材料和试剂

1. Proteosec 6-600柱（Generon ）

2. 滨海热链球菌gDNA （Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen ，菌株编号：DSM-5473）

3. pRSET -A表达质粒（Thermo Fisher）

4. 胜任的大肠杆菌KRX（Promega ）

5. 从大肠杆菌表达和纯化的ADP-HK ，在-80°C下保存

6. 来自面包酵母的G6PDH（Sigma-Aldrich，目录号：G6378-100UN），储存在4℃下

7. D-葡萄糖，粉末在室温下保存（Sigma-Aldrich，目录号：G8270-100G），在室温下以粉末形式保存

8. NAD + （Sigma-Aldrich，目录号：N1636-25MG），以50 mM 反应缓冲液的等分试样（请参见食谱）在-80°C下保存

9. ADP（Sigma-Aldrich，目录号：A2754-100MG），以100 mM 反应缓冲液的等分试样（请参见食谱）在-80°C下保存

10. ATP（Sigma-Aldrich公司，目录号：A2383-1G），以等份试样储存100 MM 在反应缓冲液（见配方）在-80℃下

11. Tris Base（Melford ，目录号：T60040-5000）

12. 氯化钠（西格玛奥德里奇，目录号：S9888-1KG）

13. MgCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：208337-1KG）

14. 了不起的汤（Melford ，目录号：7758-11-4）

15. 鼠李糖（Melford ，目录号：10030-85-0）

16. Ni-NTA树脂（Generon NB-45-00042-100）

17. 咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I5513-100G）

18. BCA（二辛可宁酸）（赛默飞世尔，目录号：23225）

19. 反应缓冲液（请参见配方）

20. ATPase /激酶（请参阅食谱）

21. 1,000单位/ ml G6PDH （请参阅食谱）

22. 50 MM NAD Tasu （见配方）

23. 100 mM ADP（请参阅食谱）

24. 100 mM ATP（请参阅食谱）

25.1 M葡萄糖（请参阅食谱）

26. 2x测定试剂（请参阅配方）

配套设备

紫外分光光度计（岛津制作所，型号：UV-1601）
Myueru石英100 微小透明（HELLMA ，型号：105-201-15-40）
Ti 45定角钛转子（Beckman Couler，型号Ti 45）
离心机（贝克曼Couler ，型号：阿莱格拉® J2-21）
Äkta 净化器（GE Healthcare）
-80°C冷冻室

软体类

绘图软件（例如Origin Pro，OriginLab ）

程序

A. 测定试剂配方（图2）

偶联的酶混合物包含25 µg / ml ADP-HK，10 mM 葡萄糖，400 µM NAD + 和4单位/ ml G6PDH。
注意事项：

A. 葡萄糖，G6PDH和NAD Tasu 是市售的。单独的组件被存储为储备液在-80°C和混合的一天。

b。每次测量均以2倍浓度（50 µg / ml ADP-HK，20 mM 葡萄糖，800 µM NAD + 和8单位/ ml G6PDH）制备含有ADP-HK，G6PDH，葡萄糖和NAD + 的测定试剂，并在比色皿中与等体积的2x浓度底物混合。通过混合等体积（即100 µl + 100 µl），可获得快速混合条件，测定试剂和底物的浓度减半。

c。可检测到的吸光度信号是由NADH产生的，NADH在340 nm处有一个吸光度峰值（A 340 ），对于NAD + 不存在。NADH在340 nm处的消光系数为6,220 M -1 cm -1 。

ADP-HK克隆从T. litoralis的gDNA的入大肠杆菌，接着进行大小排阻色谱表达质粒并经镍亲和纯化通过N-末端六组氨酸标签。
通过纯化带有N末端带有His标签的构建体重组表达，内部产生ADP己糖激酶。
一种产生了质粒通过克隆ADP己糖激酶从Thermococcocus litoralis的gDNA的（DSM-5473，德意志SAMMLUNG 冯Mikroorganismen UND 保藏中心）基因插入PRSET - 一个表达质粒（热费舍尔）。

