材料和试剂

1.5 ml Eppendorf管
魔术胶带（苏格兰威士忌）
玻璃毛细管直径1毫米，长度90毫米（Narishige型号G1）
盖玻片24 x 60毫米，厚度1
FrameSlides（Leica microsystem，货号：11505151）
硅脂（克鲁勃润滑，目录号：0040260221）
钕磁铁（RS，目录号：695-0169）
封口膜（V WR ，目录号：291-1214）
Mu金属棒100 x 4 mm（塞克尔）
铝制圆筒（45毫米x 200毫米）
铜线0.5毫米
果蝇表达Resille GFP的果蝇。
注意：这可以很容易地扩展到其他果蝇系或有机体。

Dynabeads M-450甲苯磺酰活化（Thermo F 垫圈，货号：14013）
制备了GFP结合蛋白（GBP）（D'Angelo et al。，2019）
注：牛逼他GBP可以替代商业防GFP或其他类型的抗体。

硼酸（Sigma - Aldrich ，目录号：B6768）
PBS
PDMS（聚（二甲基硅氧烷），羟基封端的750 cSt （Sigma - Aldrich ，目录号：481963）
庚烷（Sigma - Aldrich，目录号：H2198）
次氯酸钠（Panreac，目录号：2119211211）
Voltalef油10s（V WR ，目录号：9002-83-9）
BSA（牛血清白蛋白）（Sigma - Aldrich，目录号：A2153）

配套设备

显微镜显微注射机（Leica，型号：DMIL）配备有20 X 物镜和微操作（NARISHIGE，型号：MN-153）
拔轮器，微型（萨特仪器，型号：P30）配备了一块3 毫米宽的槽丝（萨特我Nstrument，目录号：FT00330B）
微型注射器（WPI，型号：PV 820）
微型研磨机（成茂，型号：EG-44）
革命XD纺纱安道尔磁盘共聚焦显微镜配备了40 X 100 X 目标和落色卢比发光在488 nm和561牛米
三轴微操纵器（成茂，型号：UMM-3FC）
生物破坏者（Diagenode，型号：UCD-200TM-EX）
温控器（Eppendorf，型号：5350）
热板（Stuart，型号：US152）
电源30 V，5A （Blausonic，型号：FA-350）

软体类

斐济（Schindelin 等人，2012）
Excel（或其他绘图和拟合软件）

程序

电磁体的构造和校准
为了施加受控力，我们设计了一种类似于Kollmansberger和Fabry （Kollmannsberger and Fabry，2007）中描述的电磁体。电磁体由三部分组成：Mu- 金属棒（具有很高磁导率的软铁磁合金），用铝制成的散热器散发热量，用铜线连接电流（图1A和1B）。将Mu金属棒磨成圆锥形尖端，然后进行扩散退火（这两种操作都可以在Sekels进行）厂），一个定制生产的45毫米长的铝合金缸体–内径为4.5 mm 的Mu- 金属棒用于散发磁铁产生的热量。圆柱体的外径为200 mm。靠近一端，四个，宽1 mm ，深40 mm。在圆柱体上隔开2mm的距离，以增加散热器的表面。从圆柱体的另一端到另外的5mm处铣削另一个220mm宽的直径100mm的槽，容纳100个铜线线圈。在两个末端，三个螺杆在120定位塑料° 间隔和使用了-保持Mu金属。杆（FIGUR Ë 小号1C和1 d）。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902737--1344JérômeSolon 793986 \图jpg \图1.jpg

1图。电磁铁设置为强制的应用。阿。照片的电源（大号EFT）和电磁铁安装在微操作。乙。照片的电磁铁安装在台旋转盘显微镜中E. C. 关闭了电磁体，左箭头表示锥形的Mu金属棒，中心箭头表示散热器周围的铜线圈，右箭头表示铝散热器D.表示铝散热器设计的示意图，a = 160 mm ，b ＝120mm ，c ＝ 220mm ，d ＝160mm，e ＝ 200mm 。

在铜线圈中施加直流电后，磁场从尖端散发出来并在空间上衰减，位于磁场中的磁珠以与磁场梯度成比例的力被吸向尖端（Kollmannsberger和Fabry， 2007）。

