材料和试剂

的Eppendorf ® 管（1.5 毫升，明确管）（Greine ř生物之一，目录号：616-201）
磁力搅拌板
pH试纸
Tris Base（20 mM，pH 7.4含HCl）（Fisher Scientific，目录号：77-86-1）
MgCl 2 （VWR，目录号：25108.260）
Dowex（Sigma-Aldrich，目录号：44340）
绝对乙醇（VWR，目录号：20821.330）
去离子水中2 O（英里升I-Q纯）
腺苷3'5'-环一磷酸钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A6885，储存-20 °C ）
8- [ 3 H] -cAMP底物（Amersham Biosciences ，目录号：TRK304-1mCi，储存-20 °C ）
蛇毒（Opiophagus Hannah）（Sigma，目录号：V0376，储存-20 °C ）
Opti-Flow SAFE 1闪烁剂（Fisher Scientific（化学品），目录号：SC / 9255/21，存储：室温）
NaOH（Fisher Scientific，目录号：4920/53）
HCl（Fisher Scientific ，目录号：H / 1200 / PB17）
缓冲区A（请参阅食谱）
缓冲区B（请参阅食谱）
Dowex阴离子交换树脂（请参见配方）
蛇毒（见食谱）
cAMP 底物解决方案（请参阅食谱）

设备

TRI-CARB 2900TR液体闪烁分析仪（Packard）（图2）
更先进的型号过时存在（例如，TRI-CARB 4910TR 110V液体闪烁计数器，惠普）

网络古尔2. TRI-CARB 2900TR液体闪烁仪（惠普）

小号oftware

1. Microsoft Excel

程序

激活Dowex 1x8-400阴离子交换树脂。
准备大批量的Dowex树脂：

将400 g Dowex树脂溶于4 L 1 M NaOH中。
在室温下混合溶液15分钟。
注意：要混合，使用磁力搅拌板。

使树脂在重力作用下沉降并除去上清液。
用4 L去离子H 2 O 洗涤树脂至pH 7.0，用pH纸测量。
注意：这最多需要30次清洗。

在pH 7.0下，使树脂沉降并除去上清液。
将树脂悬浮在4 L 1 M HCl中，并在室温下混合15分钟。
使树脂沉淀并除去上清液。
最后，用pH试纸在4 L的去离子H 2 O 3x中洗涤树脂直至pH值为3.0。
停止混合每次洗涤后的溶液中，使树脂沉降小心地除去去离子水中之前2 与新鲜的去离子再注入H 2 O和2 O.
将树脂存储在4 °C的去离子H 2 O中。
添加乙醇和去离子水中2 O操作树脂以1：1：1的比例（DOWEX：乙醇：DH 2 O）在测定前使用。
一式三份标签1.5毫升的Eppendorf ® 每个样品管用于分析（即，三个技术重复），包括空格。在冰上孵育。
解冻所有正在使用的储备溶液。
将水浴加热至30 °C。
准备要分析的样品。
在50 µl缓冲液A中将适当体积/浓度的PDE样品孵育（配方1）。
注意：应进行试点研究以评估所用样品中含有PDE的最佳浓度。纯化的蛋白/过表达PDE的细胞裂解物的典型浓度范围是：总体积50μl缓冲液A 中为1-10μg / μl 。

如果要研究抑制剂的作用，请在40 µl缓冲液A和10 µl适当稀释的抑制剂中配制样品。
仅对空白添加50 µl缓冲液A。
将50 µl cAMP底物溶液（配方5）添加到每个含PDE的样品中（包括空白）并涡旋。放射性标记的cAMP 在混合将hydroly Ž ED到5'-AMP中含有的PDE样品。
将样品在30 °C的水浴中孵育10分钟。
以终止反应（即，在100中样品的PDE灭活），煮沸样品℃下2分钟。
在冰上冷却样品15分钟。
向每个样品中添加1 mg / ml蛇毒（即0.2 mg / ml 终浓度），包括空白，并混合。
注意：蛇毒将5'-AMP磷酸化为腺苷，防止5'-AMP再环化为cAMP。

