材料和试剂

0.2 µm过滤装置-150 ml （Thermo Fisher Scientific，目录号：150-0020）
13 x 100 mm玻璃培养管（Fisher，目录号：14-961-27 ）
15厘米普通木涂药器（Fisher，目录号：23-400-102 ）
1.7 m l 微量离心管（VWR，目录号：87003-294 ）
25 x 75 mm玻璃显微镜载玻片（Fisher，目录号：12-544-4 ）
22 x 30 mm 1.5号盖玻片（VWR，目录号：48393-150）
25滑加湿室（Daigger Scientific，目录号EF15989A）
酵母菌株（见注1）
SLJ10800 （MATa / αSPC42- mTurquiose2-NATMX / Spc42- YFP-HIS3MX bar1 / bar1 ADE2 / ADE2 trp1-1 / TRP1lys2Δ/ LYS2 leu2-3,112 / leu2-3,112 his3-11,15 / his3-11,15 ura3- 1 / ura3-1 ）
SLJ6209（MATa SPC42- mCherry-URA3MX bar1 ADE2 trp1-1lys2Δleu2-3,112 his3-11,15 ura3-1 ）
SLJ7904（MATa / αSPC110- GFP-KANMX / Spc110 bar1 / bar1 ADE2 / ade2 trp1-1 / TRP1lys2Δ/ LYS2 leu2-3,112 / leu2-3,112 his3-11,15 / his3-11,15 ura3-1 / ura3- 1 ）
SLJ12889（MATa Spc110- mTurquiose2-HIS3MX bar1 ADE2 TRP1lys2Δleu2-3,112 his3-11,15 ura3-1 ）
我们在BY4741（MATa YFG :: YFP-GFP 1-10 -URA3MX his3∆1 leu2∆0 ura3∆0）中通过PCR标记方法在N或C末端与GFP 1-10 融合的酵母ORF的大型文库met15∆0 LYS2 ADE2 ）。为了检查分配到细胞核，管腔，ER /外核膜或细胞质中，我们创建记者用于与每个隔室的mCherry - GFP 11 从pRS305 / pRS315质粒表达（Gardner和Jaspersen，2014 ; Smoyer 等人，2016）（见注2-4）

细菌培养用-酵母提取物
杆菌蛋白pe
葡萄糖
细菌培养用-琼脂
含氨基酸的硫酸铵酵母氮碱
CSM粉末（Sunrise Science，目录号：1001-100）
16％多聚甲醛（Ted Pella，目录号：18505）
蔗糖
小号憎恨氯化物（NaCl）中
P otassium氯化物（氯化钾）
D 磷酸钠
中号onopotassium磷酸盐
ProLong Diamond安装介质（Thermo Fisher，目录号：P36961）
DeltaVision 浸油套件；包含折射率从1.500到1.534 的18种油的瓶子（GE Healthcare，目录号：29163068）
E thanol（Amresco ，目录号：64-17-5）
YPD板（请参阅食谱）
SC完整肉汤（请参见食谱）
注意：我们通常不在YPD液体培养基中培养细胞，因为它会产生很高的背景荧光水平。

4％多聚甲醛溶液（请参阅食谱）
PBS（请参阅食谱）

设备

2升烧瓶
旋转管式混合器（费舍尔小号系统求解，目录号：346）
23 °C 恒温箱（VWR，货号：7774 ）
培养滚筒（新不伦瑞克省TC-7，目录号：M1053-4004 ）
台式离心机（Eppendorf 5424，目录号：022620401 ）
移液器（Gilson P10，目录号：F144802）
BioPhotometer生物分光光度计仪（Eppendorf，米Odel等：6131，目录号：62111-460）
ģ Ë医疗OMX结构照明显微镜（GE Healthcare公司DeltaVision OMX火焰V4 ）具有三个科学互补金属氧化物半导体（SCMOS ）摄像机和6条的激光线，或类似的显微镜（例如尼康的N- SIM，蔡司伊利里亚）
奥林巴斯PLANAPO N 60 x ，1.42 NA油浸物镜
DeltaVision OMX通道/图像注册幻灯片（GE Healthcare，目录号：53-852891-000）
徕卡倒置共焦SP8 配备：
白光激光（470-670 nm范围）
一个ñ氩激光
3台Leica HyD 检测器
带有Hyvolution 模块的Leica Application Suite软件
我们的显微镜是定制的，但可在https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-x/获得类似的范围