为了校准施加在磁珠上的力（与距磁铁的距离的函数），我们开发了一种使用嵌入PDMS的磁珠的测定法，由于其粘度是已知的，因此可以通过在施加磁场时测量PDMS中磁珠的速度来进行测定。，我们可以根据距尖端的距离来计算力场：斯托克定律直接将力与速度相关联（图2和视频1）。

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图2 ，建设的校准室。a和b 。顺序折叠一张长方形的封口膜，虚线表示折叠遗址。Ç 。虚线表示切割位置生成一个窗口。d 。封口膜转移到盖玻片A.ê 。照片的校准室安装在金属滑轨。

1视频。校准力施加在4.5 Myuemu珠。（左）视频经过时间4.5 Myuemu中磁珠嵌入在PDMS移向磁铁在磁场和各自的跟踪（右）应用。

将5μlDynabeadads放入1.5 ml Eppendorf管中，并将其置于37°C，在Thermomixer中打开盖子几个小时，以完全干燥珠子。
加入1 ml PDMS ，并用移液器吸头搅拌，以从底部分离出沉淀的珠子。
该Bioruptor使用，小号Onicate最大功率10分钟。如果珠不是均匀重悬浮重复超声镨Ocedure。
切成一片10 厘米x 3厘米的矩形胶片，然后如图2所示折叠。
使用切割器在折叠的Parafilm中心打开一个5 x 10 mm的窗口。
将Parafilm转移到盖玻片的顶部，然后在加热板上加热，直到Parafilm正确附着在盖玻片上而不会熔化。
将50μl的珠子/ PDMS（来自步骤A3 ）转移到Parafilm窗口中。
使用一滴硅脂将盖玻片安装到镜架Leica上。
在旋转圆盘显微镜上，使用40倍透镜并聚焦在微珠上。
将电磁体移到视场的一侧（视频1）。
使用透射光和20 ms的曝光时间开始延时拍摄。
启动强制应用程序。

将4.5μm小珠注入果蝇胚胎的步骤
单磁珠被注入蛋黄的胚胎在第2阶段果蝇发展（图小号3 - 4）注射后，盖玻片支持胚胎留给开发超过钕磁铁，将持有的珠在胚胎皮质。因此，在细胞化时，珠子会自然封装到一个新成立的细胞。通过选择胚胎相对于取向的钕磁铁，可以嵌入粒子在一个特定的细胞群，这将在后面发育成特定的组织或器官。

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3图。固定化的单个4.5 Myuemu珠在尖端注射针头。中A.注射针放入一滴4.5 Myuemu珠重悬浮于0.1 Pasento PBS / BSA。B.负压（P < 0）是为了固定单个小珠，将其涂在针上。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902737--1344JérômeSolon 793986 \图jpg \图4.jpg

4图。注射的单个4.5 Myuemu珠子进入果蝇胚胎。A和B负压（P < 0）被施加到针为了固定单个珠子在接近的萌芽。c和d 。负压解除插图显示了相应注射步骤的卡通插图，其中，针头用青色表示，针头用黄色表示，胚胎用浅灰色表示。箭头表示由针头内部的负压产生的合力。针。

准备pH 9.5的0.1 M硼酸溶液。
用1毫升硼酸溶液洗涤50升4.5微米Dynabeads 3次。
将10μgGBP重悬于400μl硼酸溶液中，并在37 °C 下孵育O / N。
用1毫升硼酸溶液洗涤2次Dynabeads。
重悬于1毫升0.1％BSA（w / v）的硼酸溶液中。
通过将O / N 10 ml庚烷与120 cm魔术胶带温育来准备庚烷胶。
在盖玻片的中间放置一滴100μl庚烷胶，并使其在重力作用下流下，在盖玻片的中部形成一条平行于其长边的粘性表面条纹。
使用次氯酸钠在室温下将30至40个刚产下的胚胎化学去绒毛化90 s，然后在自来水下冲洗90 s，然后将其安装在涂有庚烷胶的盖玻片上。
注意：所有胚胎均应以规则的间隔且彼此平行的方式排成一排，以利于注射。

