材料和试剂

注意：除非另有说明，否则所有材料和试剂均应保持在室温下。有关试剂的保存期限和存储温度，请参阅制造商的说明。

Advantus T形针（Fisher Scientific，目录号：S174301）
轻型纸巾（乔治亚太平洋，布朗尼，目录号：29221）
猎鹰50毫升锥形离心管（Corning 352070）（Fisher Scientific，目录号：14-432-22）
10厘米和15厘米盘子（Midwest Scientific，TPP，目录号分别为TP93100和TP93150）
伯爵夫人细胞计数室载玻片和台盼蓝（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，货号：C10228）
薄壁聚丙烯管（25 x 89毫米）（贝克曼库尔特（Beckman Coulter），目录号326823）
超透明管（25 x 89毫米）（贝克曼库尔特（Beckman Coulter），目录号344058）
超清晰管（14 x 89毫米）（Beckman Coulter公司，目录号：344059）
优质微量离心管（1.7毫升）（Fisher Scientific，Midwest Scientific，目录号：AVSC1510）
多孔板（96孔）（Midwest Scientific，TPP，目录号：TP92696）
受保护的一次性手术刀（不锈钢刀片）（Fisher Scientific，Aspen Surgical Bard-Parker，目录号：372610）
Immobilon-P转移膜（Millipore，目录号：IPVH00010）
印迹纸（Fisher，Whatmann ，目录号：09-301-404）
无菌细胞滤网（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand ，目录号：22-363-548）
无菌移液器5 ml，10 ml和25 ml（Falcon，目录号分别为357543、357551、357525）
AvantGuard 低结合力屏障技巧
10 μ 升万向长（中西部科学，目录号：ASAVANBARTIPS AV10R-H ）

20 μ 升通用（中西部科学，目录号：ASAVANBARTIPS AV20H ）

200 μ 升通用（中西部科学，目录号：AV200-H ）

1 ，250 μ 升通用（中西部科学，目录号：AV1250H）

凝胶圆头（Midwest Scientific，目录号：MPT1000）
成年小鼠
笔记：

雄性和雌性小鼠均可用于该方案。
在该方案中以腓肠肌为例。但是，该程序对于任何其他类型的肌肉都是可行的。
乙醇140证明（Greenfield Global的Pharmco ，目录号：111000140）
乙醇200证明（Greenfield Global的Pharmco ，目录号：111000200）
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Corning，目录号：21-031-CV）
胶原酶P（100毫克）（罗氏（Roche），目录号：11213857001）
Dispase II（中性蛋白酶，II级）（Roche，目录号：049420780001）
CaCl 2 （Sigma，目录号：C1016-100G）
NaCl（Fisher Scientific，目录号：S271）
Dulbecco的Modification Eagles培养基（DMEM）（Corning，目录号：15-013-CV）
二甲基亚砜（DMSO）（Fisher BioReagent ，目录号BP213-100）
胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：10437-028）
青霉素-链霉素（10,000 U / ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：15140-122）
GlutaMAX 补充剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：35050-061）
Stericup Quick release-GP无菌真空过滤系统（Millipore，目录号：S2GPU05RE）
Triton X-100溶液（10％）（Sigma，目录号：93443）
TrypLE Express酶（无酚红）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：12604-013）
BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Pierce，目录号：23225）
Criterion TGX无污蛋白凝胶
10％18孔Midi-gel （Bio-Rad，目录号：5678034）

12％18孔Midi-gel （Bio-Rad，目录号：5678044 ）

10％10孔微型凝胶（Bio-Rad，目录号：4568033 ）

12％10孔微型凝胶（Bio-Rad，目录号：4568043 ）

Precision Plus Protein，所有蓝色预染蛋白标准品（Bio-Rad，目录号：1610373）
Precision Plus蛋白，未染色的蛋白标准品（Bio-Rad，目录号：1610363）
Tris base（Bio-Rad，目录号：1610719）
盐酸（Fisher Scientific，目录号：A144S-500）
甘氨酸（伯乐，目录号：1610718）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Bio-Rad，目录号：64086876）
Laemmli 样品缓冲液（4x）（Bio-Rad，目录号：1610747）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma / Millipore，Roche，目录号：10708984001）
甲醇（Fisher Scientific，目录号：A4121）
脱脂奶粉（Labscientific ，目录号：M0842）
牛血清白蛋白（BSA）组分V（罗氏（Roche），目录号：03116964001）
一抗和二抗（表1）
表1.一抗和二抗

