材料和试剂

1. Eppendorf管

2. 细菌培养桶e（Southern Labware，目录号：110178）

3. BL21主管大肠杆菌（新英格兰生物实验室，目录编号：C2530H）

4. LB汤（Thermo Fisher，商品目录号：108500001）

5. LB琼脂氨苄青霉素100（Sigma-Aldrich，目录号：L5667）

6. IPTG（Sigma-Aldrich，目录号：I6758）

7. 氨苄西林100 mg / ml（西格玛奥德里奇，目录号：A5354）

8. 谷胱甘肽琼脂糖（Thermo Fisher，Pierce，目录号：16100）

9. 细菌的蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8465）

10. PGEX-4T1 GST-融合载体（Sigma-Aldrich公司，目录号：GE28-9545-49）

11. PBS（龙沙，Bio Whittaker公司，目录号：BW17516F）

12. IP裂解缓冲液（Thermo Fisher，Pierce，目录号：87787）

13. PKA（Sigma-Aldrich，目录号：P2645-400UN）

14. Laemmli SDS样本缓冲区，减少了6倍（Alfa Aesar ，目录号：J61337-AC）

15. BES（Thermo Fisher，BioReagents ，目录号：BP501500）

16. EGTA（Tocris Bioscience，目录号：28-071-G）

17. MgCl 2 （Thermo Fisher，目录号：AB0359）

18. ATP（西格玛奥德里奇，目录号：A7699）

19. 磷酸肌酸（Sigma-Aldrich，目录号：P7936）

20. DTT（西格玛奥德里奇，目录号：D9779）

21. 预制蛋白梯（Thermo Fisher，目录号：26616）

22. 15％标准的Tris-HC 升蛋白凝胶（Bio-Rad公司，目录编号：3450019）

23. 10x Tris / Tricine / SDS运行缓冲液（Bio-Rad，目录号：1610744）

24. 10X的Tris /甘氨酸转移缓冲液（Bio-Rad公司，目录编号：1610734）

25. 甲醇（Thermo Fisher，Fisher Chemical，目录号：A412-500）

26. 硝酸纤维素膜（Bio-Rad，目录号：1620115）

27. TBS-T（伯乐，目录号：BUF028）

28. BSA（赛默飞世尔，生物试剂，目录号：BP1600100）

29. 磷酸-PKA减去RRXS抗体（Cell Signaling Technology，目录号：9624）

30. 过氧化物酶山羊抗兔IgG（Jackson ImmunoResarch ，目录号：111-035-144）

31. Clarity ECL（Bio-Rad，目录号：1705060）

32. 激酶缓冲液（请参阅食谱）

33. IPTG解决方案（请参阅食谱）

配套设备

Eppendorf管冷冻离心机（Sorvall ，Legend RT，SO-LEGRT）
Eppendorf管式加热器（实验室管线，多段加热器，LV40429530）
摇动培养箱设置为37°C（Thermo Scientific，MaxQ 5000，SHKE50007）
水浴或干浴温度设置为37°C（Boekel Scientific，小型水浴，290100）
超声波仪（布兰尼克超声浴，CPX-952-116R）
Eppendorf管旋转器（Boekel Scientific，科学旋转管旋转器，UX-51202-00）
微量离心机（Thermo Scientific，accuSpin Micro 17，13-100-676）
迷你转运蛋白（Bio-Rad）
Mini-PROTEAN Tetra细胞（Bio-Rad）
ChemiDoc XRS +系统（Bio-Rad）

软体类

ImageLab（Bio-Rad）

程序

转型
在冰上解冻BL21感受态细胞。
结合50 Myueru BL21细胞与100毫微克质粒可以表达/诱导细菌（即，包含Laclq 基因序列中防止表达直到IPTG诱导），在本例中，GST载体（pGEX-4T1）随着基因的兴趣（本例中为Profilin-1），并在冰上孵育30分钟。
使用水浴或加热块在42 °C加热冲击混合物45 s。
将混合物放回冰上2分钟。
将细菌混合物孵育200 MYU大号中LB肉汤在振荡培养箱1个小时以300rpm和37℃（确保混合物不是在气密管）。
该混合物所有镀到LB琼脂平板含适当的抗生素，在我们这里，氨苄青霉素（终浓度为100 MYU 摹/ ml）和传播直到板干。
在37°C下孵育过夜（确保将板倒置）。

