材料和试剂

50毫升猎鹰管
布
Eppendorf管
微管装载提示拉- 下来，比方说（索伦森，目录号：13791）
15 厘米细胞培养皿（Iwaki，目录号：3030-150）
玻璃小瓶（Maruemu 公司，第2号，目录号：5-098-04 ），6米升
NHS磁珠（GE Healthcare，NHS活化的Sepharose 4 Fast Flow 25 ml，目录号：17090601）
Photoaffinity P EG接头（Kondoh 等人，2015）
测试化合物（任何供应商）。除测试化合物外，将结构相似且无活性的化合物用作阴性对照。我们经常体验到，与裸露的磁珠相比，与负化合物结合的磁珠可作为更好的“阴性对照磁珠”
旋转柱（GeneDesign ，Inc.，EconoSpin 空柱，目录号：EP-31301）
小鼠胚胎成纤维细胞细胞系NIH3T3（从RIKEN Cell Bank获得，目录号：RCB1862）
人乳腺癌细胞MCF7（从RIKEN Cell Bank获得，目录号：RCB1904）
Dulbecco的改良Eagle Eagle培养基（D-MEM）培养基（Gibco ，目录号：C11995500BT）
胎牛血清（FCS）（Nichirei Bioscience Inc.日本东京）在DMEM中的使用率为10％
P enicillin和链霉素（笔链霉素，Gibco公司，目录号：在100倍稀释于DMEM中使用15140-122）
HEPES（Sigma，目录号：H3375）
HCl（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号080-01066）
NaCl（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号191-01665）
KCl （FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号163-03545）
Na 2 HPO 4 · 12H 2 O （FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：196-02835）
KH 2 PO 4 （FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号169-04245）
二恶烷（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号042-03766）
MQ水（MilliQ Q-POD，Millipore 生产的纯净水）
NaN 3 （FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号199-11095）
EDTA（FUJIFILM和光纯药，目录号345-01865）
测序级修饰胰蛋白酶（Promega，目录号：V5111）
乙腈（Nacalai tesque ，目录号00420-41）
TFA（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：201-06393）
甲醇（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号131-01826）
α- 氰基-4-羟基肉桂酸（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：037-19261）
NaHCO 3 （FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号191-01305）
NH 4 HCO 3 （FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：017-02875）
乙醇胺（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号012-12455）
Tris （FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：201-06273 ）
DTT （FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号042-29222 ）
碘乙酰胺（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：093-02892 ）
考马斯亮蓝R250 （CBB ）（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：031-17922）
醋酸（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号017-00256）
我sopropanol（FUJIFILM光纯药，目录号：325-00045）
十二烷基硫酸钠（SDS）（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号192-08672）
溴酚蓝（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号021-02911）
甘油（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号075-00611）
2-巯基乙醇（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：28625.01）
过硫酸铵（A PS）（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号802811）
N，N，N'，N'- 四甲基乙二胺（T EMED）（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号202-04003）
剃刀（FEATHER，货号：99077）
不含EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂（Roche diagnostic，曼海姆，德国，目录号：11836170001）
Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：23225）
含有蛋白酶抑制剂的洗涤/结合缓冲液（请参见食谱）
1个SDS缓冲区（请参阅食谱）
装订/清洗缓冲液（请参见配方）
水 HCl（请参阅食谱）
PBS（请参阅食谱）
耦合缓冲液（请参见配方）
阻止解决方案（请参见食谱）
脱色剂（请参见配方）
还原解决方案（请参见食谱）
烷基化溶液（请参见配方）
消化解决方案（请参阅食谱）
提取液1 （请参见食谱）
提取液2 （请参见食谱）
矩阵解决方案（请参见食谱）
染色解决方案（请参阅食谱）
脱色溶液（请参阅食谱）
10 x Tris-甘氨酸运行缓冲液（请参见食谱）
5％堆积凝胶（请参见食谱）
10％解析凝胶配方（请参见食谱）