抗体

主办

公司

目录编号

CD9

鼠

BD生物科学

553758

CD81

鼠

圣诞老人

sc-166029

阿力克斯

兔子

d' a zzo Lab

阿力克斯

Flotillin 1

鼠

BD生物科学

610820

Syndecan 1

兔子

生活技术

36-2900

Syntenin 1

兔子

密理博/西格玛

MABN160

大鼠HRP

驴

杰克逊· 伊姆。研究实验室

112-035-003

鼠HRP

山羊

杰克逊· 伊姆。研究实验室

115-035-044

兔HRP

山羊

杰克逊· 伊姆。研究实验室

111-035-144

蔗糖（Fisher Scientific，Fisher Chemical，目录号：S5-500）
cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物（Millipore / Sigma，Roche，目录号：11697498001）
1.0 M醋酸镁溶液（Mg（Ac）2 ）（Sigma，目录号：63052-100ml）
三氯乙酸（TCA）（Sigma，目录号：91228-100G）
Tween-20（10％）（Bio-Rad，目录号：161-0781）
SuperSignal West Femto （赛默飞世尔科技，目录号：34096）
胶原酶P储备溶液（4x）（请参阅食谱）
Dispase II储备溶液（10x）（请参阅食谱）
CaCl 2 （1 M）（请参阅食谱）
消化混合物（请参见食谱）
完全培养基（请参见食谱）
冷冻介质（请参见食谱）
外泌体免费FBS （请参阅食谱）
完成è xosome培养基（见食谱）
0.1％Triton X-100 （请参阅食谱）
BCA试剂工作溶液（请参阅配方）
1.0 M DTT （请参阅食谱）
0.5 M Tris-HCl，pH 7.4 （请参见配方）
蛋白酶抑制剂原液（100x）（请参阅食谱）
10 mM Tris-HCl pH 7.4 / 1 mM Mg（Ac）2 （请参阅食谱）
蔗糖梯度工作溶液（每个样品11毫升）（请参阅食谱）
100％TCA （请参阅食谱）
80％乙醇（请参阅食谱）
Western blot运行缓冲液（10x）（请参阅配方）
Western blot运行缓冲液（1x）（请参阅配方）
传输缓冲区（10x）（请参阅配方）
传输缓冲区（1x）（请参阅配方）
20倍Tris缓冲盐水（TBS）（请参阅食谱）
TBS-T（1 L）（请参阅食谱）
阻塞缓冲区（请参见食谱）
3％BSA-TBS-T （请参阅食谱）
SuperSignal West Femto 解决方案（每层膜）（请参阅食谱）

设备

带乙烯基解剖垫的铝解剖盘（Carolina，目录号：629004）
解剖工具：消毒剪刀和钳子（Roboz ，目录号：RS-5983，RS-5877，RS-5358，RS-5135）
O 2 / CO 2 培养箱（三洋，货号：MC0-18M）
生物安全罩1300系列A2（Thermo Scientific，型号：1377）
水浴Isotemp 220（Fisher Scientific，目录号：FS220）
冰桶（不需要特定品牌）
带有转子FA-35-6-30（Eppendorf，目录号：022620659）和转子5430 / R FA-45-48-11（Eppendorf，目录号：5427754008）的5430R离心机
Countess自动细胞计数仪（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：C10227）
超速离心机Optima XPM（贝克曼库尔特，目录号：A99842）
Alphapette 移液器
0.5-10 μ 升（中西部科学，目录号：ASALPHA A-10 ）

2-20 μ升（中西部科学，目录号：ASALPHA A-20）

20-200 μ 升（中西部科学，目录号：ASALPHA A-200）

100-1,000 μ 升（中西部科学，目录号：A-1000）

Pipetboy acu 2（Fisher Scientific，Integra Biosciences Corp，目录号：155015）
Criterion垂直电泳池（midi）（Bio-Rad，目录号：NC0165100或1656001）
Mini-Protean四垂直电泳池（Bio-Rad，目录号：1658004）
PowerPac HC大电流电源（Bio-Rad，目录号：1645052）
Chemidoc MP成像系统（Bio-Rad，目录号：12003154）
Mini Trans-Blot电泳转移池（Bio-Rad，目录号：1703930）
带板电极的Criterion Blotter（Bio-Rad，目录号：1704070）
培养容器为w ^ 西部时代BLO TS; 移液器吸头架的盖子
50毫升试管架
Fluostar Omega多模式酶标仪（BMG Labtech）
有机玻璃（自制）
肚皮舞者摇床（IBI科学，目录号：BDRAA115S）
搅拌器（Fisher Scientific，Isotemp ，目录号：11-100-49S）
搅拌棒（Fisher Scientific，目录号：50-999-347）
软件

