材料和试剂

裸金传感器磁盘（Metrohm Autolab ，目录号：1-04-04-000）
384孔透明平底聚苯乙烯未经处理的微孔板，带盖，无菌（Corning，目录号：3680）
6孔未处理的透明多孔板（Corning Costar，目录号：3736）
浸油
脱矿质水（Sigma-Aldrich，目录号：38796）
巯基十一烷酸（11-MUA）（Sigma-Aldrich，目录号：450561，MW 218.36 g / Mol）
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（Sigma-Aldrich，目录号：130672，MW 115.09 g / Mol）
二甲氨基丙基-N ' 碳二亚胺N-3-盐酸盐（EDC）（Sigma-Aldrich，目录号：03450，MW 191.70 g / Mol）
乙醇胺（Sigma-Aldrich，目录号：E6133，MW 97.54 g / Mol）
三水合乙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8625，MW 136.08 g / Mol）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：A6283）
HEPES钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：H7006，MW 260.29 g / Mol）
乙醇 ≥ 99.9％（Merck公司，目录号：100983）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653，MW 58.44 g / Mol）
氢氧化钠（NaOH）（Merck，目录号：1.06498，MW 40.00 g / Mol）
盐酸（HCl），37％（Merck，目录号：100317）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
氮气（Sigma-Aldrich，目录号：295574）
11-MUA解决方案（请参阅食谱）
400 mM EDC（请参阅食谱）
100 mM NHS（请参阅食谱）
1 M乙醇胺（请参阅食谱）
1 M醋酸盐缓冲液（请参阅食谱）
1 M HEPES缓冲区（请参阅食谱）
5 M NaCl（请参阅食谱）
1 M NaOH（请参阅食谱）
1 0％补间20 （请参阅食谱）
缓冲区1：耦合缓冲区（请参见配方）
缓冲区2：关联缓冲区（请参阅食谱）
缓冲区3：再生缓冲区（s 配方）
P rotein解决方案（见食谱）

设备

镊子
移液器
的Autolab SPR ESP RIT（万通，米Odel等：AUTOLAB ESPRIT）
桌面高速离心机仪（Eppendorf，米Odel等：5430R）
过滤单元（Milipore ，米Odel等：XX1514700，和简单的注射器过滤器）

软件

Autolab 数据采集程序
Autolab 动力学评估程序

程序

金盘传感器的准备（图5）
用镊子将裸金盘小心地放在6孔板中，并使金表面朝上。
加入11-MUA的溶液（配方1）并小心地盖好板。
在该溶液中将圆盘孵育过夜，以在金表面上获得均匀的硫醇层。将该板用箔覆盖并在室温下孵育。
第二天，用乙醇洗涤三遍，以去除多余的硫醇基团。为此，用移液管吸出11-MUA溶液并用乙醇吸管。乙醇的体积应足以完全浸没磁盘。轻轻摇动板以冲洗磁盘。
要除去乙醇，请用软化水洗涤三次，同时轻轻摇动板以冲洗金片。
彻底清洗后，通过用氮气冲洗孔来吹干圆盘。
现在，这些磁盘在室温下最多可以在其容器中存储2个月。

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图5.准备金传感器盘。该图说明了文本中提到的步骤A1至A7的所有步骤。

设置传感器盘（图6）
在半圆筒的外边缘上放一小滴浸油。
用镊子将11-MUA涂层金盘放在另一端。现在，只需轻轻滑动磁盘，直到将其正确安装到半圆柱体上即可。
确保金表面朝上。
圆盘和半圆柱体上的浸油之间应没有气泡。

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图6.在半圆柱体上设置金盘。B1。通过在其上添加一滴浸油来制备半圆筒。B2。将镀金的圆盘放在油滴上，然后用镊子将其滑过。