设备

紫外线交联剂（UVP，紫外线交联剂，CL-1000）
LCMS（LC：沃特世，ACUITY UPLC H级，MS：SCIEX，API 3200 LC-MS / MS）
安捷伦烤箱（Agilent Technologies，杂交烤箱，G2545A）
高性能旋转蒸发仪（Scrum，Genevac ，EZ-2 plus）
旋转器（TAITEC ，型号：RT-50）
台式离心机（Corning，型号：6765）
用于15/50 ml和Eppendorf管的标准冷冻离心机（Tomy ，型号：MX-301）
学者SpeedVac离心浓缩器（赛默飞世小号系统求解，型号：SVC100H）
加热块（EYELA，型号：MG-1200）
ü ltrasonic浴（AS ONE，美国CLEANER US-1R）
超声波仪（Tomy ，型号：UR-20P）
平板式SDS电泳设备（NIHON-EIDO ，型号：NA-1010）
MALDI-TOF质谱仪（Ultraflex ，Bruker Daltonik GmbH）

软件

Biotools（Biotools版本3.2，Bruker Daltonik GmbH，https： //www.bruker.com/ ）
Mascot搜索程序（Mascot服务器，Matrix Science Inc，http：//www.matrixscience.com）

程序

补偿的UV稳定性检查ound
将少量（约0.1-0.3 mg）的化合物放入玻璃瓶中。
溶解化合物用20 微升的甲醇（或水溶性溶剂与相对低的沸点），并将其分成两个小瓶。
在35 °C下通过“ Med + Low BP混合物”溶剂模式在高性能旋转蒸发仪（Genevac ）上浓缩并真空干燥1 h 。
用紫外线交联剂用紫外线（365 nm; 4 J / cm 2 ）照射两个小瓶之一。
用甲醇溶解UV（+）和UV（-）化合物，并用LCMS分析。
比较UV（+）和UV（-）化合物的LCMS图表，并检查化合物对UV辐射的稳定性。

复合珠的制备
洗400 微升的NHS珠子用400 微升1 mM的水溶液。盐酸的3倍，并随后用400 微升在室温下偶联缓冲液3次。简要地说，添加的洗涤液，通过使用移液管尖端在2完全悬浮珠，在台式离心机离心吹打混匀，000 ×g离心一分钟，取出并丢弃上清液。
将8.9 mg（18μmol ）的光亲和性PEG接头溶解在400μl 的偶联缓冲液中，并添加至微珠中。
旋转（10 rpm）在37 °C的安捷伦烤箱中孵育磁珠悬浮液2小时。
用400洗珠微升缓冲液3倍机智耦合的ħ 步骤B 1。
加入1毫升的封闭溶液。
下在安捷伦烤箱旋转孵育珠悬浮液在37 ℃下为1个小时。
洗涤用400珠微升的甲醇3次，并随后用400 微升MQ水的3次离心柱。简要地说，加载洗涤液到旋转柱珠，放置在台式离心机在Eppendorf管中的柱，和离心机中在2 ，000 ×g下1分钟，之后收集到Eppendorf管滤液。
将珠子转移到玻璃小瓶中，并添加含有该化合物的甲醇基溶液（6μmol / 400μl 甲醇）。
浓缩并用高性能旋转蒸发仪（Genevac ）真空干燥1至1.5小时（取决于溶剂）。
使用UV交联剂4 J / cm 2 用UV照射珠子。
洗用400游离化合物微升甲醇（或水溶性溶剂）的15倍，随后用400 微升MQ水在旋转柱3次为在圣EP B 7。
将化合物珠悬浮在400μlPBS-1 mM NaN 3中，并储存在4 °C 直至使用。