Leica 100 x ，1.4 NA HC PL APO油CS2物镜

软件

OMX采集计算机和软件v3.70（GE Healthcare，http： //incelldownload.gehealthcare.com/bin/download_data/OMX/V3.70/DeltaVisionOMX.htm ）
安装了softWoRx v6.52（GE Healthcare，http: //incelldownload.gehealthcare.com/bin/download_data/SoftWoRx/6.5.2/SoftWoRx.htm ）软件的OMX图像处理站
ImageJ（用于图像处理分析的Java软件；可从http://rsbweb.nih.gov/ij/或http://Fiji.sc免费获得）（Schindelin 等人，2012年）
ImageJ插件（在Stowers 医学研究所显微镜中心创建；可从http://research.stowers.org/imagejplugins/index.html免费获得）
用于图像采集的Leica Application Suite X（LAS X）软件（版本3.1.5.16308）（Leica Microsystems）
惠更斯专业版17.10.0p5.64b，科学体积成像BV，希尔弗瑟姆，荷兰

程序

样品制备
酵母菌的生长与培养
从YPD平板上捡起一个菌落，接种到2 ml SC完全培养液中。在旋转细胞培养管混合器中以50 rpm 在23 °C下培养过夜。
注意：将SC完整的肉汤保存在密闭的橱柜中或用箔纸包裹，因为长时间暴露在阳光下会形成沉淀，从而增加自发荧光。

第二天，用BioPhotometer 测量过夜培养物的OD 600 ，以便可以将培养物在2 ml SC完全肉汤中稀释回OD 600 0.2-0.3。继续在23 °C下生长3-5小时，直到细胞的OD 600 达到约0.8。如果要研究对温度敏感的等位基因，则在23 °C 下生长2小时后，还要再移至34-36 °C 4小时。
酵母样品制备
当OD 600 达到0.8或温度变化后，进行收获培养。通过在室温下在微量离心机中以13,400 xg 旋转1分钟，在微量离心管中沉淀1-2 ml细胞。
吸出培养基并将细胞重悬于1 ml 4％多聚甲醛溶液中。置于23 °C的旋转管式混合器中15分钟。
自旋为1分钟，在13400 ×g下在一个微量在室温下。
吸出培养基并将细胞重悬于1 ml PBS中。
自旋为1分钟，在13400 ×g下在一个于室温下离心和除去PBS。再重复两次。最后一次清洗后，请小心除去所有剩余的液体。
加入适量的ProLong Di amond 固定培养基，以在样品中获得所需的细胞强度，通过低速短暂涡旋重悬细胞沉淀以避免气泡的产生。
用移液管吸取5 µl到干净的22 mm x 30 mm盖玻片上。使用移液器吸头将细胞散布在表面上。
注意：盖玻片和载玻片均应使用70％乙醇清洁，并在不起毛的表面（如镜纸）上干燥。

用干净的载玻片覆盖，用力按压以确保单元在两个玻璃表面之间形成单个单层。
注意：准备样品时，重要的是，细胞距盖玻片表面的距离小于10微米，以进行SIM成像。

将盖玻片朝下放置在密封的加湿室内。
在室温下于黑暗中孵育至少18-24小时。载玻片可在4 °C下最多保存3天，此后信号减弱，背景增加。如果您预计样品会导致信号暗淡，建议您立即对其成像以取得最佳结果。

使用GE Healthcare OMX 采集多张彩色SIM卡图像
我们使用配备了Olympus PlanApo N 100x 1.42 NA油镜的GE Healthcare DeltaVision OMX Blaze V3 获取多色3D-SIM图像。我们首先通过对准摄像机开始，然后进行示例。这确保了日常重现性。该协议专门针对DeltaVision OMX Blaze；如果使用其他仪器，请遵循制造商的建议说明。