固定蛋白质（图7）
将缓冲区1（耦合缓冲区）传递到修改后的金盘上。这会水化金表面并稳定硫醇层（配方10）。
在384孔微孔板中，将固定过程所需的所有溶液分配到第1列的孔中，如图7所示。
添加80 微升EDC（400 中的孔1A和1B毫摩尔），随后在80 微升NHS的（100 毫摩尔）的两个孔1C和1D。
将1E和1F留空以混合EDC和NHS。该混合物将激活金传感器盘，以固定配体蛋白。
在1G和1H孔中添加80μl 配体蛋白（例如：5 mg / ml EhP3）。
最后，在1I和1J中添加80μl 乙醇胺（1 M），用于阻塞传感器上的剩余未结合区域。
如图1所示，将384孔板放在架子上。
使用以下步骤在数据采集软件中设置数据采集时间：
步骤时间

基线（耦合缓冲区）120 s

激活（EDC / NHS）300秒

偶联（配体蛋白）900 s

阻断（乙醇胺）600 s

再生（耦合缓冲）120 s

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图7。此协议中使用的384孔板。板中使用的每个孔均在此处标记。

互动研究
在384孔微孔板的第2列中，添加分析物的不同稀释液，即，将被用于确定其关联动力学蛋白（或不同的蛋白）。
在井2A中，添加80 微升分析物1（的Ë xample：细丝蛋白）[ 或一个稀释（1 μ 中号的单一蛋白质的）（Ë xample：EhCoactosin ）] ，随后在80 微升缓冲液2（协会缓冲液）的（配方11 ）作为参考。
类似地，添加80 微升的所有分析物的（Ë xamples：Actophorin ，profilin的A，profilin的B，Twinfilin ，EhCoactosin ）或（Ë xamples：2 μ 中号，4 μ 中号，8 μ 中号，10 μ 中号的EhCoactosin ）转换成替代孔，然后在每个连续的孔中添加缓冲液2（关联缓冲液）。
使用缓冲液2作为分析的运行缓冲液。
使用以下孵育时间进行相互作用研究：
步骤时间

基线120秒

关联300 s

离解300 s

再生120 s

SPR分析还像其他任何蛋白质-蛋白质相互作用研究一样使用对照。牛血清白蛋白通常用作阴性对照，即，除非在焦点结合于它的蛋白特异性。BSA通常不结合大多数蛋白质。同样，如果已知任何已知的相互作用蛋白，则可以将其用作阳性对照。此外，研究中使用的缓冲液应与所有蛋白质相容。这可以通过在所有要使用的缓冲液中稀释少量蛋白质来检查，并检查是否有沉淀。

数据分析

使用AutoLab Kinetic Evaluation软件获得“差异曲线”（图8 ）。用这些来确定K个上和ķ 关闭，随着与亲和常数KD。如果显示的KD值较小，则两个分子之间的相互作用强度据说会更高。KD值越高，表示相互作用的分子之间的吸引力越弱。K on 表示缔合常数，单位为min -1 乘以浓度-1 。K off 是解离常数，单位为min -1 。亲和常数由摩尔单位的K off / K on 的比率确定。

的V 记意1 可以看出对数据进行分析的步骤。

打开动力学评估软件。
遵循视频1中显示的步骤。

视频1.使用动力学评估软件的步骤

选择从Data Acquisition软件中保存文件的文件夹。
在文件夹中，选择为蛋白质相互作用研究记录的所有注射系列。
在左侧上角，标题下的“创建文件”，单击新的覆盖，并选择要用于动力学分析的所有注射。
在此之后点击信号处理选项卡上的左侧底角。单击缩放并选择关联曲线之前的感觉图区域。在“操作” 的下拉标签下选择同步。接下来，点击同一标签下的“规范化”并应用。
要删除再生曲线，请单击“删除选择”，然后选择解离曲线后的区域。
再次单击规范化。
关闭选项卡，然后在“创建文件”下打开“新建项目”，并使用适当的名称保存数据。
接下来，打开分析向导，选择平衡，单击下一步。在此之后以各自的浓度进料。
最后，单击下一步，可以成功执行动力学参数的计算。