Image Lab，版本6.0.1 build 34（2017）（Bio-Rad）
欧米茄（Omega）3.00R2版（BMG Labtech）
Omega A 分析，版本2.40，内部版本13 （BMG Labtech）

程序

肌肉切除
根据机构批准的准则对小鼠实施安乐死。
注意小号：

雄性和雌性小鼠均可使用。
对于该方案，使用了溶酶体贮积病唾液酸病的基因工程动物模型（de Geest 等，2002），其进入了C57Bl / 6或FVB背景。
后肢肌肉的隔离不需要使用生物安全柜。无需无菌条件。
将鼠标向下俯卧（解剖侧朝上）到解剖垫（图1A）。小号祈祷用70％乙醇鼠标。
注意：要分离其他类型的肌肉，请以仰卧姿势（将腹部朝上）固定在解剖板上。

去除后肢的皮肤，露出肌肉，然后轻轻切掉后肢的筋膜。找到跟腱，并用镊子将其与骨头分开（图1B）。
注意小号：

无需为此过程剃毛。
没有去除皮毛/皮肤暴露肌肉的标准方法。我们使用的过程如下：在髋关节的水平处将皮肤切成1厘米左右的距离，并小心地将皮肤拉向脚踝，以暴露腿部肌肉。
切断跟腱，并小心地将GA肌肉向上拉向膝盖关节，并在腱处将其切断（图1C和1D）。
注意：由于GA和比目鱼肌腱相互连接（形成跟腱），因此无法将它们分开。

去除比目鱼肌（肌肉较暗的红色部分）。当在膝关节处切断GA和比目鱼肌时，比目鱼将与GA肌肉分离，可以将其抬起并在跟腱处切断，以将其与GA肌肉分开（图1E和1F）。
注意：去除比目鱼肌可从剩余的GA肌肉中分离出更纯净的成纤维细胞。

称重一个装有5 ml DPBS的50 ml管。
合并双腿的GA肌肉，然后将它们转移到预先称重的50 ml试管中，然后再次称重。将试管放在冰上。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902893--1352亚历山德拉·达佐846731 \ Figs jpg \图1.jpg

图1. 成年小鼠后肢的GA肌肉解剖图。答：此处显示的图片显示了去除毛皮/皮肤之前的鼠标腿。B.去除毛皮/皮肤以暴露GA肌肉（虚线）和跟腱，该腱由一对镊子与骨头分开。C.跟腱断裂。D. GA /比目鱼肌向上拉，并在膝关节处切断。E. 示出孤立的GA肌肉，其比目鱼肌（暗红色和虚线）仍被附着。F. GA肌肉去除比目鱼的后示出。

从腓肠肌分离成纤维细胞
通过将所有必要的工具放入内部来准备生物安全罩，包括管架，移液器，碗碟，管子，小费箱。
从无菌包装中取出两把手术刀，并将其放在通风橱中。
将一个10厘米的盘子放在通风橱中。
取出无菌镊子，将两只GA肌肉转移到10 cm的培养皿中。
注意：组织中含有残留量的DPBS，可在手术过程中保持组织湿润。

用手术刀切碎肌肉，直到变成细糊状。
用手术刀将切碎的肌肉膏转移到50毫升试管中，盖好试管，然后放回冰上。
注意小号：

一个。不需要额外的DPBS用手术刀转移切碎的肌肉组织。

b。如果需要处理其他肌肉样本，请重复步骤B4-B6，并将每种切碎的肌肉糊状物转移到新的50毫升试管中。

在每个试管中加入消化混合物；3.5倍体积/ mg组织（小号EE食谱1-4）孵育在37°C 45分钟。
注意：另外，组织解离器可用于解离肌肉。

在45分钟的消化期间，组织悬浮液需要每10分钟通过用5 ml移液管上下吸移进行混合。这将促进组织的完全解离。
向每个试管中加入20 ml完全培养基以终止酶消化（请参见第5条）。
放置70 μ 米细胞过滤器上的新的50ml管中。
通过过滤器过滤组织/细胞悬液，并用另外的5.0 ml完全培养基冲洗。
在4 °C下以300 xg 离心组织/细胞悬液10分钟。
将含有细胞的沉淀重悬于10 ml完全培养基中。
将重悬的沉淀物接种在10厘米的培养皿中（第0代，P0），并在37 °C / 5％CO 2 /3％O 2 下孵育。
注意：由于骨骼肌中O 2 含量约为2.5％（Mas-Bargues et al 。，2019），因此要在低氧水平下培养成纤维细胞，以使培养条件尽可能接近生理条件。