将胚胎在25°C的培养箱中脱水10-15分钟，以减少僵硬度并避免注射后破裂，然后用一小滴Voltalef油覆盖。请注意，需要根据湿度调整脱水时间在孵化器中。
除了Voltalef油滴，一滴重悬浮于PBS / 0.1％BSA中的40μl珠子还沉积在胚胎附近。
转动微拉器，将热量1的值设置为860，将热值设置为750，然后将玻璃毛细管插入相应的支架中并生成注射针，请注意可以使用不同的牵引参数。拉长到足以有Diamet 尔允许持有磁粉并打入胚胎无坝老化（参见图小号3和4）。
使用微粉碎机将注射针精确打开，以达到3.5μm的内径（见图3）。
针头连接到微型注射器（WPI PV 820）。
针被定位在在下拉含珠（在PBS / 0.1 Pasento BSA），并且通过施加负压，单个珠子被保持在尖端处的针。图3型插画中速率小号的流程。
针支撑移动珠关闭后极胚胎，设定的压力微量注射器至中性只是在注射前，然后，珠可以转移到该中心的胚胎（小号的Ee图4）。
注射完所有胚胎后，将盖有注射胚胎的盖玻片放在永久磁铁顶部，在25°C下放置2 h。
注意：

为了最大程度地将钕磁铁施加到胚胎的力，将盖玻片和注入的胚胎直接放置在钕磁铁上，而无需显微镜载玻片。
为了最大程度地减少对胚胎造成的损害，需要在发育的早期阶段（第2阶段）注射小珠。为了靶向特定组织，需要将感兴趣的组织面向盖玻片进行固定。要在背侧闭合过程中施加力，必须将胚胎的背侧朝向盖玻片安装，并且在18 ° C 注射后必须使胚胎发育20 h 。

成像和施力
用一滴硅脂将盖玻片安装到徕卡镜框滑架上。
在旋转盘上选择40倍透镜，将珠子对准正确的位置聚焦在胚胎上，然后将电磁铁的尖端定位在距所选胚胎150-200μm的位置。选择珠子-磁体距离时必须格外小心为了将胎圈定位在具有较小陡度的力-距离曲线的区域中，以允许对力进行精确估计（请参见图5B和图6）。
设置两个通道的xyz延时成像协议，一个通道将使用488 nm激光获取GFP信号，另一个通道将使用561 nm激光获取珠子的自发荧光。
设置5个z 步距，间隔为1μm，并选择5 s的时间分辨率。
开始播放影片，在打开电源1分钟后，选择0.3 A产生磁场，该磁场会在磁珠上施加115 pn的力。打开电源1分钟，然后在关闭电源后，映，以允许进行1更微小停止电影（图之前小号5A，5 ℃和视频2）。

5.强制应用图上的单个4.5 Myuemu 焊道到果蝇胚盘。阿。延时图像显示在胎圈（品红）在响应于力工序（〜115 PN;开始于0 S）珠粒嵌入到单个细胞的Resille-GFP胚胎。白色箭头指示部队的应用。白色虚线的标志左侧的中珠在时间0s。比例尺= 10 Myuemu; B 。快照在透射光的胚胎含有4.5 Myuemu 珠电磁铁放置并在190 Myuemu。比例尺= 20 Myuemu 。C.珠位移对应于力的应用显示在A.

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图6. 力距标定图。用于电磁铁标定的力距标图示例。施加在三个单个磁珠上的力随距磁铁尖端距离的函数而弯曲。功率定律适用于该力第三珠的曲线用红色表示。

2.兵力投送视频单个单元格在果蝇细胞化。延时录像显示力应用在4.5 Myuemu珠嵌入Resille-GFP表达胚胎。紫色箭头指示当力〜115 PN是应用撒谎比例尺= 10μm 。

数据一Nalysis

力标定
使用Fiji打开在校准过程中执行的延时。应用中值滤波器（2像素）以减少噪声。
注：Ø 疗法类型的滤波器（像高斯模糊滤镜为例），可以使用，唯一的标准是噪音充分降低的背景，正确门槛珠。