B. 为了表达，变换质粒入化学感受大肠杆菌KRX（Promega公司）并生长在1升Terrific肉汤直到OD 600 〜0.6-0.8进而诱发用0.1 Pasento（W / V）鼠李糖15小时。在18° C．

c。通过以2700 xg离心15分钟收获细胞，重悬于50 mM Tris ，150 mM NaCl ，pH 7.9中。

d。通过2s开/关脉冲超声处理（Bandelin Sonopuls 超声处理）裂解细胞5分钟，然后以80,000 xg 离心1 h （Beckman Ti 45转子在Allegra J2-21中）。

e。将印迹与3 ml的Ni-NTA树脂（Qiagen ）混合，并在4°C的旋转转子上放置过夜。

f。将树脂重新悬浮在15 ml的50 mM Tris ，150 mM NaCl ，30 mM 咪唑，pH 7.9中，洗涤3次，然后以1,000 xg离心5分钟。

g。通过用15 ml 50 mM Tris ，150 mM NaCl ，300 mM 咪唑，pH 7.9 洗涤3次来洗脱蛋白质。

H. 浓缩洗脱的蛋白1 mL和进一步净化使用尺寸排阻色谱使用Proteosec 6-600柱（Generon ）和FPLC上AKTA 净化器（GE Healthcare）上。

i。用20％（v / v）甘油将蛋白质浓缩至5 mg / ml，分装成50 µl等分试样，并在液氮中快速冷冻。

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质粒图谱2. ADP-HK图表达。修饰的表达质粒ADP-HK是PRSET -A质粒。在ADP-HK基因的Thermococcocus litoralis的（DSM5473）克隆到质粒的凝血酶可切割六组氨酸标签。插入片段在可诱导的T7启动子和强核糖体结合位点（Shine- Dalgarno RBS）的控制下。

B. 测定程序

注意：所述量为25 个200 µl反应的量，足以进行对照并产生一式三份的5点Michaelis-Menten 曲线。

制备2.5 ml含有50 µg / ml ADP-HK，20 mM 葡萄糖，800 µM NAD + 和8单位G6PDH 的分析试剂。
将测定试剂分为两个不相等的部分：
A. 2毫升，其中激酶/ ATP酶被测量添加。所以建议终浓度为酶1 MyuM在第一个实例。如果稳态条件不具备，即，反应过快或如果如果反应太慢而无法测量，则可以调整酶的浓度。

B. 0.5 毫升中，分析反应缓冲5 Myueru含量测定缓冲液加入。

在反应缓冲液中要测量的浓度范围内准备ATP。对于每种浓度，以2x浓度准备ATP，例如，对于10 µM ATP测量，将溶液以20 µM准备。建议的浓度范围是0 mM ATP至10倍酶预计以上ķ 中号。对于激酶与第二Substrat E，确保这是存在大量过剩，实现伪米氏- 米氏条件（100倍的于K 中号）。
每次测量时，将100 µl分析试剂与100 µl底物快速混合在石英比色皿中，吸气3次以混合并开始在A 340 处测量吸光度200 s。注意：根据仪器的速度调整测量时间较慢的激酶可能需要更长的测量时间。
进行每个测定的阳性和阴性对照。阳性对照;将100 µM ADP和测定反应试剂混合并确保A 340 的增加符合预期，相当于NADH的化学计量;阴性对照;将100 µM ATP和测定试剂混合而不加入激酶/ ATP酶并确保A 340 没有增加。
活动开始测量0 MyuM ATP然后在增加ATP Concentratio 纳秒。建议测量活动在在至少5个不同浓度ATP的最高浓度为10倍，高于预期的ķ 中号。

资料分析

一个340个Timecourses 记录一式三份，并绘制使用绘图软件（在这里我们使用的绘图软件 Origin Pro）。
对于Michaelis-Menten 分析，通过在每幅图的前30 s上绘制一条直线并计算斜率来确定稳态速率（A 340 / s），并为每幅图绘制带有标准偏差（SD）的平均速率的ATP和浓度装配到米氏方程[1]计算V. 最大和K 中号。
使用比尔-朗伯定律[2]计算NADH的浓度，其化学计量与ATP转化为ADP的浓度有关。