幻灯片对齐
将GE对位幻灯片放入幻灯片支架。移动载物台以找到滑块的中心，并找到一个20 x 20的网格，该网格由100 nm的孔组成，间距为5 µm。
选择“常规”作为光路，将照明强度（软件中的DIC）设置为50％或100％。启用多个摄像机（例如，mCherry，GFP，DAP），并调整单个通道的曝光时间。
监视强度直方图并调整各个通道的曝光时间，以使所有通道的平均强度相似。
将图像尺寸设置为1024 x 1024（OMX系统上的最大尺寸），并获得3 µm的z堆栈图像，z间距为125 nm。
由于拐角处的照明不均匀，我们使用获取的图像的中心部分进行对齐。我们使用软件softWoRx（OMX系统上用于影像处理的集成软件）裁剪图像（将“输出选项”：X / Y / Width / Height设置为112/112/800/800或类似值）。将裁剪的图像加载到softWoRx并在“处理”下进行处理，然后在“创建OMX图像对齐”下进行处理。
确保已选中“显示对齐的目标图像”复选框（Demmerle 等，2017）。显示所有频道并仔细检查图像，尤其是在角落。确保每个通道中的孔都共同定位。该制造商的说明书显示图像排列第4页一个很好的例子（http://incelldownload.gehealthcare.com/bin/download_data/SoftWoRx/7.0.0/DVOMXSR_ImageAlignment_04-720165-000CC.pdf）。
mTurquiose2和YFP对齐评估
注意事项：

为了显示单个图像，我们通常使用双线性插值在ImageJ中将图像缩放四倍（“图像”>“缩放”）。为了进行拟合和分析，我们将图像保留原始比例。
我们通常更喜欢将mTurquoise2和YFP一起成像，因为它们在酵母中具有相似的折叠动力学。使用mCherry 或其他常见的红色荧光蛋白，例如mKate2和TagRFP657 ，可以轻松地将类似的实验扩展为三种颜色。m Kate2和TagRFP657均具有高激发和发射波长，因此在我们当前的设置下与GFP和mTurquoise2 没有串扰。在当前的研究中，mCherry 相对于GFP 的缓慢折叠动力学使实验数据更难以解释，而mTurquoise2和YFP则不存在此问题。
SW 系统痒“S I”模块。接下来，用二倍体酵母菌株SLJ10800获得一个2色图像1.5 µm z堆栈（间距= 0.125 µm）。在菌株中，Spc42在内源性基因座分别用mTurquiose2和YFP标记。Ë ，VEN如果一个不工作的主轴极体，因为它们形成小的一个定义的大小和分布，该酵母菌株，以评估色彩有用的，明亮的斑块与SIM对齐。
设置2通道SIM采集与正确的激发激光（514纳米和445纳米）和发射滤光器，和图像YFP第一和后续编通过mTurquiose2。
如果可能，我们将两个通道的曝光时间设为50-100毫秒。较长的曝光时间可能会由于样品和/或机械漂移而导致伪影。较短的曝光时间需要较高的激光功率，并可能导致光漂白。
我们使用10％或1％的激光功率（最大激光输出100 mW）激发两个通道。监视相机直方图，并相应地调整曝光时间和激光功率，以使信噪比达到5或更高。
对于mTurquiose2和YFP，我们使用折射率（RI）为1.514或1.516的浸入油；在其他实验中，我们将RI为1.516-1.518的浸入油用于mCherry和GFP。最佳的浸油对成功重建至关重要，它很大程度上取决于信号与盖玻片之间的距离。由于尺寸小，酵母细胞中感兴趣区域（SPB）与盖玻片之间的距离非常恒定，并且小于几微米。对于其他样本，距离可能会有很大变化。请参考最近的两个协议文件以调整最佳浸油（Demmerle 等，2017 ; Wang 等，2018）。
使用步骤B 2中创建的对齐文件，通过运行softWoRx对齐协议来对齐成功重建的图像。
在ImageJ中打开重建并对齐的（SIR_ALX）图像。以最大强度执行Z投影（图像>堆栈> Z项目），以覆盖z维度中的整个SPB。使用ImageJ中的线条工具在图像中的2个SPB上画一条4像素宽的线条（图2A）。使用“ polyline kymograph jru v1”测量沿线的平均强度。
验证沿两个通道的线测得的SPB强度具有相似的模式。两个SPB的强度峰应重叠良好，且偏移小于1个像素（40 nm）（图2B）。
注意：由于采集过程中的机械偏移或样品漂移，SIM卡始终会发生轻微的未对准。单粒子平均将进一步提高分辨率和对齐精度（Burns等，2015）。为了最大程度地减少未对准，请确保严格遵循对准校准，并确保酵母已正确固定在盖玻片上。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902852--1282 Sue Jaspersen 784189 \ Figs jpg \图2.jpg

图2.酵母SP B 处的mTurquiose2和YFP比对评估。A. Spc42-YFP和Spc42-mTurquiose2信号在SLJ10800菌株中相距约150 nm的两个SPB子结构处的可视化，此处显示为沿z轴的最大强度投影。B.测量YFP和mTurquiose2通道中两个点之间强度的线轮廓表明颜色对准误差小于1像素（40 nm）。