蛋白质诱导和提取
单菌落从这里选择细菌板并生长在第3 毫升中LB肉汤和合适的抗生素Overnig 高程（氨苄青霉素终浓度100 MYU ģ / ml）的细菌培养管在振荡培养箱中于37℃（确保管不是气密的）。
1送ML 中此溶液中并生长在44毫升LB肉汤和合适的抗生素（氨苄青霉素终浓度100 MYU ģ / ml）的在37℃下在旋转恒温箱中于300rpm下3 H.
加入1：1,000 100 mM IPTG以诱导表达到混合物中，并以300 rpm孵育另外3 h。
将细菌溶液转移到50 ml离心管中，并在3500 xg 和4°C下离心20分钟以收集细菌。
丢弃目标。
细菌颗粒重悬在850 MYU 大号知识产权裂解液用50 Myueru /毫升细菌蛋白酶抑制剂并转移到微量的Eppendorf管。细菌蛋白酶抑制剂应该制备和使用新鲜各一次。
超声处理10秒钟（不加热），在冰上静置2分钟，再重复2次。此步骤用于剪切DNA和破坏细菌。
在4°C下以17,000 xg离心30分钟。
收集收集。
注意：可以在凝胶和考马斯亮蓝上电泳，以确认蛋白质表达。

蛋白质纯化和激酶处理准备
〜400分装Myueru 谷胱甘肽琼脂糖（GST珠浆料）至eppendorf管。
两次洗具500 Myueru 冷PBS，离心小珠落洗涤之间在8000 XG 1分钟。
用500μlIP 裂解缓冲液洗涤一次，然后以8,000 xg的速度离心珠1分钟。
加入IP裂解缓冲液以制成50/50的珠子浆液和IP裂解缓冲液。
160传输Myueru 中该浆液进入一个新的离心管中，加入540 Myueru 知识产权裂解液IT和50 Myueru /毫升细菌蛋白酶抑制剂。细菌蛋白酶抑制剂应该制备和使用新鲜各一次。
300添加Myueru 细菌裂解物和旋转采用旋转翻滚式旋转器完以30rpm 2小时。在4 ℃下
小珠落在离心8000 XG 1个分钟，洗三次，500 Myueru IP裂解液离心小珠落洗涤之间在8000 XG 1分钟。
两次洗具500 Myueru 激酶缓冲液离心小珠落洗涤之间在8000 XG 1分钟（留出50/50浆）。

激酶治疗
通过添加200μl 激酶缓冲液（400UN PKA作为干燥沉淀物）来重构PKA，并在室温下静置20分钟，这就是您的PKA解决方案。
等分试样2 Eppendorf Tubes与40μl 含上一节目的蛋白质的GST珠溶液，将一个管用作阴性对照。
加入5 Myueru pKa的解决方案要一管（分装其余部分的PKA溶液倒入5 Myueru 并储存在- 80 ℃，供将来使用）和5 Myueru 激酶解决方案（即，激酶解决方案通过无PKA）其他。请注意，PKA易冻融且在第一次冷冻后会失去一些活性，建议的等分试样量每次可用于一个治疗组，因此无需冻融.PKA冷冻> 1 后不应使用年在-80 °C
使用水浴或加热块在32 °C下孵育1小时，并每15分钟使用涡旋混合以确保珠子不会沉淀到管底部。
两次洗具500 Myueru IP裂解液缓冲液离心小珠落洗涤之间在8000 XG 1分钟，并留下在50/50浆。
30等分Myueru 解决方案到新管，并添加60 Myueru 中1.5X Laemilli 缓冲区。
煮沸5分钟，以17,000 xg离心5分钟。
转移到新鲜的微量离心管Eppendorf管中。