[1]

V o 是初始速率，[S]是底物浓度，V max 是最大速度，K M 是产生该最大速度的底物浓度。

[2]

[NADH]是NADH的浓度，A 340 是在340 nm处的紫外吸光度，ε是NADH的消光系数（6,220 M -1 cm -1 ），l是比色皿的光程长度（在这种情况下为1 cm）。

统计资料

均值和标准差
绘制的速度为每一个平均速率（X），计算除以总和的价格（Shigumax 我）与数量的数据点（N），这是这种情况下3.标准偏差率估计使用标准公式[3]。

[3]

误差K M 和V max
错误K的中号和V 最大的计算按产地临（OriginLab ）软件通过确定在K 中号和V 最大的每个单独的数据集和计算的标准偏差。

注意事项

敏感性和特异性验证
测试了该测定法对ADP的敏感性和特异性范围（图3A）。对于每种底物浓度，一式三份记录A 340的变化，并测量曲线基线和平稳期之间的相应差异。通过计算反应的前30 s的曲线斜率来确定稳态速率。

该测定对低微摩尔浓度的ADP到毫摩尔浓度很敏感。使用10 µM至3,000 µM ADP进行的记录显示，随着ADP浓度的增加，反应速率增加，直到高达3,000 µM ADP时，葡萄糖和NAD + 才不受速率限制。

为了确定ADP对ATP的特异性，测量了每种底物的100 µM反应速率和总A 340 变化（图3B）。ATP 在初始速率为0.002时没有产生可测量的活性，总A 340 变化为0.006±0.000。±0.000 A 340 / s。，ADP产生可测量的反应，初始速率为1.42±，总A 340 变化为0.7±0.10.00 一个340 / S，因此ADP生产116泰晤士报高等教育最终信号比ATP在705倍的速度速率，一个340 引伸113 MyuM NADH，这表明生产NADH的100 MyuM ADP 化学计量在试验中，并且该反应已经完成。

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图3. ADP浓度依赖性和特异性的验证。A . 340条增加ADP浓度的记录。B . ADP与ATP 的A 340 差异。用分光光度法（Shimadzu，UV-1601）在340 Hz和1 Hz下测量吸光度狭缝长度为1 nm。使用Origin Pro软件（OriginLab ）对痕迹进行弯曲和分析。

GAPDH-CP12-PRK的Michaelis-Menten 动力学
米氏曲线中Phosphoribulokinase （PRK）活性测定了氧化并REDUC 埃德GAPDH-CP12-PRK确定氧化还原依赖性失活的激酶（图4）（麦克法兰等人，2019）。PRK是糖激酶，其核酮糖5磷酸-磷酸盐核酮糖1 ，5 -Bisphosphate使用ATP。该GAPDH-CP12-PRK复杂的提纯，同质性与PRK测定活性浓度不断增加的三磷酸腺苷，以确定米氏常数中PRK在GAPDH-CP12-PRK复合物在氧化和还原条件下。

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图4 。GAPDH-CP12-PRK 米氏曲线。米氏拟合的氧化（OX）和还原（红色）GAPDH-CP12-PRK（麦克法兰等人，2019）。

通过测量复合物的Michaelis-Menten 动力学，可以以底物浓度依赖性的方式检测PRK活性的任何变化，而ADP-HK分析的低背景可以准确测定失活的程度。在过量Ru5P（2.5 mM ），在增加的ATP浓度下测量ADP的产生速率，通过在最初30 s内拟合一条直线来测量每条迹线的初始速率，然后排列速率并将其拟合到Michaelis-Menten 方程中。

预先形成的氧化配合物在所有ATP浓度下均显示出零可测活性，还原后的配合物显示出K M 为40±2 µM，且V max 为13.6±0.3 s -1的活性。这些值与氧化配合物相对应当完全不激活PRK活性且灭活与ATP浓度无关时，当复合物被化学还原时，磷酸核糖激酶被激活并符合Michaelis-Menten 动力学，通过在ATP浓度增加时显示出增加的活性直至达到最大速度。

