材料和试剂

50 ml离心管（Corning，目录号：CLS430829）
1.5 ml微型管（Axygen ，目录号：MCT150-CS）
移液器吸头10 µl，200 µl和1,000 µl（Axygen ，目录号：T-400，T-200-Y和T-1000-B）
无菌血清移液管（5和10 ml）（Corning，目录号：CLS4487和CLS4488）
FACS管（FALCON，目录号：352058）
40 微米的细胞滤网（FALCON，目录号：352340）
细胞计数室（Nexcelom Bioscience，目录号：CHT4-SD100）
0.2 微米的Nalgene注射器过滤器（赛默飞世尔科技，产品目录号：725-2520）
50 ml注射器（T ERUMO ，目录号：SS-50LE）
雌性FVB小鼠用于乳腺分离（由澳门大学卫生科学学院动物设施核心提供）
DMEM / F12培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11330032）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：26140079）
HBSS（Thermo Fisher Scientific，目录号：14140112）
氢化可的松（Sigma-Aldrich，目录号：H0888）
胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：91077C）
EGF（Thermo Fisher Scientific，目录号：PHG0313）
霍乱毒素（Sigma-Aldrich，目录号：C8052）
3型胶原酶（沃辛顿生物化学公司，目录号：LS004183）
透明质酸酶（Sigma-Aldrich，目录号：H3506）
Dispase II（Roche，目录号：04942078001）
脱氧核糖核酸酶I（沃辛顿生物化学公司，目录号：LS002145）
HEPES （1 M）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15630080）
DPBS（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190250）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：25200056）
1 x RBC裂解缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：00-4333-57）
台盼蓝染料（STEMCELL Technologies，目录号：07050）
EasySeq 小鼠上皮细胞富集试剂盒（STEMCELL Technologies，目录号：19868）
抗小鼠CD24-PE-Cy7抗体（BD Biosciences，目录号：560536）
抗小鼠CD29-APC抗体（Biolegend ，目录号：102216）
DAPI溶液（1 mg / ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：62248）
牛白蛋白（BSA）（VWR LIFE SCIENCE，目录号：VWRV0332）
消化缓冲液A（请参阅食谱）
消化缓冲液B（请参见食谱）
FACS缓冲区（请参阅配方）
设备

无菌剪刀和镊子
吸管
移液器辅助
用于细胞培养工作的生物安全柜
离心管支架
湿细胞培养箱设置为37°C，5％CO 2
Ø摇床（Allsheng ，OS-100）安放在细胞培养箱中
带有用于50 ml离心管和FACS管的适配器的离心机，用于室温
EasySep 磁铁（STEMCELL Technologies ，目录号：18000）
细胞计数器（Nexcelom Bioscience，Cellometer Auto 2000 ）
BD FACSAria III用于细胞分选

软件

BD FACSAria III的BD FACSDiva 6.1

程序

从雌性小鼠中分离乳腺（图1）
通过颈脱位法牺牲雌性小鼠，并使用图钉将其脚钉入泡沫表面，从而腹部收紧。
沿鼠标的腹部进行平行切口，而无需使用剪刀和镊子刺穿腹膜。然后沿后腿向脚扩大切口，以形成“ Y型”切口。
向后拉皮肤并将其固定在泡沫表面，以露出第四对乳腺。从身体上卸下整个乳房固定架。
转移乳腺进入无菌50ml离心管中，并将其切碎成片尽可能小的内部管与剪刀。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902805 --1298 Heng Sun 636908 \ Figs jpg \ Figure.2.jpg

图1. 分离第四对小鼠乳腺进行细胞解离。A. 牛逼他牺牲小鼠束缚在泡沫表面。B. 进行“ Y型”切口以暴露第四对乳腺（在红色圆圈内）。C. Ť 他乳腺中除去，并转移到50毫升离心管中。D. Ť 他切碎乳腺组织用消化缓冲液，一种用于离解的细胞治疗。