P ULL - DO WN法
细胞裂解液的制备
共培养NIH3T3细胞和MCF7细胞（5：1; 2 X 10 6 和0.4 X 10 6 / 15cm培养皿，分别地）在d-MEM与含48小时，收获，洗涤用PBS青霉素和链霉素10个％FCS将其重悬于含有蛋白酶抑制剂的洗涤/结合缓冲液中。（我们通常使用20个15厘米培养皿中的大约2 x 10 8个细胞，并将细胞重悬在50毫升Falcon管中的10毫升洗涤/结合缓冲液中。将样品超声处理3分钟（开启30 s，关闭30 s）。置于冰上猎鹰管儿子期间ication）。
丢弃通过离心不溶性物质在4 ，400 ×g下在4℃下20分钟℃，并且将上清液转移到新鲜的falcon管。通常，使用的裂解物的浓度为约16mg / ml，并且我们使用含有大约为拉8 mg蛋白质的裂解物- 向下以30个微升化合物珠。根据他们的说明使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒进行蛋白质估计。
分装30 µl珠子（与测试化合物，阴性化合物和裸露化合物偶联），并使用宽口径尖端插入新鲜的Eppendorf管中。
加入300 µl洗涤/结合缓冲液洗涤磁珠，轻轻混合并以最大速度旋转30 s。小心丢弃上清液。重复此步骤两次。
在每个含有珠子的Eppendorf管中，在500 µl洗涤/结合缓冲液中加入含有8 mg蛋白的裂解物。（在4°C下执行所有步骤）
使用旋转混合器在温和旋转条件下于4 °C孵育含有磁珠和细胞裂解液的混合物至少3 h。
旋转并小心丢弃上清液。加入500 µl洗涤/结合缓冲液洗涤磁珠，轻轻混合并旋转。小心丢弃上清液。重复此步骤至少3次。
最后一次洗涤后，小心丢弃所有上清液。尽量不要留下任何上清液，也要注意不要使珠子移位。使用加载提示去除上清液。如果需要，可以将磁珠移入新的Eppendorf管中。
向小珠中加入30 µl 1x SDS缓冲液，将Eppendorf管在100°C下保持5分钟。
让样品冷却，然后使用SDS电泳设备（NIHON-EIDO NA-1010）将上清液加载到10％SDS-PAGE凝胶上，并使用CBB染色剂过夜进行染色。然后将凝胶在脱色溶液中洗涤至少两个小时。染色凝胶的一个例子如图1所示。显示了被分析的区域。

图1. NIH3T3和MCF7细胞以5：1的比例共培养，并将它们的细胞裂解液与对照珠，NPD8126珠或NPD8733珠孵育3小时。洗涤反应的珠，并使用SDS-PAGE分离洗脱的蛋白质，并通过CBB染色。与NPD8733珠特异性共沉淀的蛋白质通过MALDI-TOF-MS鉴定为VCP（箭头）。红色矩形框表示切出的用于蛋白质鉴定的凝胶部分的大致区域。

使用MALDI-TOF质谱通过肽质谱指纹图谱鉴定结合蛋白
切的感兴趣区域[ 通常为5 1mm×1mm的×1毫米（厚度）] 使用它（2.5毫米×为1mm×1mm）的剃刀和转印半到一个干净的Eppendorf管中。另一半存储用于备份。
加入400 µl水洗涤凝胶，孵育10分钟并弃去上清液。重复此步骤5次。
与100 µl 脱色剂在37°C下孵育10分钟。
加入200 µl乙腈洗涤凝胶，孵育10分钟并弃去上清液。重复此步骤两次。
干燥在真空下使用SpeedVac中浓缩在机器固定的旋转速度为在室温（不加热）约45分钟。随着脱水的进行，凝胶通常变得不透明。
向干燥的凝胶中加入50 µl还原溶液，并在加热块上于56°C孵育30分钟。
向凝胶中加入100 µl烷基化溶液，并在37°C下孵育30分钟，并用布覆盖以防光照。
用200 µl 100 mM NH 4 HCO 3 溶液洗涤凝胶，弃去上清液。
用200 µl乙腈洗涤两次，持续10分钟。
在干燥真空用SpeedVac中浓缩。
在冰上的干燥凝胶中加入3 µl消化溶液30分钟。
加入10 µl 10 mM Tris-HCl（pH 8.8），并在37°C下孵育过夜。
将上清液移至新的微管中。将10μl的提取液1添加到剩余的凝胶比特，并在用冰超声波浴孵育10分钟- 冷水在低鲍威R时。
除去上清液，并将其添加到步骤D 13中包含微管的上清液中。
添加10微升的萃取溶液2到剩余的凝胶位和孵育10分钟在用超声波浴冰- 冷水。
除去上清液到从含有上清液微管小号TEP d 13。
重复步骤D 15和D 16。
10微升的乙腈添加到剩余的凝胶比特，并在用冰超声波浴孵育10分钟- 冷水在低功率设置。
从步骤D 13 中将上清液移至含有微管的上清液中。
在干燥真空用SpeedVac中浓缩。
用3 µl的0.1％TFA（包括5％的乙腈）溶解。
在MALDI-TOF 质谱仪的目标板上，将0.25 µl样品和等体积的基质溶液混合。
通过在正离子反射器模式下操作MALDI-TOF质谱仪进行分析。

数据分析

通过肽质量指纹使用Mascot搜索程序（标准设置用于打印执行蛋白质鉴定胰蛋白酶处理基于由软件（产生的峰列表上样品）Biotools公司由制造商提供的）- [R （布鲁克道尔顿公司）。