免疫印迹
将5μl 蛋白质梯子上样到15％凝胶中，然后将30μl 蛋白质样品（上一节最后一步中的上清液）上样到相邻的孔中。
用1x运行缓冲液填充PROTEAN并在200 V下运行〜45 分钟（可能会或多或少的时间，直到样品缓冲液中的蓝色染料从凝胶底部流出为止）。这些设置用于我们感兴趣的蛋白质，其他蛋白质的设置可能有所不同。
通过在100 V 下使用充满1x转移缓冲液（80％转移缓冲液，20％甲醇）的Trans-Blot将蛋白质从凝胶转移到PVDF或硝酸纤维素膜上（我们使用硝酸纤维素膜）约1.5 h（可能或多或少取决于大小蛋白质的利息）。确保凝胶和膜被放置在正确的方向，即，凝胶应该更接近于负电荷源（通常是黑色部分转移盒应该是最接近凝胶）组成，这些设置用于我们感兴趣的蛋白质，其他蛋白质的设置可能有所不同。
在感兴趣的蛋白质周围切膜（在蛋白质重量上下分别有1-2个阶梯带），并在室温下用5％BSA的TBS-T阻断30分钟，然后摇动。我们使用了一个空的显微镜盖玻片玻片盒进行孵育膜（总封闭缓冲液体积1.5米升）。一个在我们的例子，GST-Pfn1 HAS〜41的分子量的kd ，使膜切成30至70 kD的。取决于你的蛋白的感兴趣，一个的质量可能需要根据蛋白质阶梯切割不同的部分。
过夜孵育5 Pasento BSA的TBS-T以1：1000 PRRXS 底物抗体在4 。℃。与摇摆运动以10rpm使用同一容器如先前所描述，我们使用1.5M的大号阻断溶液和1.5 MYU 大号抗体。
用TBS-T清洗5分钟。
孵育随着5 Pasento BSA在TBS-T为1项小时，在室温下的以1：1 ，000抗兔过氧化物酶抗体随着摇摆。运动在10下采用相同的容器如前所述，我们用1.5米大号封闭液和1.5 MYU 大号抗体。
用T BS-T 洗涤3-4 次，每次洗涤5分钟。
清晰ECL溶液加到膜，并培育1个分钟，在室温Erature 。
膜图像（实施例结果示于图茜2，PKA治疗GST-Pfn1检测到由PRRXS 抗体，采用BioRad公司ChemiDoc ）。
D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902980--1319 David Gau 837266 \图jpg \图2.jpg

2.图PRRXS 抗体检测PKA磷酸化GST-Pfn1 。GST-Pfn1被磷酸化，通过PKA和检测者PRRXS 抗体而激酶缓冲溶液处理GST-Pfn1（阴性对照）不进行检查。考马斯从这些样品也被显示了要图1示出获得磷酸带的下拉量。

资料分析

比较经过PKA处理的蛋白质样品和未经PKA处理的样品的泳道。
如果PKA处理的样品中的条带强度更高，则根据pRRXS 磷酸特异性PKA抗体，样品的磷酸化增强（在我们的案例中，在图2中，我们发现在用PKA处理后没有谱带强度达到全谱带强度）。

菜谱

激酶缓冲液
˚F 伊纳勒集中所有组件列表如下：

20 mM BES pH 7（以粉末形式开始，在水中稀释，并在适当的pH值下稀释至合适的浓度）。它是激酶缓冲液的基础

20 mM EGTA（以粉末形式开始，添加到BES溶液中）

6 mM MgCl 2 （以粉末形式开始，添加到BES溶液中）

5 mM ATP（以粉末形式开始，添加到BES溶液中）

10 mM磷酸肌酸（以粉末形式开始，添加到BES溶液中）

1 mM DTT（以粉末形式开始，添加到BES溶液中）

IPTG解决方案
用水和IPTG粉末制成100 mM IPTG溶液，并储存在-20 °C

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（PR）的资助（2R01CA108607）。DavidGau得到了美国国家科学基金会的博士前研究金（2012139050）和NIH心血管生物工程博士后培训资助（DG的2T32HL076124）的支持。。

竞争利益

作者没有竞争利益要报告。

参考文献

豪，AK（2004）为基础的肌动蛋白调节细胞迁移到CAMP / PKA。生物化学生物生物物理学ACTA 1692（2-3）：159-174。