将乳腺消化成细胞悬液
将5毫升消化缓冲液A（用于1对乳腺）加入切碎的乳腺碎片的50毫升离心管中。移液几次，以与5 ml无菌溶液有效混合血清移液器。
把50ml离心管到保持器的轨道摇床，其在细胞培养孵育箱（37℃，5％CO结算2 ）。将速度设置为120 rpm。
P ipetting的乳腺反复组织（吹打每隔15-20分钟）足以离解。通常大约需要一个小时。
一旦管中只剩下很少的肉眼可见的碎片，在室温下以300 xg的转速离心解离的乳腺细胞3分钟。
除去上清液，然后用2 ml的消化缓冲液B重悬细胞沉淀。然后将试管放在细胞培养培养箱内的轨道振荡器上，以120 rpm的转速旋转5分钟。
小号针向下细胞并洗他们用5ml HBSS中。
再次旋转，除去上清液，然后用1 ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA重悬细胞沉淀，以在细胞培养箱中的振荡器上以120 rpm的速率进一步消化2分钟。
加入9 ml含5％FBS的DMEM / F12培养基中和消化，并旋转细胞。用HBSS清洗一次，然后再次旋转。

上皮细胞富集
要除去红细胞，请用1 ml 1x RBC裂解缓冲液重悬细胞沉淀，并在室温下孵育5分钟。
加入5 ml HBSS终止反应。混合然后旋转细胞。
注意：如果细胞沉淀显示为红色或粉红色，则表明仍然有一些红细胞，请用1 ml 1x 红细胞（RBC）裂解缓冲液再处理细胞5分钟，然后用HBSS洗涤。

用5 ml DMEM / F12培养基+ 5％FBS 重悬细胞沉淀。然后通过40 µm细胞过滤器过滤细胞。
使用带有细胞计数室的Nexcelom Cellometer Auto 2000对细胞数进行计数。
为了丰富乳腺上皮细胞， Easy Seq 小鼠上皮细胞富集试剂盒用于按照制造商的说明去除阳性（Lin + ）非上皮细胞谱系标记。简言之，林+ 细胞与免疫磁珠靶向谱系标记并被吸引到结合EasySep 磁体，然后所需林- 上皮细胞保持自由以便收集。

细胞分选以分离基础细胞和管腔细胞
算富集的上皮细胞的数量并重新悬浮细胞以1的浓度X 10 6个每100个细胞微升FACS的用抗小鼠CD24-PE-Cy7的抗体缓冲液（1：200），抗小鼠CD29- APC抗体（1：200）和DAPI（1μg / ml）。
在黑暗中将细胞在冰上染色30分钟。然后洗涤细胞用DPBS（3-5卷染色缓冲液）洗涤两次（小号针向下在300 ×g离心3分钟）。
用FACS缓冲液（3体积作为染色缓冲液）重悬细胞，使最终细胞浓度约为3 x 10 6 细胞/ ml。
加载细胞悬液进行细胞分选。将DAPI - CD24 Mid CD29 Hi 细胞和DAPI - CD24 Hi CD29 Lo 细胞分别选为基底和腔乳腺上皮细胞（Shackleton 等，2006; Sun 等，2018）。收集的基底细胞和腔细胞可用于单细胞RNA测序或其他目的。

数据分析

示意图简要概述了协议的主要步骤（图2）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902805 --1298 Heng Sun 636908 \ Figs jpg \图2.jpg

图2.该协议的示意图。从雌性小鼠中取出第四对乳腺，切成小块，然后通过几种酶消化成单细胞。红血细胞裂解和林- 上皮细胞富集。最后，通过细胞分选分别收集基底乳腺细胞和管腔乳腺细胞。

根据细胞表面标志物CD24和CD29的不同表达模式，可以通过细胞分选将小鼠的乳腺基底和腔上皮细胞很好地分离（Sun 等，2018）。如图3所示，DAPI - CD24 Mid CD29 Hi 细胞和DAPI - CD24 Hi CD29 Lo 细胞分别被门控为基底乳腺上皮细胞和管腔乳腺上皮细胞。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902805 --1298 Heng Sun 636908 \ Figs jpg \图3.jpg