如果通道未对齐，请从颜色对齐幻灯片开始重复对齐协议。
要将mCherry与mTuruqoise2和YFP 对齐，请从颜色对齐幻灯片开始重复对齐过程。使用多色样品通过步骤B2b-B2f进行比对。

使用Leica SP8 采集三色HyVolution 图像
我们通常通过SIM和常规共焦系统对三色样本进行成像。GFP（或分裂GFP）具有一个集中在约488 nm处的单个吸收峰，这是实验室中最常见的激光线之一，已被常规用于激发GFP。然而，由于在发射和激发分布方面都存在明显的串扰，因此GFP（或分裂GFP）和mTurquiose2的组合是有问题的。在分别对GFP和mTurquiose2使用488 nm和455 nm激发的常规系统上的传统成像方法不会产生无串扰的图像。必须采取纠正措施以消除串扰。另一种选择是使用光谱成像（Zimmermann 等，2003）。但是，特别是在mTurquiose2通道中的暗淡样本，加上来自GFP的大量串扰，可能导致对正信号的误解。下面我们描述解决该问题的另一种方法。

三种颜色的光谱设置

在TCS SP8模式下运行LAS X软件。用mCherry ，重构的split-GFP / GFP和mTurquiose2 的顺序设置3张彩色图像的顺序模式。选择“帧间”作为频道切换的默认设置。
我们发现将GFP的激发从488 nm转移到496 nm大大降低了mTurquiose2的激发。重建的split-GFP / GFP在496 nm处的激发效率为89％，仅比488 nm处的值低10％，而转移到496 nm激发处，导致mTurquiose2的吸收效率小于0.02％（Lambert ，2019）。因此，使用496 nm激光线激发重组的split-GFP，并仔细选择发射滤光片，可有效消除mTurquiose2渗漏到重组的GFP / GFP（图3A）。
我们按以下方式设置3个通道的激发：mCherry （561 nm，白光激光或氩激光），重构的split-GFP（496 nm，氩激光），mTurquiose2（445 nm，白激光或氩激光）。由于重组分裂GFP的信号较弱且白光激光器的输出较低，因此我们使用功率更高的激光线（氩激光）来激发分裂GFP。
我们的SP8系统中没有针对496 nm激光线的陷波器。因此，我们使用内部偏振器去除了重组的GFP / GFP分离通道中的反射光。
在“ Fluorifier 光盘设置”面板中，设置了一个值“ 90”，为“波尔一个rizer ” 以去除反映编从显微镜光。
为了用3个HyD 检测器收集发射光子，发射滤光器的设置如下：mCherry ：570-635 nm或类似范围，重构的split-GFP / GFP ：508-550 nm；mTurquiose2：463-495nm。mTurquoise2通道处的发射滤光片设置将阻止来自重构的split-GFP / GFP通道的约94％发射光子（图3B）。
在采集软件LAS X 中将图像模式切换为HyVolution ，并使用mCherry 聚焦样品。我们首先使用HyVolution中的默认设置。在LAS X中，通过缩小针孔的尺寸来提高显微镜分辨率。接近0.6 AU（通风单位）的针孔可在分辨率和信号强度之间进行补偿（Borlinghaus和Kappel，2016年）。
的SPB含有〜1 ，各组分的000份所以它是串扰的公共源极和在多色成像实验渗出通过（例如，穆勒等人，2005）。使用HyVolution 模式，我们仅使用标记有mCherry （SLJ6209），GFP（SLJ7904）和mTurquoise2（SLJ12889）的酵母菌株验证了3种彩色成像设置。对于仅包含GFP的酵母菌株SLJ7904，当我们在445 nm激发（mTurquoise2激发）时，我们未在mTurquoise2通道（463-495 nm）中观察到发射（图3C，上图，左）。同样，当我们仅在GFP通道（508-550 nm）中496 nm处的SLJ12889菌株中激发mTurquoise2 时，未观察到mTurquoise2发射（图3C，中央面板，右图）。出于可视化目的，我们对所有图像应用滤镜（高斯模糊，1像素），将对比度设置为0-30，但Spc110-GFP的激发波长为488 nm ，由于强信号，对比度设置为1-67（图3C）。由于高反射，GFP通道具有较高的背景，SLJ7904和SLJ12889均没有mCherry 信号（数据未显示）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902852--1282 Sue Jaspersen 784189 \ Figs jpg \图3.jpg