菜谱

1个SDS缓冲区
0.0005％溴酚蓝

10％甘油

2％SDS

63 mM Tris HCl pH 6.8

0.1 ％2-M 巯基乙醇（使用前添加）

含有蛋白酶抑制剂的结合/洗涤缓冲液
50毫米HEPES

150毫米氯化钠

1毫米EDTA

调节pH 7.5并用MQ水调节体积

储存在4 °C

在使用前立即添加蛋白酶抑制剂（完整的EDTA游离鸡尾酒混合物片）

水 HC 升
1毫米盐酸

PBS
137毫米氯化钠

2.7 毫米氯化钾

10 mM Na 2 HPO 4 · 12H 2 O

1.8毫米KH 2 PO 4

耦合缓冲器
0.1 M NaHCO 3 水溶液：二恶烷= 1：1

阻塞解决方案
在0.1 M Tris-HCl pH 8.0缓冲液中加入1 M乙醇胺

脱色剂
50％乙腈和50 mM NH 4 HCO 3

还原液
100 mM DTT和100 mM NH 4 HCO 3

使用前立即准备新鲜

烷基化溶液
100 mM碘乙酰胺和100 mM NH 4 HCO 3

使用前立即准备新鲜

消化液
25 µg / ml胰蛋白酶在10 mM Tris-HCl pH 8.8缓冲液中

提取液1
0.05％TFA和50％乙腈

提取液2
0.03％TFA和66％乙腈

矩阵解决方案
溶于50％乙腈/0.1% TFA的α- 氰基-4-羟基肉桂酸（10 mg / ml）

染色液
0.3克考马斯亮蓝R250

250毫升异丙醇

300毫升乙酸

650毫升MQ水

脱色溶液
300毫升甲醇（30％）

100毫升乙酸（10％）

600毫升Milli Q水

10 x Tris-甘氨酸运行缓冲液
25 mM Tris

192 mM甘氨酸

0.1％SDS

5％堆积凝胶
Milli Q 1.4毫升

30％丙烯酰胺混合物0.33毫升

1.0 M Tris （pH 6.8）0. 25毫升

10％SDS 0.02毫升

10％APS 0.02毫升

TEMED 0.002毫升

10％分解凝胶配方
祢升李青1.9毫升

30％丙烯酰胺混合物1.7毫升

1.5 M Tris（pH 8.8）1.3毫升

10％SDS 0.05毫升

10％APS 0.05毫升

TEMED 0.002毫升

致谢

我们感谢RIKEN NPDepo 的成员提供了化学文库；在研究过程中，田中美穗（RIKEN），铃木武弘（RIKEN）和Naoshi Dohmae （RIKEN）进行蛋白质鉴定，而Harumi Aono （RIKEN）和Emiko Sanada （RIKEN）在研究过程中提供了持续的技术帮助。这项研究得到了JSPS KAKENHI（授权号J P16H06276，JP17H06412，JP17K077 83 ，JP18H05503，JP18K05366，JP18H02555，JP19H05302）和AMED（授权号JP19cm0106112）的部分研究支持。复合珠制备的方案是根据以前的工作改编的（Kondoh 等，2015 ）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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Kanoh ，N.，麻美，A.，Kawatani ，M.，本田，K.，Kumashiro ，S.，高山，H.，Simizu ，S.，雨宫，T.，Kondoh ，Y.，畠山，S.，Tsuganezawa ，K.，Utata ，R.，Tanaka，A.，Yokoyama，S.，Tashiro，H.和Osada ，H.（2006）。光交联的小分子微阵列作为解剖蛋白质-配体相互作用的化学基因组工具。亚洲化学杂志1（6）：789-797。
Kondoh ，Y.，本田，K和长田，H.（2015）。光交联化学阵列的构建和应用。方法分子生物学1263：29-41。
Lubec ，G。和Afjehi -Sadat，L。（2007）。质谱鉴定蛋白质的局限性和陷阱。Chem Rev 107（8）：3568-3584。
Suvarna，K.，Honda，K.，Muroi ，M.，Kondoh ，Y.，Osada ，H.和Watanabe，N.（2019）。含valosin的蛋白/ p97的小分子配体抑制癌细胞加速的成纤维细胞迁移。生物化学杂志294（9）：2988-2996。