材料和试剂

注意：列出的所有材料和试剂都是基于使用提供的协议成功使用的实例。但是，使用不同的大鼠品系/性别/体重和谷物也可能成功。

纸巾
Cho 对照粉洒（即Cocoa Pebbles TM ）
称重台（化学玻璃，目录号CLS-1815-002）
铅笔
橡皮
行为表（请参阅附录1）
实验性幼稚的雄性Long-Evans大鼠，体重在300克至350克之间（Charles Rivers Laboratories）
乙醇70％（Fisher Scientific，Decon Laboratories，目录号：04-355-223）

设备

图8-迷宫
尺寸：101厘米长的横档，连接到迷宫顶部和底部的左右臂的中心臂。侧件也长101厘米。顶部和底部的长度为150厘米。所有跑道均为10厘米宽x 2厘米高。迷宫距离地面50厘米（图1）。包含奖励件（即Cocoa Pebbles TM ）的称重船被附在奖励位置下方，用作不可见的气味提示，以防止受试者在做出决定时使用气味。

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图1.用于行为训练和测试的图8迷宫装置。A. P 迷宫hotography。中央茎杆上的侧挡板表示延迟位置。在迷宫的两侧，奖励位置下方提供了气味提示，以防止选择特定手臂（白色称重船）时出现偏见。B. 我迷宫表示各部分的测量结果的llustration。C. 可移动的纸板挡板（手向后）。

纸板隔板（手工制作，尺寸：21.6 厘米x 28厘米）
秒表（Fisher Scientific，目录号：ISO 17025）
红外线照相机（如Acazon海螺形红外大号的ED股票C 相机，https://amzn.to/37XHKyG）
秤（Kent Scientific，目录号SCL-1015）
昏暗的光源（即台灯）

软件

笔记：

下列软件描述了已使用所提供的协议成功使用的软件；但是，使用允许对替代评分的替代软件也可能成功。
对于电生理记录，使用了4SX 64通道Neuralynx系统。我们不在此协议中讨论电生理程序，但是任何高密度，低噪声的电生理系统都可以成功。
微软Excel
统计包（即SPSS，GraphPad棱镜，R）

程序

A. 一般说明

注意：所有行为环节均在昏暗条件下的黑暗阶段（逆光周期：08：00至16:00）进行。在轻型阶段执行此任务也可能会成功。

大鼠应单独饲养。
使大鼠保持相反的12小时明/暗周期。
行为测试应在黑暗周期中进行。
在进行行为训练之前，应逐渐剥夺大鼠的食物，直至达到其随意体重的85％，并且在整个实验过程中应保持体重不变。
应始终保持有水。
在行为训练之前，每天称重大鼠。
在行为训练结束时喂老鼠。
大鼠执行任务的顺序应每天更改，以便每天执行任务的第一只大鼠与前一天运行的第一只大鼠不同。
实验人员应避免任何不必要的干扰。
应提供气味提示（用作食物补强剂的食物奖励），以防止大鼠根据奖励的气味做出决定（图1）。
房间中应有明显的视觉提示，并且应保持恒定。
添加一些巧克力洒（可可卵石TM 的习惯一天，以防止恐新症前3天每天或你将作为奖励使用谷物），以老鼠的家笼。
在习惯日前3天每天处理大鼠（每只约5分钟）。

B. 习惯

在第四天，将大鼠（一个一个地）带到进行行为测试的房间，并给大鼠称重后，让其自由地用巧克力探索迷宫10分钟，以使其熟悉房间和设备。洒满迷宫。
在实验结束时和动物之间，用70％乙醇溶液清洁迷宫，每条毛巾擦拭一遍。在将下一只老鼠放在设备上之前，请确保迷宫干燥。
确保家笼床上用品保持清洁以避免老鼠消耗其废物。这可能会干扰食物剥夺程序/体重减轻。
在行为结束时，根据体重给所有大鼠喂食。
继续将部分食物奖励添加到动物的笼子中，以避免恐惧症。

C. 第一阶段– 培训

1. 在第五天（或第五天），称重对象。开始将大鼠放置在迷宫中心臂的底部（奖励位置最远的一端，见图2）。

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图2. 训练方案第一阶段的示意图。将每只大鼠放置在设备中央茎的底部，面对选择臂（星号表示放置动物的位置）。放置障碍物以迫使大鼠进入选择臂之一。进入其中一臂后，将获得奖励。