成纤维细胞培养，胰蛋白酶消化和扩增
培养P0成纤维细胞，直至100％融合，再加1天。
注意小号：

一个。常规培养P0处的原代成纤维细胞，直至100％融合，再加1天（仅限于P0），以从任何污染细胞中清除培养物。

b。一对后肢腓肠肌的成纤维细胞（P0）的预期产量范围为1至5 x 10 6个细胞，具体取决于所用小鼠的年龄和背景。

当细胞准备好扩增时，去除培养基并用10 ml DPBS冲洗细胞。
注意：请确保除去所有DPBS，因为它可能会干扰TrypLE 表达的酶活性。

向培养皿中加入1.0 ml TrypLE ，并在37 °C 下孵育5分钟。
点击盘子的侧面，并在显微镜下检查细胞是否完全分离。如有必要，在37 °C 下再孵育5分钟。
加入10 ml完全培养基以灭活TrypLE ，并将细胞转移到50 ml管中。
在室温下以300 xg离心10分钟。
注意：此时，P0细胞可以重悬于冷冻培养基中，以备以后使用（参见配方6）。

将细胞重悬于10 ml完全培养基中。
如果需要，细胞可以通过混合10被计数μ 升的细胞悬浮液用10 μ 升台盼蓝，并转移到伯爵夫人细胞计数器室。
注意：可以使用任何类型的细胞计数器，只要它能对活细胞进行准确计数即可。

将细胞以1.0 x 10 5 / ml 的浓度接种，每15厘米培养皿产生2 x 10 6个细胞（20 ml）。
在37 °C / 5％CO 2 /3％O 2 下培养细胞，直至融合度达到80％-90％（第1代，P1）。
重复小号TEPS C2到C10的文化附加的传代。
注意小号：

所需的15厘米培养皿的数量取决于所需的细胞总数。例如，在P2细胞接种在2 - 4,15 cm培养皿; 在P4它们接种在15 - 30，15个cm培养皿如果需要外来体的高收率。
从初级成纤维细胞的15cm培养皿外泌体的产率是〜3 - 4 μ 克。我们建议播种20 - 25 15个cm培养皿，以获得后续分析足够的外来体。
C。P4之后，丢弃原代细胞，因为它们会改变其特性，因此不再用于任何其他实验。

粗外泌体分离
洗含有成纤维细胞15个cm培养皿（P2 - P4）用10ml DPBS。
注意：请确保除去所有DPBS，因为它可能会干扰TrypLE 表达的酶活性。

向每个培养皿中加入2.5 ml TrypLE ，并在37 °C 下孵育5分钟。
点击盘子的侧面，并在显微镜下检查细胞是否完全分离。如有必要，在37 °C 下再孵育5分钟。
加入10 ml完全培养基以灭活TrypLE ，并将细胞转移至50 ml管中。
在室温下以300 xg 离心细胞10分钟。
将细胞重悬于10 ml完全不含外泌体的培养基中（请参见食谱7和8）。
注意：在将FBS加入成纤维细胞培养基之前，必须先除去FBS中天然存在的所有囊泡/外泌体，因为它们会干扰进一步的实验分析。

如果需要，细胞可以通过混合10被计数μ 升的细胞悬浮液用10 μ 升台盼蓝，并转移到伯爵夫人细胞计数器室。
注意：可以使用任何类型的细胞计数器，只要它能对活细胞进行准确计数即可。

种子在外来体自由培养基中的细胞以1.5的浓度×10 6 - 2.0×10 6 每15cm培养皿中并孵育37 ℃下/ 5％CO 2 /3％Ò 2 。
16至24小时后，将条件培养基收集在冰上的50 ml管中。
注意小号：

共llected介质可以被储存在4 ° C至一周如果不立即处理。
如果在收获培养基时细胞未汇合80％，则可以在16至24小时后添加新鲜的外泌体培养基并进行收集。合并两批条件培养基以进行进一步处理。
将条件培养基在4 °C 下以300 x g 离心10分钟，然后将其转移到冰上新的50 ml管中（图2.1）。
注意：执行此步骤以消除存活细胞。

