材料和试剂

Superfrost Plus金片（Thermo Fisher Scientific，目录号：FT4981GLPLUS）。品牌并不重要
方盖滑片（Thermo F isher Scientific，目录号：18X18-1）。品牌并不重要
电工胶带（3 M Safety，Scotch，在亚马逊购买）。品牌并不重要
FluoSpheres 羧酸乙酯，0.2 微米绯红，645分之625（Life Technologies公司，目录号：F8806）替代尺寸/可用于化学取决于实验设计，请参考上述背景
6 - 孔板（Fisher Scientific公司，Corning）中。品牌不是关键，不必是组织培养质量
老鼠
PBS（Millipore Sigma，目录号：D8537）。品牌并不重要
超级胶水（乐泰，在亚马逊购买）。品牌不重要
PBS中的FluoSpheres 羧酸盐的体积比为1：1,000 （请参阅食谱）

设备

解剖剪刀（Fine Science Tools，目录号：14061-10）品牌并不重要
电动剃须刀（从亚马逊购买）的品牌并不重要
脱毛产品Nair（从亚马逊购买）品牌并不重要
镊子（精细科学工具）品牌并不重要
显微解剖剪刀（精细科学工具）品牌并不重要
手术刀（从亚马逊购买）可选，品牌并不重要
解剖显微镜（Laxco ，LMS-Z200）可选，品牌并不重要
布鲁克Opterra 扫频显微镜（布鲁克）的品牌并不重要，显微镜必须配备高速荧光摄像头（Photometrics Evolve Delta EMCCD摄像头）

软件

1. 获取图像Prairie View 5.4（布鲁克）品牌并不重要，任何与显微镜相关的软件都可以使用

2. 分析软件ImageJ（方向性，Mtrack2，手动跟踪，NIH，https： //imagej.nih.gov/ij/ ）可以使用其他软件进行分析

程序

准备幻灯片
制作一堆电工胶带，使其厚度约为1.5毫米（7根胶带）（图1A-1B）。
注意：此处的胶带厚度可能会根据您要处理的薄纸的厚度而有所不同，其厚度对应于薄纸接触玻片底部和盖玻片的底部而不会明显扭曲薄纸。但是，重要的是要使样本之间的厚度保持一致，因为厚度会在以后影响成像。

使用手术刀切一小段，以容纳气管（图1C）。
将胶带放在载玻片上，制成可用于大多数显微镜的容纳腔的载玻片（图1D）。
注意：实验前可以轻松准备大量幻灯片。这样做可以加快实验的通量。

图1. 准备用于测量粘膜纤毛间隙的小室玻片。AB 。电工胶带彼此堆叠在一起，形成相当于〜1.5 mm的堆叠（白色箭头）。C. 在带子的中央切开部分以形成用于组织的腔室。D.将胶带粘贴到载玻片上以进行成像。E. 气管组织的例子，其被纵向切割并以盖玻片放置在腔室中。

气管夹层（时间敏感）
遵循以下步骤，直到对每只小鼠不间断地进行图像采集为止（而不是为实验提取所有气管），并迅速获得最佳结果。

根据当地机构动物护理和使用委员会（IACUC）的政策和协议对小鼠实施安乐死。
使用解剖板或将鼠标拍打在坚硬的表面上来固定鼠标。立即使用您的选择（奈尔，电动剃须刀）的脱毛产品暴露颈部皮肤，使一〜3 从胸部到鼻子厘米的切口，并移动唾液腺一边，露出小鼠的气管。
清洁与气管相关的结缔组织，并在气管上端进行横切。用镊子握住气管以保持气管紧绷。
切开气管下端。
立即传送到6孔板约1 米升PBS。
使用显微解剖剪刀从气管纵向切开。
立即继续进行下一步。

安装气管
准备PBS 中1：1，000的FluoSpheres 羧酸盐溶液。
注意：请准备大量用于整个实验。充分涡旋初始溶液，并在每次使用之间充分涡旋混合。

将步骤B的气管放入步骤A的玻片中，管腔一侧朝上。
注意：使胶带的高度与组织的厚度相匹配是至关重要的，因为这样可以使盖玻片防止在成像过程中气管重新折叠。

地方〜250 μ 的1升：1，000 FluoSphere 在腔室的溶液，放置超级胶水几滴磁带和盖玻片（图的边缘1E）。
注意：请注意不要在腔室中放入过多的液体，也不要在胶带上放置过多的胶水。目的是要有足够的液体将样品浸没或完全覆盖中心而不会溢出。将浸没在样品中的液体与超级胶水混合会导致结果不可靠。使用练习幻灯片进行优化，以获取每种设置所需的确切音量。