2. 放置障碍物以迫使大鼠进入奖励（1个可可卵石）所在的侧臂之一。

3. 老鼠消耗完奖励后，使用障碍物轻轻地引导老鼠返回中心臂的底部。然后，在中心臂的远端切换障碍物，以迫使大鼠将对立的选择臂向下倾斜以获取下一个奖励。至关重要的是，不允许老鼠在任何时候追踪其路线。

4. 每节应持续20分钟或30次试用，以先到者为准。

5. 重复此过程，通过使用护栏和交替的手臂来改变大鼠可以跟随的模式，直到大鼠能够在连续两天（标准）内遵循模式并持续奔跑，而无需试图追回其步伐。

6. 在行为训练结束时，根据体重为所有大鼠喂食。

D. 第二阶段– 培训

注意：在此阶段之前，大鼠应已达到阶段1的标准。

1. 称重主题。

2. 应该逐步取消使用障碍物，因为现在允许大鼠每次到达茎的末端时都可以进入其中的任何一个臂（见图3）。

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图3. 训练方案第二阶段的示意图。在选择点上应避免使用障碍物；每次大鼠到达茎的末端时，它都可以进入任一手臂，但是只有以“图8”式的方式交替进入手臂时，它才会获得奖励，并且在任何时候都将阻止它们追踪步伐。

3. 第一个审判将被视为“审判0”，并且将始终奖励老鼠。

4. 在该试验之后，只有在交替进入手臂时才对大鼠奖励。

5. 防止老鼠在任何时候退步。

6. 该过程应进行20分钟或30次试验（不包括初始运行），以先到者为准。如果动物没有改善其性能，请增加每天的试验次数（最多60次）。

7. 对于每个试验，选择的手臂将被打分为正确（替代）或不正确（重复输入先前选择的手臂，请参见附录1）。

8. 应训练大鼠在连续3天中的2天中至少执行（90％）正确试验的标准性能。

9. 在行为训练结束时，根据动物的体重喂它们。

E. 第三阶段– 测试

注意：在此阶段之前，大鼠应已达到阶段2的标准。此第三阶段包括延迟试验。

1. 称重主题。

2. 大鼠应每天接受30次试验，分为3组，每组10次试验（无延迟，延迟10秒和延迟60秒）。

3. 试验区的顺序应每天随机化。根据实验者尝试解决的问题，可以将试验块加倍至60，以便重复每个块，例如，无延迟，10秒延迟，60秒延迟，无延迟，10秒延迟， 60秒延迟）。例如，如果同时进行电生理记录，则这种结构将是有益的，因为可以进行相同类型的试验块之间的比较。

4. 对于延迟试验，一旦大鼠回到茎干的底部，则在前一个块的最后一次试验之后，通过在中心茎干的底部放置两个障碍物来限制大鼠（延迟部位应长约25 cm ）。参见图4 和视频1 。

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图4.第三阶段的示意图（测试）。一旦大鼠达到第2阶段的标准，便会开始延迟测试。在每天的会议中，大鼠将接受30个试验，分为10个试验的三个组。每天将对3个延迟块的顺序进行伪随机处理。

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V IDEO期间行为测试的第三阶段1.一个60-S延迟试验的实施例的视频

5. 启动秒表以跟踪延迟时间。

注意：秒表应处于静音模式，以避免任何听觉提示。

6. 在延迟间隔结束时，移开阻挡老鼠进入8型迷宫中心臂的障碍，以便它可以自由地横穿茎部并做出下一步选择。

7. 在大鼠做出选择并消耗了奖励（如果适用）之后，让它返回中心臂上的延迟区域，以进行下一次试验。

8. 重复此阶段至少连续6天。

注意：此阶段的持续时间可以根据实验者试图解决的问题而变化。

9. 每只大鼠跑动后，用70％乙醇溶液和纸巾清洁迷宫。在将下一只老鼠放在迷宫之前，请确保迷宫干燥。

10. 在行为训练结束时，根据动物的体重喂它们。

数据分析

注意：使用Microsoft Excel或类似软件记录实验每个阶段的行为数据。

1. 对于第二阶段，将数据输入到带有以下列的Excel电子表格中（请参见图5）：

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1903021--1322 Marta Sabariego 795509 \ Figs jpg \图5.jpg

图5. Excel电子表格显示了第二阶段的记录数据和结果汇总表（底部），其中包含正确试验，错误试验的总和以及正确试验的百分比。数字1、2、3代表大鼠。从大鼠1记录数据的列显示了一个示例，该示例在连续3天中有2天满足90％正确试验的标准性能，准备移至下一个阶段。