阈值以实现二进制电影，并将其转换为8位。
删除影片的缩放比例。
在强制应用（视频1）期间，使用MTrack2插件提取小珠的X和Y坐标。在与插件关联的窗口中定义以下参数：
对象大小T最低O 8 Myuemu 2 （对应于20像素，我们设立）

对象大小为最大120 Myuemu 2 （对应300像素，我们设立）

最高速度到100

最小轨道长度（帧）为20

勾选保存结果文件框

刻度线显示路径长度框

勾选显示标签框

勾选显示位置框

勾选显示路径框

MTrack2插件会在每个时间点生成带有跟踪对象的X1和Y1坐标的trackresult文件。
将跟踪结果文件导入Excel或其他数据绘图软件中。如果检测到噪声，则可以将几个连续数据点的时间平均值输入到新的X和Y列中以平滑轨迹。
根据X和Y坐标，我们计算出每个时间点t处磁珠与磁铁的距离D。

（等式1）

w ^ 这里，

像素大小是像素的大小，单位为µm ，

x bead 是每个时间点上珠子的x值（以像素为单位），

y 珠是每个时间点的y值（以像素为单位），

x magnet 是磁铁的x值（以像素为单位），

y 磁铁是磁铁的y 值（以像素为单位）。

计算磁珠的速度v（t）

（式2）

w ^ 这里，

是电影的时间间隔（以秒为单位）。

然后，可以使用以下斯托克定律在任何时间点计算施加在胎圈上的力F（t）。

（式3）

w ^ 这里，

µ 是嵌入磁珠的介质的粘度，

R 是磁珠的半径，

v（t）是磁珠的速度。

根据所获得的和的值，在您选择的绘图软件中生成力的散点图，将其作为相应距离的函数，然后将所产生的散点图与幂律拟合为以下形状：

（式4）

w ^ 这里并Arufa 为拟合参数（参见图6）。

注意：每个单独的磁珠轨道都可以独立地拟合，然后对提取的拟合参数进行平均，或者可以生成所有轨道的单个拟合。

在胚盘中施加力后的胎圈位移分析。
打开施力要胚盘电影斐济与分立的绿色（488纳米）和红色（561 Nm）的通道（小号的Ee视频2）。
求和将所有单个z平面投影到单个影片中，然后应用中值滤镜（内核为2个像素）。
将步骤2和步骤3如“力校准”部分中所述应用到红色通道。
按照“力校准”部分中的步骤进行步骤4，但使用以下参数：
最小物体尺寸为32 µm 2 （在我们的设置中相当于200像素）

物体最大六分之一为400 µm 2 （在我们的设置中相当于2500像素）

最高速度到100

最小轨道长度（帧）为20

勾选保存结果文件框

刻度线显示路径长度框

勾选显示标签框

勾选显示位置框

勾选显示路径框

通过将方程式1应用于MTrack2插件生成的X和Y坐标，并将磁体的坐标替换为生成文件中磁珠的初始坐标，我们可以计算在每个时间点施加力时的磁珠位移t（图6）。
为了估算施加到磁珠上的力，我们再次使用等式1测量了从磁体到磁珠初始位置的距离D。然后，使用等式4和先前在校准期间估算的参数，使用了等式4计算了力。
注意：为了将磁体从磁珠上定位190μm，必须使用40倍透镜拍摄参考磁珠-磁体快照（如图5B所示），但是为了更好地显示，必须使用一个100倍镜头（如图2 A和视频2所示）。

Acknowled 摹发言：

我们感谢Peran Hayes对手稿的讨论和批判性阅读，也感谢FundacióCIM的Roger Uceda的铝制散热器的制造。我们感谢ALMU团队为显微镜提供了帮助，导致这些结果的研究已获得了资金的支持。西班牙经济与竞争力部计划，国家计划BFU2010-16546和BFU2015-68754，“ Centro de Excelencia Severo Ochoa”和EMBL合作伙伴关系，我们感谢CERCA计划/加泰罗尼亚大将军的支持。这项工作得到了由Bioafisika Bizkaia基金会和巴斯克政府巴斯克卓越研究中心（BERC）计划的一部分。

竞争利益

没有利益冲突或利益冲突。

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