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图8.固定化EhP3的细胞骨架蛋白的SPR分析。A. 表面等离子共振用于确定EhP3与细胞骨架蛋白（如Filamin，Actophorin ，Profilin A和B，Twinfilin 和EhCoactosin）之间的相互作用。EhP3通过酰胺偶联共价固定在金传感器上。此处显示的是以200 nM 浓度注入的各种蛋白质的传感图。B. 基于（A）中观察到的感应图，我们描述了此卡通模型中的相互作用，其中只有EhCoactosin 显示与EhP3结合。其他蛋白质不能与固定化的蛋白质EhP3结合。C. 此处显示浓度不断增加的EhCoactosin 注射液的传感图。使用平衡结合曲线推导亲和常数KD。重组His 6 -Ecocoactosin 的浓度显示在结合曲线旁边。

笔记

用于SPR研究的蛋白质的理想缓冲液是HEPES，但是如果蛋白质的稳定性成为问题，则应将任何其他缓冲液的浓度保持在最大50 mM。
EDC和NHS应优选新鲜制备，因为它们在溶液中不太稳定。如果准备量较大，应将其存储为300μ升在-20℃等份如作为解冻长下一次。但是，不建议在解冻一次后将其保存。
在乙酸盐缓冲液中配体的制备应始终新鲜进行。此外，在整个固定过程中应保持相同的乙酸盐缓冲液原液。
如果蛋白质不同，偶联缓冲液的pH值可能会有所不同。可以使用通用方程式确定偶联缓冲液的pH：pH（缓冲液）= pI （配体蛋白）-0.5。pI 是蛋白质的等电pH，在该pH下其所有负电荷都等于其所有正电荷，从而使其呈电中性。从理论上可以计算出任何具有已知氨基酸组成的蛋白质。
SPR角的偏移与结合材料的数量之间存在线性关系。120 m°的变化代表〜1 ng / mm 2的表面蛋白质质量的变化。
本机不建议使用大多数有机溶剂，请避免在任何样品前处理中使用这些有机溶剂。
具有最低折射率的醋酸盐缓冲液可提供最小的SPR角，因此是固定化过程的最佳缓冲液。乙醇胺溶液记录了最大的SPR角。
对于任何新的蛋白质-蛋白质相互作用，通常可以参考这些蛋白质的可用数据（如果有）来确定浓度。否则，可以先采用多种浓度，例如50 nM - 500 nM。如果在该范围没有给出信息，一个可以增加范围高达2 μ 中号。根据这些反应曲线，可以为特定的蛋白质组选择理想的浓度。
仪器维护：
由于浸油不可避免地溢出，应定期清洁半圆筒。如图2所示，应小心卸下M3X3螺钉，并用乙醇或在超声波水浴中清洗半圆筒。要干燥设备，必须仅使用镜头纸。清洁和干燥后，必须放置半圆筒并将其拧回到滑块上。
为了避免溶液从比色皿中蒸发，请用对位膜覆盖。
始终用蒸馏水清洁仪器。使用任何类型的缓冲剂都会导致盐沉积，从而使涂层无用。
注射泵的密封件应每年更换一次，以使仪器达到最佳性能。