试用次数。
实验发生的日期（例如，第1天，第2天，第3天）。
将“天”部分分成可识别大鼠的数字（例如1、2、3）。
2. 对于每个试验，大鼠正确完成输入1，否则输入0。

3. 最后，创建一个表，该表汇总：

牛逼，他总结了正确的试验

牛逼，他总结了不正确的审判

牛逼正确的审判，他计算出百分比

4. 对于第三阶段，数据遵循与第二阶段相同的指令，并增加了延迟块的随机顺序（无延迟，10 s，60 s延迟）

为每个块创建一个正确，不正确和正确试验百分比的摘要表（参见图6）。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1903021--1322 Marta Sabariego 795509 \ Figs jpg \图6.jpg

图6. Excel电子表格显示了第三阶段的记录数据，具有随机延迟顺序，无延迟（白色），10 s延迟（浅蓝色），60 s延迟（深蓝色）。以下是每个试验块的正确，不正确和正确试验百分比的摘要。请注意，每一天试验的不同的块（1 ST ，2 次和3 次）将对应于不同类型的延迟（无延迟，10秒延迟和60秒延迟）。实验人员在分析之前应考虑此点以整理其数据。一种选择是始终按照特定顺序（例如，无延迟，10 s，60 s延迟）输入数据，即使这不是当天动物遵循的真实顺序。

5. 使用统计软件包（即S PSS，G raph P ad棱镜，R）执行双向方差分析，以分析动物组之间的差异和延迟类型（参见图7，改编自Sabariego 等人）。（2019）用于repres 表示和分析数据entative方式）。可以使用事后检验（例如Tukey检验）分析重大相互作用的多个比较。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-3-05 \ 3549--1903021--1322 Marta Sabariego 795509 \ Figs jpg \图7-updated.jpg

图7.交替任务中病变实验的数据绘图和分析的代表性示例。在延迟版本中受损的大鼠受损，但在连续版本中没有受损。用双向方差分析（组x延迟）分析测试的7天，该方差分析显示了病变和延迟的主要作用以及延迟x病变的相互作用（P 值= 0.0001）。Tukey的事后检验：^^^ P <0.001，用于对照组与mEC病变组的比较；*** P < 0.001对照与mEC的+ H病变组比较（LES mEC的和海马的离子; ## P <0.01相对于mEC的mEC的+ H病变组比较（一个从Sabariego dapted 。等人，2019）。

致谢

该协议改编自Sabariego 等。（2019）。霍利奥克山学院的“神经科学与行为计划”支持了最近的工作。

利益争夺

作者没有利益冲突。

伦理

所有实验程序均已获得美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校的机构动物护理和使用委员会批准（协议编号S08276，自2017年4月19日起3年批准）。

参考文献

JA的Ainge，MA的van der Meer，RF的Langston和ER的Wood（2007）。探索上下文相关的海马活动在空间交替行为中的作用。海马17（10）：988-1002。
Eichenbaum，H.（2017年）。海马中的时间（和空间）。Curr Opin Behav Sci 17：65-70。
伊藤（HT），张（J.SJ），威特（Witter），议员，摩瑟（Moser），EI和摩瑟（Moser），MB（2015）。用于目标定向空间导航的前额-丘脑-海马回路。自然522（7554）：50-55。
Kim，S.，Sapiurka，M.，Clark，RE和Squire，LR（2013）。人类和大鼠海马损伤后对路径整合的不同影响。美国国家科学院院刊110（12）：4732-4737。
E. Pastalkova，V. Itskov，A. Amarasingham和G. Buzsaki（2008）。大鼠海马内部产生的细胞装配序列。科学321（5894）：1322-1327。
NTM鲁滨逊，普利斯特利，JB，鲁克曼，JW，加西亚，AD，斯麦格林，弗吉尼亚州，马里诺，FA和Eichenbaum，H.（2017年）。内侧内嗅皮层选择性支持海马神经元的时间编码。神经元94（3）：677-688 e676。
Sabariego，M.，Schonwald，A.，Boublil，BL，Zimmerman，DT，Ahmadi，S.，Gonzalez，N.，Leibold，C.，Clark，RE，Leutgeb，JK和Leutgeb，S.（2019）。海马中的时间细胞既不依赖于内侧内嗅皮质输入，也不依赖于空间工作记忆。Neuron 102（6）：1235-1248 e1235。