离心机中以2000 ×g下进行，在4分钟10 ℃下（图2.2）。
注意：执行此步骤以消除dad细胞。

将上清转移到一个薄壁的聚丙烯管以10,000rpm在冰上和离心机在超速离心机XG 在4 ℃下30分钟（图2.3）。
注意：此步骤可去除细胞器，凋亡小体和膜碎片。也可以使用Sorval 离心机以10,000 xg进行离心。

将上清液转移到冰上的超透明管中，并在4 °C下以100,000 xg 超速离心1.5 h（图2.4）。
注意：如果需要将外泌体置于无菌条件下，则可以将敞开的超透明管更换为带盖无菌超透明管。

用10毫升移液器小心丢弃上清液。在试管中保留约1.0 ml的液体，以免沉淀沉淀。
加入另外的1.0 ml冰冷的DPBS，并使用P 1000移液器重悬沉淀。
用冰冷的DPBS和超速离心机在4 °C下以100,000 xg 将试管加至35 ml，持续1.5 h（图2.5）。
小心丢弃上清液，将装有沉淀的试管放在冰上。
注意：沉淀应是半透明的，可能很难看清，因此应非常小心地除去上清液。

重悬沉淀在冰冷的DPBS（〜25的适当体积μ 升/ 15cm培养皿）。
外泌体可以在4 °C 下保存长达一周。长期储存应将外泌体储存在-80 °C下。
注意小号：

避免冷冻/解冻循环，这会损坏外泌体并减少其数量。如果进行多次实验，应将外泌体等分。
粗制外泌体可用于多种分析，包括蛋白质印迹和体外摄取实验。
需要时，可以对粗制外泌体进行质谱分析。运行50 μ 克在10％的Bis-Tris凝胶为约1cm到凝胶和切割用于凝胶内消化的LC-MS / MS之前，3个相等大小的条带（测序级改良的胰蛋白酶溶液）粗外来体。

定量外来体粗体以进行蛋白质印迹分析
注意：作为替代方案，可以使用纳米粒子跟踪分析（NTA）和动态光散射（DSL）来表征外泌体（Szatanek 等人，2017）。

吸管10 μ 升每白蛋白标准稀释的（见表2）以一式两份加入96孔板，以获得BCA标准曲线。

表2. BCA标准曲线的准备

白蛋白标准稀释度（mg / ml）

白蛋白股票方案

（2毫克/毫升）（μ 升）

的DDH 2 Ó （μ 升）

1.00

250

250

0.80

200

300

0.60

150

350

0.40

100

400

0.20

50

450

0.10

25

475

0.05

12.5

487.5

0.00

0.0

500

吸取5.0 μ 升0.1％的Triton X - 在DDH 100 2 ö一式两份，在96 welll板（见配方9）。
添加5.0 μ 升的的外来体样本，以含有0.1％Trito孔Ñ X - 100，产生1：2稀释。
注意：重悬的外泌体沉淀应根据制剂的最终产量进一步稀释（1：5或1:10）。

加入200 μ 升BCA工作溶液到所有的孔（见配方10）。
将板在37 °C下孵育30分钟，并使用酶标仪读取OD562处的蛋白质浓度。
平均1×10 6 初级fibrobl 的AST将产生大约3- 4 μ 克外来体可以直接再悬浮于电泳上样缓冲液（0.5 μ 升的1.0M DTT（配方11），5.0的μ 升的Laemmli 样品缓冲液（4×）和14.5 μ 升的DDH的2 O）。