图3.三色HyVolution图像，用于研究多个SPB组件。一。3个通道（mCherry，split-GFP / GFP和mTurquiose2）的吸收光谱和激光照射。乙。这3个通道的发射频谱和发射滤波器设置。Ç 。在HyVolution模式下，使用指定的光谱设置对SLJ12889（Spc110-mTurquiose2）和SLJ7904（Spc110-GFP）成像。mTurquiose2显示了在508-550 nm发射滤光片上使用488 nm激发（右图）显示的信号串扰（箭头指向右），但是在相同发射滤光片（中图右侧）在496 nm激发下未观察到渗漏现象。

笔记

该协议是为酿酒酵母开发的，但可以应用于其他系统。我们使用在腺嘌呤生物合成途径中不包含突变的酵母来限制自发荧光的数量（Weisman 等，1987）。这极大地改善了信噪比，这对于暗淡样品至关重要（Unruh 等人，2018）。使用先前描述的基于PCR的方法对基因进行标记（Gardner和Jaspersen，2014）。我们通常在23 °C（而不是30 °C）下生长酵母，以减慢细胞生长，由于改善了荧光团的成熟度，因此会产生更多的荧光蛋白。
当使用BiFC 研究蛋白质-蛋白质相互作用时，重要的是要考虑目标蛋白质的拓扑，尤其是完整的膜蛋白。拆分的GFP的两半必须位于同一隔室中，例如细胞核或细胞质，才能重构功能性GFP。因此，在N 或C端加标签可能是首选。还必须执行适当的控制，例如仅载体和突变/不同亚基，以确认相互作用的特异性（参见Chen 等，2019）。
分裂GFP的一部分GFP 11 只有25个氨基酸长。我们一直无法找到可识别GFP 11 的市售抗体，因此我们通常将mCherry 用作GFP 11 融合体的一部分。mCherry 可以添加到相反的末端，或在目标和GFP 11之间。重要的是，GFP 1-10 和GFP 11 都位于最终融合蛋白的N或C端，因此它们能够相互作用。
在我们的研究中，N末端标记的mCherry-GFP 11 融合蛋白在CDC4 2 启动子下表达。来自该启动子的表达略高于内源表达，但是它足够低以至于两个对照蛋白不相互作用（Smoyer 等，2016；Chen 等，2019）。为了促进酵母中的最佳表达和稳定性，我们使用了所有荧光蛋白的酵母密码子优化版本，包括mCherry-GFP 11 和GFP 1-10 。这些PCR标签质粒和报告基因已保存在AddGene （https://www.addgene.org/search/advanced/?q=jaspersen）。

菜谱

YPD板（1 L）
10克细菌用-酵母提取物

20克Bacto-蛋白p

20克葡萄糖

20克Bacto- 琼脂

950毫升ddH 2 O

在2 升烧瓶中将前三种成分溶解在水中，然后将Bacto- 琼脂和大的搅拌棒一起加入。灭菌30分钟。高压灭菌后，将其放在搅拌板上，直到液体冷却至〜50-60 °C。倾大致25米升的液体进入15厘米P 使用无菌技术ETRI板。让媒体充分冷却和平板干燥1-2 d AYS 。

SC全汤（1 L）
6.7 g含酵母的酵母氮碱，不含氨基酸

20克葡萄糖

2.0克CSM粉末

混合后让她高压灭菌

4％多聚甲醛溶液（80毫升）
20 ml 16％多聚甲醛（EM级，不含甲醇）

11.7克蔗糖和60毫升ddH 2 O

P 通过0.2微米的过滤器的屁股

储存在4°C的避光容器中。在1-2个月内使用此解决方案

注意：盖玻片和载玻片均应使用70％乙醇清洁，并在不起毛的表面上干燥，例如镜头纸。

PBS（1升）
8克氯化钠

0.2克氯化钾

1.42克磷酸二钠

0.24 g磷酸一钾

1 ，000毫升的DDH 2 ö

调节pH至7.4

致谢

在此项目过程中，我们感谢显微镜中心和Jaspersen 实验室的意见。该出版物中报道的研究得到了Stowers 医学研究所和国立卫生研究院，国立普通医学科学研究所的支持，授予的编号为R01GM121443（授予SLJ）。作者宣称没有任何竞争的经济利益。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或利益冲突。

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