结论

此处描述的方案证明了如何将来自滨海T 草的ADP-己糖激酶的特异性用于偶联酶反应以测量ATPase或激酶活性。该测定所需的材料和设备通常均可获得，从而无需进行敏感测定即可获得通过购买昂贵的商业试剂盒，该检测可将ADP快速化学计量转换为可连续测量的吸光度信号，并且高特异性和灵敏度可确保低背景并因此进行准确的动力学测量。

菜谱

反应缓冲液
50 mM Tris

150 毫米氯化钠

10 毫米MgCl 2

pH值7.9

将6.02 g Tris ，8.76 g NaCl 和0.95 g MgCl 2 溶解在1 L超纯水中

ATPase /激酶
例如，使用Pierce BCA（二辛可宁酸）测定法（Thermo Fisher）确定ATPase /激酶的浓度，并在反应缓冲液中以100 µM 的储备浓度制备ATPase /激酶。

1,000单位/ ml G6PDH
A. 溶解冻干粉G6PDH在100 Myueru反应缓冲

b。存放在4°C并在1个月内使用

50 mM NAD +
A. 溶解内容物的25mg的小瓶753 Myueru超纯水

b。分装成80 µM等分试样，并在-80°C下保存

100 毫米ADP
A. 溶解100毫克ADP进入2.34毫升超纯水

b。分装成100 µl等分试样，并在-80°C下储存

100 毫米ATP
A. 溶解100毫克ADP进入1.81毫升超纯水

b。分装成100 µl等分试样，并在-80°C下储存

1 M葡萄糖
实验当天将180 mg的D-葡萄糖溶解到1 ml的反应缓冲液中

2x测定试剂（2.5 ml）
50 µg / ml ADP-HK

20 毫米葡萄糖

800 µM NAD +

8个G6PDH

25添加微米的升5毫克/毫升ADP-HK，将50μl的1M葡萄糖的升，40微升50 毫NAD + ，20微升的1 ，000单位/ ml G6PDH和2.36毫升缓冲盐水溶液的

注意：该测定法是在给定条件下开发的，但是可能存在一些变异.G6PDH在pH 4.0的条件下可在数小时内保持稳定（Souza等人，2002），而ADP-HK最高可保持稳定。 100 °C（Kengen et al。，1995）。

致谢

这项工作得到了BBSRC博士培训计划拨款（BB / J014575 / 1）的支持，并且是McFarlane 等人（2019）先前工作的主题。

竞争利益

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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2. 肯尼亚发电公司，SW，Tuininga ，JE，德博克，FA，施塔姆斯，AJ和De Vos的，WM（1995）。纯化和表征了一种新的ADP依赖性葡糖激酶从热古细菌激烈热球菌。 Ĵ 生物学化学270（51 ）：30453-30457。

3. 科恩伯格，A。和定价者，WE，小（1951）。酶促磷酸腺苷及2 ，6 -Diaminopurine核糖核苷。 Ĵ 生物学化学193（2）：481-495。

4. Kumagai ，K.，Kojima，H.，Okabe，T.和Nagano，T.（2014）。利用酶联荧光检测开发糖基转移酶的高灵敏度，高通量分析。Anal Biochem 447：146- 155。

5. McFarlane，CR，Shah，NR，Kabasakal ，BV，Echeverria，B.，Cotton，CAR，Bubeck ，D.和Murray，JW（2019）。加尔文-本森循环中光诱导的氧化还原调节的结构基础。蓝藻 PROC国家科科学院科学美国阿116（42）：20984-20990。

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7. Souza，MA，Ribeiro，MZ，Silva，DP，Pessoa，A.，Jr。和Vitolo ，M。（2002）。pH对己糖激酶和葡萄糖6磷酸脱氢酶稳定性的影响， Appl Biochem Biotechnol 98- 100：265-272。