Sucros e密度梯度纯化外泌体
准备蔗糖密度梯度所需的所有溶液，并将其置于冰上（请参见配方12-15和表3）。

表3.蔗糖梯度溶液

最终摩尔浓度（M）

蔗糖（克）

SGWS *体积（毫升）

2.0

2.74

4.0

1.3

2.67

6.0

1.16

2.38

6.0

0.8

1.37

5.0

0.5

0.86

5.0

0.25

0.26

3.0

*的SGW：蔗糖梯度工作溶液（见ř ecipe 13）。

重悬30至100 μ 克外来体于1.0ml的0.25M蔗糖溶液中。
通过从管的底部开始依次吸取1.5 ml的2.0 M，2.5 ml的1.3 M，2.5 ml的1.16 M，2.0 ml的0.8 M， 2.0 ml的0.5 M蔗糖。用1.0 ml含外泌体的蔗糖溶液在顶部分层（图2.6）。
使用旋转铲斗转子在100,000 x g的条件下于4 °C 离心2.5 h（图2.6）。
小心地将管子从转子中取出，然后将其放在冰上。
从梯度顶部开始收集1.0 ml馏分，然后将其转移到冰上的1.7 ml Eppendorf管中（图2.7）。
110添加μ 升100％TCA到每个管中，在室温下10分钟（见配方16）（图2.8）拌匀孵育。
在室温下以10,000 x g 离心10分钟，然后弃去上清液。
用500洗粒料μ 升预冷却的80％乙醇，上下吹吸，并将其放置在再悬浮小球于-20 ℃下10分钟（见配方17）。
在10,000 x g下于4 °C 离心10分钟。
小心除去上清液，让沉淀物风干10-15分钟。
重悬15-30粒料μ 升冰冷的DPBS。
注意小号：

用于重悬沉淀的DPBS的体积取决于原料和沉淀的大小。
对于Western印迹分析，重悬在电泳样缓冲液（每个粒料0.5 μ 升的1.0M DTT（配方16），5.0 μ 升的Laemmli 样品缓冲液（4×）和14.5 μ 升的DDH的2 O）。
根据步骤E1到E5测量蛋白质浓度。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902893--1352亚历山德拉·达佐846731 \ Figs jpg \图2.jpg

图2.从培养基中分离外来体的示意图。在连续离心步骤之后，去除细胞（1），死细胞（2）和细胞碎片（3）。将外泌体超速离心（4），并用DPBS洗涤外泌体沉淀（5）。外泌颗粒在蔗糖密度梯度上的加载（6）。超速离心并用三氯乙酸（8）沉淀后收集馏分（7）。

粗制外泌体和纯化的蔗糖梯度样品的蛋白质印迹分析
准备电泳运行缓冲液和用于将蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上的缓冲液（配方18-21）。
对于蛋白质转移，请根据所用凝胶的大小切割滤纸和膜。
注意：对于小型凝胶，滤纸和PVDF膜切成7厘米乘9厘米，对于中型凝胶切成9厘米乘14厘米。

在电泳槽中组装预制凝胶，并向槽中填充运行缓冲液。
注意小号：

有关“ Mini-PROTEAN Tetra Cell Precast”的信息，请参阅Bio-Rad（https://www.bio-rad.com/）的说明手册。
根据需要解析的蛋白质的分子量，使用具有不同百分比的聚丙烯酰胺的凝胶：对于50-200 kDa的蛋白质为7.5％，对于15-100 kDa的蛋白质为10％，对于10-70的蛋白质为12％ kDa，对于12-45 kDa的蛋白质为15％。
将外泌体（来自粗制外泌体制剂或纯化的蔗糖密度梯度级分）煮沸，重悬于上样缓冲液中5分钟。将样品以10,000 xg的转速旋转30 s，然后将其加载到预制凝胶上。
在上样之前，用流动缓冲液冲洗凝胶孔。
使用圆形装载头，将外泌体样品和蛋白质标记物装载到预制凝胶上。
注：- [R esuspend每个样品之前彻底加载凝胶。

在100 V下运行凝胶，直到加载缓冲液的染料到达凝胶的底部。
小心地从盒中取出凝胶，将其放在装有1.0 ml转移缓冲液的Chemidoc 成像托盘上，并使用无污染程序对其进行成像（图3）。
注意：无污凝胶是一种方便的工具，可用来评估所有样品中的载量是否相等。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902893--1352亚历山德拉·达佐846731 \ Figs jpg \图3.jpg

图3 。装有外泌体的无污凝胶。WT和Neu1    粗外来体上一个判据TGX染色免费预制凝胶上运行，并使用成像chemidoc 污点免费节目（图从范·德Vlekkert 等人。，2019）。

在转移缓冲液中平衡凝胶。
用铅笔或钢笔标记PVDF膜，并在100％甲醇中将其激活10 s （最大30 s ）。
在ddH 2 O中短暂冲洗PVDF膜，并在转移缓冲液中使其平衡。
将滤纸浸入转印缓冲液中。
组装凝胶，滤纸和PVDF膜以进行转移。
注意：小号EE指令从Bio-Rad公司（手动https://www.bio-rad.com/为“微型反式印迹电泳转移细胞”）。

在80 V下转移1.5至2小时，或在4 °C 在30 V下转移过夜。
转移后，在室温下在搅拌下将膜在封闭缓冲液中温育1小时（请参见22-24节）。
孵育该膜（在50ml试管）与主antib ODY（见表1）在4℃过夜稀释溶在3.0ml 3％BSA-TBS-T ℃下温和搅拌（见配方小号22-23，25）。
注意：将一抗稀释至建议的浓度/稀释度。