菜谱

11-MUA解决方案
11毫克巯基十一烷酸

50毫升乙醇

过滤器对溶液进行灭菌以获得最佳结果

400 mM EDC（2毫升）
153.4毫克EDC

2毫升去离子水

100 mM NHS
23毫克NHS

2毫升去离子水

1 M乙醇胺
盐0.97克

9毫升的去离子水

使用HCl将其pH值调整为8.5

最后补足10毫升

1 M醋酸盐缓冲液pH 4.5
盐1.36克

9毫升的去离子水

用乙酸调节pH至4.5

最后，将体积补足至10 ml（Abdul Rehman 等人，2013）

1 M HEPES缓冲液pH 7.5
盐26.03克

80毫升的去离子水

用HCl调节pH值至7.5

最后补足到100 ml

5 M氯化钠
盐29.22克

100毫升的去离子水

1 M氢氧化钠
0.4克NaOH

10毫升的去离子水

10％吐温20
用去离子水配制

缓冲区1（耦合缓冲区）
用去离子水将0.5 ml醋酸盐缓冲液稀释至50 ml溶液

缓冲液2（关联缓冲液）（1 L）
10 ml 1 M HEPES缓冲液pH 7.5

从其储备溶液中提取30 ml NaCl

0.5毫升10％吐温20

用去离子水将最终体积补足至1 L

筛选和使用

缓冲区3（再生缓冲区）
从NaOH储备溶液中取出2.5毫升

用去离子水补足至50毫升

P rotein解决方案
将mg / ml蛋白质浓度转换为摩尔浓度。使用以下公式：
μ 中号蛋白=（μ 克/ 微升的蛋白质）/ （在Da MW）

接下来，稀释缓冲液2中的蛋白质储备液，以制备100μM 的工作储备液。
使用以下计算在缓冲液2（关联缓冲液）中准备稀释液：
样品名称蛋白质工作储备液的体积缓冲液2的体积

稀释1（1 μ 中号）1 微升99 微升

稀释液2（2 μ 中号）2 微升98 微升

稀释3（4 μ 中号）4 微升96 微升

稀释4（8 μ 中号）8 微升92 微升

稀释5（10 μ 中号）10 微升90 微升

当对一种蛋白质使用不同的蛋白质时，请对所有蛋白质使用相同的稀释液（在缓冲液2中稀释）。将所有用作工作储备液的蛋白质稀释1μM 。取20 升这种储备液，并添加80 升缓冲液2以制备200 nM 溶液。
蛋白质名称浓度

分析物1（例如：EhCoactosin ）200 nM

分析物2（例如：Profilin A）200 nM

分析物3（例如：Profilin B）200 nM

分析物4（例如Filamin）200 nM

分析物5（例如：Twinfilin ）200 nM

分析物6（例如：Actophorin ）200 nM

致谢

我们感谢高级仪器研究机构，JNU和Manu Vashistha 进行SPR研究。我们还要感谢Alok Bhattacharya教授（印度新德里的Ashoka大学）和Samudrala Gourinath 教授（印度新德里的Jawaharlal Nehru大学）在研究过程中为我们提供了必要的帮助。SA感谢科学技术部颁发的DST激励教师奖和补助金。PPR感谢科学和工业研究理事会（CSIR）的SRF奖学金。

利益争夺

作者宣称不存在任何竞争利益。

参考文献

Abdul Rehman，SA，Verma，V.，Mazumder ，M.，Dhar，SK和Gourinath ，S.（2013年）。幽门螺杆菌primase的C末端结构域的解旋酶结合的晶体结构和模式。Ĵ 细菌学195（12）：2826至2838年。
Agarwal，S.，Anand，G.，Sharma，S.，Parimita Rath ，P.，Gourinath ，S.和Bhattacharya，A.（2019）。EhP3，14-3-3家族蛋白参与的在肌动蛋白重组和吞噬同源阿米巴。PLoS Pathog 15（5）：e1007789。
戴维斯，TM和威尔逊，WD （2000年）。确定小分子的折射率增量，以校正表面等离子体共振数据。肛门生物化学284：348-353。
Kumar，N.，Somlata ，Mazumder ，M.，Dutta，P.，Maiti ，S.和Gourinath ，S.（2014）。EhCoactosin 稳定原生质虫Entamoeba histolytica中的肌动蛋白丝。PLoS Pathog 10（9）：e1004362。
Nguyen，HH，Park，J.，Kang，S. and Kim，M.（2015年）。表面等离子体共振：一种用于生物传感器的通用技术。传感器（巴塞尔）15（5）：10481-10510。