图3.小鼠乳腺细胞的流式细胞仪结果。的DAPI - 细胞进行门控出作为重要的细胞（紫色），然后基于CD24-PE-Cy7的和CD29-APC的不同表达模式进一步选通。CD24 Mid CD29 Hi 细胞被选为基底细胞（绿色），而CD24 Hi CD29 Lo 细胞被选为腔细胞（红色）。

笔记

消化缓冲液A和B，以及FACS缓冲液可以在4°C下保存3个月。
从体内切开后，应切碎乳腺组织并尽快消化，以避免细胞活力丧失。
该方案可用于制备来自其他实体器官（如肝和脑）的单细胞悬液，以及来自乳房，肝脏，结肠和小鼠和人类其他器官的肿瘤/癌组织。

菜谱

消化缓冲液A（表1）

表1.消化缓冲液A的配方

零件

最终浓度

库存浓度*

50毫升容量

胰岛素

5 微克/毫升

10毫克/毫升

25 微升

氢化可的松

500 ng /毫升

1毫克/毫升

25 微升

表皮生长因子

10毫微克/毫升

50 微克/毫升

10 微升

霍乱毒素

20 ng /毫升

1毫克/毫升

1 微升

3型胶原酶

300 U /毫升

粉末状库存

15,000 U

透明质酸酶

100 U /毫升

10,000 U /毫升

0.5毫升

胎牛血清

5％

--

2.5毫升

DMEM / F12培养基

--

--

高达50毫升＃

消化缓冲液B（表2）

表2.消化缓冲液B的配方

零件

最终浓度

库存浓度*

50毫升容量

脱氧核糖核酸酶I

100 微克/毫升

粉末状库存

5毫克

Dispase II

5毫克/毫升

粉末状库存

250毫克

HEPES

20毫米

1M

1毫升

DMEM / F12培养基

--

--

高达50毫升＃

FACS缓冲区（表3）

表3. FACS缓冲区的配方

零件

最终浓度

库存浓度*

50毫升容量

牛血清白蛋白

0.5％

粉末状库存

250毫克

EDTA

2毫米

500毫米

0.2毫升

DPBS

--

--

高达50毫升＃

*除粉状试剂外，所有储备试剂应储存在-80°C（请在1年内使用），以及FBS，DMEM / F12培养基和DPBS均应存储在4°C。EDTA可以在室温下保存。

＃所有缓冲区需要与待过滤0.2 微米的Nalgene针筒式滤器，然后使最终体积至50 毫升

致谢

该协议改编自我们之前的工作（Sun 等，2018），由中国澳门特别行政区澳门大学的格兰特CPG主席2017-00016-FHS和Startup Research格兰特SRG 2017-00045-FHS支持，澳门科技发展基金资助065/2015 / A2和094/2015 / A3，国家自然科学基金资助81602587。

利益争夺

作者宣称他们没有利益冲突。

伦理

该涉及小鼠的实验方案已经澳门大学动物伦理委员会根据实验方案UMAEC-050-2015批准（有效期：2015年至今）。

参考文献

Prat，A.和Perou ，CM（2009）。乳腺发育符合癌症基因组学。Nat Med 15（8）：842-844。
Shackleton，M.，Vaillant，F.，Simpson，KJ，Stingl ，J.，Smyth，GK，Asselin-Labat ，ML，Wu，L.，Lindeman，GJ和Visvader ，JE（2006）。从单个干细胞生成功能性乳腺。自然439（7072）：84-88。
Sun H，Miao，Z.，Zhang，X.，Chan，UI，Su，SM，Guo，S.，Wong，CKH，Xu，X. and Deng，CX（2018）。单细胞RNA-Seq揭示了小鼠乳腺上皮细胞的异质性和层次。生物化学杂志293（22）：8315-8329。