用TBS-T 冲洗膜1 次，并在轻微搅拌下用TBS-T洗涤3次10分钟（请参见配方22-23）。
在室温下轻轻搅拌下，在封闭缓冲液中与二抗（参见表1； 1：10,000稀释度）一起孵育1小时。
用TBS-T冲洗膜1次，并在轻轻搅拌下用TBS-T洗3次10分钟。
用吸管将1.0毫升的SuperSignal west Femto 显影剂溶液吸到有机玻璃板上，并确保将工作台/工作台调平，以免溶液流出（配方26）。
除去过量的TBS-T，并将膜面朝下放在1.0 ml显影剂溶液上。
孵育30到1分钟，然后将膜面朝上放在Blot / UV / Stain-free样品盘上。
对膜成像（图4）。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902893--1352亚历山德拉·达佐846731 \ Figs jpg \图4.jpg

图4 。使用经典的外泌体标记对外泌体进行免疫印迹分析。一。外泌体从WT和纯化Neu1    培养（肌肉）的成纤维细胞和用抗阿利克斯，CD81，CD9，flotillin1，syndecan1和syntenin1抗体探测。乙。WT和Neu1    粗外来体进行蔗糖密度梯度，并用抗阿利克斯，CD9和CD81的抗体探测。在级分3-6沉淀外泌体，其对应于1.096的密度- 1.140克毫升-1 （˚F 从igure范·德Vlekkert 。等人，2019）。

