱中培养靶细胞 °C，95％水分和5％CO 2 。
在经过认证的生物安全柜中执行涉及哺乳动物细胞的所有方案，以防止污染并遵守生物安全规则和规定。
转染前至少经过一次以检查细胞是否正常生长，因为融化后它们可能非常脆弱。请参阅“辅助信息”。–“细胞培养”部分，提供有关常规细胞培养，传代和保存库存的说明。
确定合适的嘌呤霉素的浓度，用于进行选择对于每种细胞系通过处理细胞以不同浓度（例如，0.0，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0和10 Myug / ml）的中嘌呤霉素以及选择最低浓度杀死100 3天的细胞百分比。

第8天。平板细胞进行转染

将所有细胞接种在不含抗生素或抗真菌药的培养基中。
对于ReN VM细胞，在没有肝素的增殖培养基中，在基质胶包被的12孔板上接种约135,000个细胞/孔，第二天应将细胞融合至约50％。
对于不需要铺在带涂层细胞培养皿上的细胞，可在6孔板上每孔接种约350,000个细胞，并期望第二天约80％融合。
保留1-2孔作为有效嘌呤霉素选择的对照；它们不会被转染。

第9天。转染

使用1 iCre 载体：4个具有所需插入片段的IEX载体的比例转染细胞。
比例为1 ICRE 矢量：1 - 3 IEX载体还努力。

对于ReN VM单元，总共使用1.0 按照制造商的说明，每孔加入1 g TransfeX 转染试剂和1 g微克 DNA 。
转染过程中应使用不含肝素的增殖培养基，因为肝素可能会影响功效。

对于大多数其他细胞，按照制造商的说明，每孔总共使用3 µg DNA和jetPrime 转染试剂。
对于IMR-32 细胞，请使用1 µg DNA：3 µl jetPrime的比例。

对于HEK-293 细胞，请使用1 µg DNA：2 µl jetPrime的比例。

为了使毒性最小化，在转染到常规增殖培养基后4 h更换培养基。

第3周。嘌呤霉素的选择和Dox治疗
将转染的细胞传到一些较大的平板上，并加入适量的嘌呤霉素和2.0 µg / ml的Dox。
一个人可以在荧光显微镜上添加Dox后24小时检查诱导水平。

继续选择嘌呤霉素，直到对照孔中的所有细胞死亡。
注意：建议每隔两天刷新一次嘌呤霉素和Dox，以保持可诱导的转基因转录活性。

允许存活的细胞增殖至大于100个细胞/ 菌落的较大菌落。
用2.0 µg / ml Dox诱导细胞；在荧光显微镜上检查是否成功诱导了集落。
注意：我Nduction在的ReN 。VM细胞可能并非均质即使在同一克隆可能会失去诱导过程中当然分化，这是因为内生后生沉默可能导致变和马赛克诱导型构建（昌达等人，2017年）同样，如果需要分化，可以通过在分化开始之前的增殖阶段2-4天开始诱导来改善ReN VM细胞和其他神经祖细胞的诱导。

标记并以期望的诱导水平将选择的菌落转移至新孔中，将其扩增以保存为原种，并通过蛋白质印迹法验证目的蛋白的诱导性和身份。
去除如果普罗[R 基因是需要的，转染细胞用“ 的FIp Ø ”优化翻转载体。
通过铺平相同细胞克隆的复制品来选择失去嘌呤霉素抗性的细胞，其中一个用嘌呤霉素处理，而另一个则未处理。
在ReN VM细胞中，保留Puro R 可能有助于保持可诱导的转基因区域的转录活性。

第4周。为基于质谱的相互作用组研究准备诱导细胞
注意：以下步骤旨在使用GFP 纳米捕集器捕获EGFP标记的诱导蛋白及其相互作用物，以便在质谱仪中进行下游分析。

在15厘米平板上一式三份地培养诱导型目的蛋白EGFP融合细胞，以及诱导型表达EGFP的细胞，仅作为对照，以对抗非特异性结合至GFP nanotrap 基质。
注意：如果诱导表达非常低，请相应放大。

诱导细胞所需的时间长度。
按照制造商的协议使用GFP 纳米阱进行亲和力捕获实验。
所有步骤均应在4°C 下进行，以防止蛋白质降解。

可以按照制造商的规定在RIPA缓冲液中裂解细胞，或将其溶解于0.5％NP-40和0.25％DOC组成的缓冲液中（配方4 ）。
通过在4°C下以3,000 xg离心5分钟去除细胞碎片。

由于其高结合力，因此20 µl GFP 纳米阱微珠浆液/生物复制品足以进行基于质谱的相互作用组研究。
EGFP融合蛋白或单独的EGFP可以在与裂解液连续混合，在4°C下孵育2 h的过程中捕获在GFP nanotrap 珠上。
较短的纳阱珠子孵育5分钟，然后轻微离心可能足以可视化EGFP融合蛋白的捕获。

在4°C下以100 xg离心，以收集琼脂糖偶联的GFP 纳米陷阱珠和诱饵蛋白。
在洗涤缓冲液中洗涤磁珠5次，洗涤程序应在2小时内完成，以最大程度减少相互作用物的损失。
在洗涤缓冲液中前3次（配方5 ）在这些洗涤步骤中可以使用150-500 mM的NaCl盐浓度，具体取决于所需的严格性。
最后两次洗涤应为25 mM HEPES（pH 7.0）和10 mM HEPES（pH 7.0），不得使用Tris-HCl。
用0.2％三氟乙酸和20％乙腈的水溶液（pH 1.9）洗脱，立即保存并快速冷冻或用pH中和部分洗脱液（例如，总量的25％），以通过Western blot在下游验证诱饵蛋白复合物。
专门用于蛋白质印迹分析的洗脱液收集的延迟可能导致洗脱液蛋白质在pH 1.9环境中沉淀，从而损害了蛋白质印迹分析。