将样品在30 °C的水浴中再孵育10分钟。
向每个样品中加入400 µl Dowex：乙醇：dH 2 O混合物（aka Dowex阴离子交换树脂）并涡旋。确保将Dowex阴离子交换树脂完全悬浮后再添加到样品中。Dowex阴离子交换树脂可将带负电荷的cAMP与不带电荷的腺苷分开。
再在冰上冷却样品15分钟。
充分涡旋样品并在10,000 xg 的温度下于4 °C于冷冻台式离心机中离心3分钟。
同时，加入1ml的Opti-FLOW SAFE 1个闪烁剂至新鲜标记1.5毫升的Eppendorf ® 管中。
除去150 μ从PDE含有反应样品澄清的上清液l（见步骤14 ），并添加到一个含有1适当闪烁管毫升的Opti-FLOW SAFE 1个闪烁流体。
彻底涡旋所有样品。
使用TRI -CARB 2900TR液体闪烁分析仪（图2），测量/计数未结合的8- [ 3 H]-腺苷。这决定了cAMP水解的速率，从而决定了PDE的活性。
分析数据（即，确定PDE活性。参见表1和2例如设置/数据分析。）

表1 。实验设置示例

样本

缓冲

缓蚀剂

cAMP底物解决方案

蛇毒和杜威

正控制

含PDE的样品

+

+

+

测试

含样品和抑制剂的PDE

+

+

+

+

负[空白]控制

样品中没有PDE

+

+

+

数据分析

判断闪烁计数器ř esults （小号EE表2）
（实施例的结果：奥马等人2019。）
一个。使用不含PDE的空白反应样品，将每个样品正确校正为背景。

b。使用背景校正计数确定初始反应速率（即，cAMP 水解/ min）。

C。为了表达结果cAMP的水解我N pm个/分钟-1 / 毫克-1 蛋白，预先确定通过选定的标准方法（在测定法中使用的样品的蛋白质浓度例如，Bradford测定，BCA测定，等等）。

d。因此，使用以下公式确定样品中特定PDE的活性：

PDE活性的cAMP = hydroly Ž ED以pM /分钟-1 /毫克-1
2.61代表Dowex实用浓度
10表示的cAMP（以pM）hydroly的浓度Ž 版在100 μ 升在10分钟内
e。要确定所选PDE抑制剂的作用，直接将未抑制的对照反应与被抑制的对照反应进行比较，并以未抑制的对照的百分比表示。

表2 。示例数据集。含PDE的样品在100μl样品中总共含有5μg 纯化的PDE蛋白。

样品编号（一式三份）

样品编号

8- [ 3 H]-

腺苷

计数

平均计数

PDE活动

（PM /分钟- 1 /毫克-1 ）

PDE活动-模拟（背景扣除）

差异百分比与PDE控制

空白

1000

平均总数

100000

1个

1505

2

嘲笑

1495

1500

26.1

3

1500

1个

9500

2

偏二氟乙烯

10000

10000

469.8

443.7

100

3

10500

1个

2750

2

PDE + PDE抑制剂

3000

3000

104.4

78.3

17.65

3

3250

笔记

3 H 1 （rit）
半衰期：12.3年

比活度：3.59E + 14 Bq.g -1

菜谱

缓冲液A
20毫米Tris-HCl（pH 7.4）

储存在4 °C

缓冲液B
20毫米Tris-HCl（pH 7.4）

10毫米MgCl 2

储存在4°C

Dowex 阴离子交换树脂
Dowex：乙醇：去离子H 2 O [1：1：1的比例]

储存在4 °C

蛇毒液（10毫克/ ml储备;从眼镜王衍生）
用缓冲液A稀释至1 mg / ml

储存在-20°C

cAMP 底物溶液
2 µl“冷” cAMP（即未标记）[1 mM cAMP]

3 µl“热” cAMP（即，标记有8- [ 3 H]）[1 µCi / µl]

995 µl缓冲液B

储存在-20°C

致谢

康纳·布莱尔（Connor Blair）由工业博士生资助，该奖学金由Portage Glasgow Ltd和格拉斯哥大学医学，兽医与生命科学学院提供支持。

利益争夺

作者没有竞争利益。

参考文献

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