数据分析

使用Omega数据分析软件计算蛋白质浓度。
使用Image Lab软件对外泌体蛋白质的水平进行定量，并针对装载在无污凝胶上的蛋白质总量进行标准化。

菜谱

胶原酶P储备溶液（4x）
在5.0 ml DPBS（20 mg / ml ）中复溶100 mg

储存在-20 °C

Dispase II储备液（10x）
在100 ml DPBS（11 U / ml）中重新配制1.0 g，并保存在-20 °C

氯化钙2 （1 M）
将1.1098 g溶于10 ml ddH 2 O

消化混合物
2.5 ml胶原酶P储备溶液（最终浓度5.0 mg / ml）

2.0 ml Dispase II储备液（最终浓度1.2 U / ml）

100 μ 升的CaCl 2 储备溶液（最终浓度5.0毫摩尔）

15.4毫升DPBS

过滤器将溶液消毒并储存在-20 °C

完全中等
440毫升DMEM

50毫升FBS

5毫升青霉素-链霉素

5毫升GlutaMAX 补充剂

过滤器将溶液消毒并储存在4 °C

冷冻介质
10 ％二甲基亚砜

90％FBS

外泌体免费FBS
在无菌薄壁聚丙烯试管中于4 ° C在100,000 xg 下将FBS旋转过夜，然后将上清液转移至50 ml管中

储存在-20 ° C

完全游离体培养基
440毫升DMEM

50毫升免费Exosome FBS

5毫升青霉素-链霉素

5毫升GlutaMAX 补充剂

过滤器将溶液消毒并储存在4 °C

0.1％的Triton X-100
将1.0 ml Triton X-100（10％）与99 ml ddH 2 O混合

BCA试剂工作液
稳定1天

将50份BCA试剂A与1份试剂B混合

100万DTT
10克DTT

64.83毫升ddH 2 O

取1.0毫升等分试样并储存在-20 °C

0.5 M Tris-HCl，pH 7.4
6.05克Tris-base

95毫升ddH 2 O

用HCl调节pH值至7.4

最终定容至100毫升并进行高压灭菌

蛋白酶抑制剂原液（100x）
溶解一个完整的蛋白酶抑制剂混合物片剂在500 μ 升的DDH 2 ö

储存在-20 °C

10毫米Tris-HCl pH7.4 / 1毫米Mg（Ac）2
100 μ 升的Mg（AC）2 1.0M溶液

2.0 ml 0.5 M Tris-HCl pH 7.4

97.9毫升ddH 2 O

储存在4 °C

蔗糖梯度溶液
30毫升10毫米Tris-HCl pH7.4 / 1毫米Mg（Ac）2

300 μ 升蛋白酶抑制剂（100×）

保持溶液在冰上，直到使用

100％三氯乙酸
100克DDH 2 O中的100克三氯乙酸粉末

80％乙醇
80毫升100％乙醇

20毫升ddH 2 O

Western blot运行缓冲液（10x）
30.28克Tris Base

144.13克甘氨酸

10.0克SDS

800毫升ddH 2 O

检查pH，应为8.3

完成体积至1.0 L

Western blot运行缓冲液（1x）
使用前准备新鲜

100 ml Western blot运行缓冲液（10x）

900毫升ddH 2 O

传输缓冲区（10倍）
30.28克Tris Base

144.13克甘氨酸

800毫升ddH 2 O

用ddH 2 O将体积定为1.0 L

传输缓冲区（1个）
100 ml转移缓冲液（10X）

200毫升甲醇

700毫升ddH 2 O

准备新鲜并保持在4 °C 直至使用

20倍Tris缓冲盐水（TBS）
121.14克Tris碱

175.32克氯化钠

900毫升ddH 2 O

用HCl调节pH值至8.0

用ddH 2 O将体积定为1.0 L

TBS-T（1升）
50毫升20倍Tris缓冲盐水（TBS）

10毫升Tween-20（10％）

940 ml ddH 2 O至最终体积为1 L，并充分混合

阻塞缓冲区
5.0克脱脂奶粉

100毫升TBS-T

储存在4 °C

3％BSA-TBS-T
3.0克BSA

100毫升TBS-T

储存在4 °C

SuperSignal West Femto 解决方案（每个膜）
将0.5 ml鲁米诺/增强剂与0.5 ml稳定的过氧化物缓冲液混合

致谢

资金来源：这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）的部分资助，R01GM104981，RO1DK095169和CA021764，孟菲斯的阿西西基金会以及美国黎巴嫩叙利亚联合慈善机构。该协议改编自van de Vlekkert 等人。，2019年。作者没有利益冲突或利益冲突声明。

伦理

将动物圈养在完全由AAALAC（实验室动物护理评估和鉴定）认可的动物设施中，并控制温度（22 °C ），湿度和光照（交替12h光照/黑暗周期）。随意提供食物和水。所有涉及小鼠的程序均根据圣裘德儿童研究医院机构动物护理和使用委员会批准的动物规程以及美国国立卫生研究院的指导原则（动物规程＃235-100465-03 / 17；实验编号03/01）进行。 / 2017-03 / 01/2020）。

参考文献

d'Azzo，A.，Machado，E.和Annunziata，I.（2015）。唾液酸中毒的发病机理，新兴治疗靶点和治疗。Expert Opin Orphan Drugs 3（5）：491-504。
de Geest ，N.，Bonten ，E.，Mann，L.，de Sousa- Hitzler ，J.，Hahn，C. and d'Azzo，A.（2002）。全身和神经系统异常可区分小鼠的溶酶体疾病唾液酸中毒和半乳糖唾液酸中毒。哼哼Mol Genet 11（12）：1455-1464。
Gurunathan ，S.，Kang，MH，Jeyaraj，M.，Qasim ，M.和Kim，JH（2019）。审查外泌体的分离，表征，生物学功能和多种治疗方法。单元格8（4）：E307。
Mas- Bargues ，C.，桑斯-ROS，J.，罗á 正的Dom í nguez，A.，Ingl é 小号，M.，吉梅诺-Mallench ，L.，埃尔阿拉米，M.，六ñ 一个-阿尔穆尼亚，J.，Gambini ，J.，六ñ 一个，J。和Borr á 小号，C。（2019）。干细胞培养中氧气浓度与再生医学的相关性。国际分子科学20（5）：E1195。
Rackov ，G.，Garcia-Romero，N.，Esteban-Rubio，S.，Carrión- Navarro，J.，Belda -Iniesta，C.和Ayuso -Sacido ，A.（2018）。囊泡介导的细胞功能控制：细胞外基质和微环境的作用。前生理学9：651。
Szatanek ，R.，Baj-Krzyworzeka ，M.，Zimoch ，J.，Lekka ，M，Siedlar ，M.，and Baran J.（2017年）。细胞外囊泡（EVs）表征的选择方法。国际分子科学18 ：1153。
van de Vlekkert，D.，Demmers，J.，Nguyen，XX，Campos，Y.，Machado，E.，Annunziata，I.，Hu，H.，Gomero，E.，Qiu，X.，Bongiovanni，A. ，Feghali-Bostwick，CA和d'Azzo，A.（2019）。过量的外泌体释放是将溶酶体缺乏症与广泛性纤维化联系起来的致病途径。科学建议5（7）：eaav3270。