立即继续进行下一步。

影像学
显微镜应打开并设置在正确的位置。使用含有颗粒溶液但无器官的玻片作为阳性对照（请参阅视频1）。
注意：成像是在室温下进行的。ħ H但是，实验可以在不同温度下，如果您的显微镜装置进行允许不同的温度设置。

视频1. 粒子在自由溶液中以布朗运动运动的示例

将幻灯片放到位。
*重要*更改焦点，直到找到一个平面，其中的粒子似乎是静态的。这是组织的平面，其中颗粒附着/吞噬到表面上的粘液/细胞。从那里开始，将焦点移至每个图像的设定量。这一点很重要，因为纤毛产生的流量的测量值会随着距纤毛表面的距离而变化。因此，要生成可以在样本之间进行比较的数据，必须将该距离保持恒定（请参阅视频2）。在我们的实验中，我们使用的距离的〜1 μ 从纤毛的表面米的距离。

视频2.由于纤毛产生的流，粒子按方向运动的示例

以每秒100帧或以上的速度s 采集图像（我们以100 fps的速度采集了30 s）。用显微镜设置拍摄图像；图像尺寸：512 μ 米X 512 μ 米，FOV：204.2 μ 米X 204.2 μ m和像素尺寸0.399 μ 米×0.399 μ 米。
注意：我们实验中的两个成像激光器分别为488 nm和561 nm，其发射滤光片针对GFP和RFP进行了优化。两个照相机在显微镜AR Ë512 μ 米X 512 μ 中号光曲线演变德尔塔EMCCD相机。激光是通过狭缝或32个针孔阵列进行扫描的，旨在提高扫描速度，全帧时max速度为67 fps ，并具有较小的ROI，可实现更快的速度。

尽快拍摄这些图像至关重要。在我们的手中，所有图像均在解剖后5分钟内拍摄，并在10分钟后看到组织活力降低。
注意：此步骤的关键部分是使操作过程舒适并减少解剖和成像之间的时间。练习获得良好的流动，或成对工作以让一个人解剖，而另一个人则要设置显微镜以建立最佳成像条件。作为纤毛运动调节的积极对照，环境湿度较高（〜50 ％）的小鼠将表现出较高的纤毛颗粒速度（Kudo等人，2019）。作为阴性对照，可以使用环境湿度较低的小鼠，也可以使用经过较长时间（> 10分钟）切除的气管。

数据分析

使用文件>导入>图像序列将数据加载到FIJI / ImageJ中。
使用插件>跟踪> MTrack2（https://imagej.net/MTrack2）分析粒子速度。
注意：使用imageJ 设置“图像”>“调整”>“亮度/对比度”以确保高信噪比。这将使MTrack2程序可以更好地识别粒子。

使用插件>跟踪>手动跟踪（https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html）测量单个粒子的轨迹（图2）。
注意：此功能将允许记录单个粒子的坐标。然后可以使用绘图软件对其进行绘图，以显示给定时间内粒子的整个轨迹。

使用“分析”>“方向性”来计算流的方向性（图3 ）。
使用文件>另存为> A VI 导出粒子流的视频（视频1和2）版本。

图2. 纤毛产生的流量和方向性分析V IDEOS 1和2 中A.定量纤毛生成的流的V IDEO 小号1和2中使用的数据一个协议的nalysis部分。公元前。V ideo s 1和2 的方向性频率的量化。

图3. 纤毛产生流量测量的主要步骤示意图

菜谱

1：1,000体积/体积的FluoSpheres 羧酸盐在PBS中
解决方案应存放在黑暗中

每天制作新鲜溶液，并在使用前平衡至室温

致谢

感谢Melissa Linehan的技术和后勤帮助。感谢Al Mennone 为这些实验设置显微镜，并感谢工藤惠子（Eriko Kudo）进行了导致产生原始研究论文的实验。图形插图由Biorender.com制作。这项工作得到了霍华德·休斯医学研究所（AI）的部分支持，这是康德尔集团（Condair Group）和美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）赠款T32GM007205（对ES的医学科学家培训计划培训）提供的礼物。该协议的原始研究论文可以在Kudo 等人找到。（2019）。

利益争夺

作者对此书中描述的协议没有任何财务和非财务方面的竞争利益。

伦理

本研究未使用任何人类受试者。根据Yale IACUC协议2018-10365批准了所有动物工作。

参考文献

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