其他特殊注意事项：
可以在亲和力捕获之前使用BCA调整蛋白质含量。
请记住，将一部分细胞裂解液保存为“输入”和“未结合”以进行蛋白质印迹分析。

辅助信息

细胞培养

在37 °C 解冻细胞后，通过将细胞原液稀释在4 ml增殖培养基中并在25 °C下以100 xg离心3分钟，从细胞原液中除去DMSO含量。除去淀粉，仅保留细胞沉淀。 DMSO对常规培养的细胞可能有毒。
在适当的增殖培养基中培养细胞约一周，以使其从解冻中恢复。
对于ReN VM细胞，不要在增殖培养基中包含抗生素或抗真菌药，因为它们会导致细胞死亡。
对于ReN VM细胞，在将细胞播种到平板上之前，请至少按照2小时的时间按照制造商的规程用Matrigel涂布组织培养板，Matrigel 在潮湿的培养箱中于37 °C 固化需要2小时。
在细胞达到90％融合之前定期进行传代，以防止使用适当的解离试剂过度生长的不良影响。对于ReN VM细胞，请使用Accutase。对于其他大多数细胞类型，请使用胰蛋白酶。
切记将一部分细胞，特别是有价值的克隆保存为原种，同时将其余的用于实验或常规培养。
为了保存细胞原液，将细胞重悬于标记的冷冻管中的细胞冷冻培养基中，将细胞立即转移至-80°C，并在-80 °C下保存1天，然后再转移至液氮中进行长期保存。

资料分析

描述该系统首次使用的文章中包含了有关统计分析的信息以及可以从TAU和BAG5分析中找到可公开获得的质谱数据的信息（Wang 等人，2019），其中原始文章的图2提供了定量相互作用组分析设计的详细信息，图3描述了TAU蛋白的质谱序列覆盖范围，图6比较了IMR32和ReN VM细胞中的TAU相互作用组，图9记录了产生的TAU的翻译后修饰分析结果这个系统。

菜谱

IMR-32和HEK-293细胞的增殖培养基
注意：使介质新鲜，在4°C下储存，稳定2个月。

具有高葡萄糖，L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的DMEM培养基，补充了10％合格的牛血清和1％GlutaMAX TM -I补充剂

ReN VM细胞的增殖介质
注意：使介质新鲜，保存在4°C，稳定2周。

DMEM / F12，1：1含L-谷氨酰胺，但不添加HEPES，补充2％N21-MAX或2％B-27无血清

20 ng / ml碱性纤维瘤最后生长因子

20 ng / ml表皮生长因子

2 ng / ml肝素

ReN VM细胞的神经元分化培养基
注意：使介质新鲜，在4°C下储存，稳定1个月。

DMEM / F12 1：1含L-谷氨酰胺，但不添加HEPES并补充2％N21-MAX补充剂或2％B-27无血清补充剂

2 ng / ml神经胶质来源的神经营养因子

500 MYU 中号二丁酰- 环-磷酸腺苷

裂解缓冲液
注：中号阿克鲜用之前，稳定在4 ℃下1天。

0.5％混合物（体积/体积）NP -40，0.5％（W / V）DOC，TRIS / HCl，pH值8.3，5mM的EDTA，1 毫摩尔的Na 3 VO 4 ，10 mM的氟化钠，1 mM的PMSF， 1× 完全蛋白酶抑制剂和1x PhosStop 磷酸酶抑制剂
PR Epare NP-40和DOC作为50X储备溶液和温水轻轻地溶解。DOC会沉淀在PH值低于8.0。因此，确保PH超过此值，并Buffere d添加这种去污剂之前
如果打算使用裂解物进行目标蛋白的免疫亲和捕获，建议在加入蛋白酶和磷酸酶之前准备大量的这种缓冲液，并转移其中一些用于洗涤液（见下文）另外，我们建议在添加温度不稳定的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物之前，将缓冲液冷却至4°C。

洗涤缓冲液
注意：使用前应使其新鲜，并在4 °C下稳定2天。

考虑以下因素，该缓冲液的组成与裂解缓冲液相似：

蛋白酶和磷酸酶抑制剂可以省略。

如果样品在下游用于质谱分析，则最后两次洗涤必须仅在去离子水中使用25 mM HEPES（pH 7.0）和10 mM HEPES（pH 7.0），不得使用Tris -HCl。

洗脱缓冲液
注意：使用前应使其新鲜，在室温下稳定1天。

在去离子水中混合0.2％的TFA和20％的乙腈
此溶液的pH值为1.9，无需调整

致谢

XW持有安大略省研究生奖学金，GS 获得了克里姆比尔基金会，加拿大卫生研究所（授权号137651）和艾伯塔省Prion研究所（授权号201600028）的资金。阿诺德·欧文家族的支持下购买了质谱仪。对此项目的启动起了重要作用。作者深表感谢Borden Rosiak 家人的慷慨慈善支持。

竞争利益

作者宣称他们没有金融或非金融竞争利益。

道德规范

该研究不涉及人类受试者或动物工作，人类细胞系和化学物质的所有处理均根据大学环境健康与安全（EHS）办公室批准的有效生物安全规程（编号208-S06-2）进行多伦多，加拿大多伦多市。

参考文献

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