设备

个人计算机，最好具有多个处理器（CPU）以加快计算速度
首选Unix / Linux操作系统。除可选的LaRA 程序外，此处提到的所有软件都可以在Mac 和Windows系统上运行。对于Windows，需要诸如Cygwin（http://www.cygwin.com/）或Ubuntu（https://www.microsoft.com/store/p/ubuntu/9nblggh4msv6）的终端或Linux模拟器。无论如何，都需要熟悉命令行驱动的应用程序的使用。

软件

MAFF T（Katoh and Toh ，2008 ，https : //mafft.cbrc.jp/alignment/software/source.html ）
R（R Development Core Team ，2018年，http：//www.R-project.org/）
R-chie（Lai 等，2012 ，https://www.e-rna.org/r-chie/）
（ø ptional）MXSCARNA（塔北等人，2008 ，https://www.ncrna.org/softwares/mxscarna/）
（ø ptional）拉拉（鲍尔等人。，2007 ，http://www.mi.fu-berlin.de/w/LiSA/Lara）
（ø ptional）FOLDALIGN（Sundfeld 等人，2016 ，http://rth.dk/resources/foldalign）
笔记：

MAFFT包以不同的形式提供。确保下载提供对RNA结构比对支持的捆绑软件，例如Unix / Linux扩展软件包，Mac的Standard软件包以及Windows的Ubuntu或Cygwin版本。
它不是NE cessary安装MXSCARNA单独作为它被包括在MAFFT封装内。
仅当您想将它们用作MXSCARNA的替代品时，才安装LaRA和/或FOLDALIGN 。LaRA 仅在Linux上运行。可能需要使用LaRA 1.3版，因为更高版本1.31和1.32经常中止。

程序

使用本地序列或从数据库下载序列，准备一组相关（同源）RNA序列进行分析。可以通过关键字搜索从通用数据库（如NCBI GenBank / RefSeq （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），ENA（https://www.ebi.ac.uk/ena）中检索序列。）或Ensembl （http：// www.ensembl.org/），或来自专门的RNA数据库，例如SILVA（https://www.arb-silva.de / ），ncRNA 数据库（https://ncrnadatabases.org / ），RNAcentral （https://rnacentral.org/），比较RNA网站（http://www.rna.icmb.utexas.edu/），或RFAM （https://rfam.org/ ; 例如，有关RNA序列数据库的非详尽列表，请参见Nucleic Acids Research网站；http：//www.oxfordjournals.org/nar/database/cat/2）。一些RNA数据库（例如SILVA，Rfam ，比较RNA网站）提供的序列已经以结构识别的多重比对的形式进行比对。感兴趣的RNA序列的同源物也可以通过序列相似性搜索来鉴定，例如使用众所周知的BLASTN工具。所有通用数据库和某些RNA数据库都提供BLAST服务。还可以使用INFERNAL （Nawrocki和Eddy ，2013）或CMfinder （Yao 等人，2006）在协方差模型的帮助下在结构水平上搜索相关的RNA序列。
必须将所有收集的序列以常用的FASTA格式（https://en.wikipedia.org/wiki/FASTA_format；图1 ）放在一个文件中。

注意：数据集的组成可能会影响协变分析，具体取决于序列之间的相似性或相异程度及其系统发育关系。

D：\陈丹工作\ 1902938--1255 Nicolas Tourasse 819848 \ Figs jpg \ figure1.jpg

图1. FAS TA格式的未比对RNA序列示例（在Emacs中可视化）

通过在“ X-INS-I”模式下运行MAFFT计算结构多重比对：
MAFFT-新寺村- scarnapair - NUC --reorder - maxiterate max_number_of_iterations --thread number_of_CPUs_to_use sequence_file.fasta 1> mafft_alignment.fasta 2> mafft_alignment_details.log

生成的比对将采用FASTA格式（图2）。

笔记：

选项“ -Scarnapair ” 指示MAFFT使用MXSCARNA执行成对结构比对，这是默认选项。要改为使用LaRA对齐器，请调用选项对“ --larapair --laraparams parameter_file ” ，其中“ parameter_file ” 是具有LaRA配置参数的文件。LaRA软件随附模板文件“ lara.params ” 。要使用FOLDALIGN对齐，调用选项“ - foldalignlocalpair ”或“ - foldalignglobalpair ”分别进行局部或全局的两两比对。在基准比较中（Katoh和Toh ，2008年），MXSCARNA的准确性通常高于LaRA的准确性，除非序列之间的同一性较低（< 40％），在这种情况下，可能首选LaRA。FOLDALIGN是另一种结构比对程序，具有很高的准确性，可以对相似性较低的序列进行结构比对（Havgaard等，2005 ；Sundfeld等，2016 ）。
为了获得高的精度比对，使用大量的迭代细化，例如，一组“ max_number_of_iterations ” 至1 ，000的“ - maxiterate ”选项” 。
对于“ --thread” 选项，增加“ number_of_CPUs_to_use ”以加快对齐计算。运行时间随序列的数量和长度而增加。例如，对于一组100个长度为50-200 nt的序列，在单个CPU上进行计算可能需要3-10分钟，而在使用至少8个CPU时需要不到一分钟。
在某些环境中，MAFFT可能会中止，并出现以下错误：“ mafft-xinsi ：第2369行：/ dev / stderr ：不是目录”。可以通过在mafft-xinsi bash脚本中将“ / dev / stderr”替换为“ / dev / null”来解决该错误。

D：\陈丹工作\ 1902938--1255 Nicolas Tourasse 819848 \ Figs jpg \ figure2.jpg

图2. 在4SALE中可视化由MAFFT产生的结构对齐

（ø ptional）预测的参考二级结构：
在ORD ER揭示共变，需要参考二级结构。它可以是一个的结构的吨包括在分析他RNA序列，共有结构从对准，或外部结构模型推断。在缺乏已知或实验确定的模型的情况下，需要预测结构。可以使用广泛使用的工具来预测单个RNA序列的2D结构，例如MFOLD（Zuker ，2003），http : //unafold.rna.albany.edu/?q=mfold，来自ViennaRNA 软件包的RNAfold （洛伦茨。等人，2011），https://www.tbi.univie.ac.at/RNA/），折叠或MaxExpect 从RNAStructure 包（路透和马修斯，2010），HTTPS：//rna.urmc.rochester .edu / RNAstructure.html），或来自RNA Shapes 工作室的RNAshapes （Janssen和Giegerich ，2015年；https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnashapesstudio）。所有这些工具都可以在专用Web服务器上在线运行，也可以作为命令行程序本地安装。例如，以默认参数在FASTA格式的n RNA序列上运行MFOLD或RNAfold的标准命令为：

mfold SEQ = sequence_file.fasta （结构将在名为“ sequence_file * 。ct ”的文件中输出）

RNAfold < sequence_file.fasta > structure_file.b

上述包装具有许多选项来调节折叠计算（例如，通过改变算法，温度，离子条件），并且它们中的大多数提供了对结构施加约束的可能性。

也存在几个块的软件用于从比对，例如预测共识结构RNAalifold （伯恩哈特等人，2008）从ViennaRNA 包，图形工具构建体（肾母细胞等，2008B）; http://www.biophys.uni-duesseldorf.de/construct3/），以及来自RNA Shapes 工作室的RNAalishapes （Voß ，2006年）；https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnaalishapes）。值得注意的是，RNAalifold 别ES不加权序列和正在研究中，以序列的特定样品高度敏感和预测可以通过含有插入的序列的序列之间，以及相似的变化的量的影响。ConStruct 结合了自定义序列权重以实现最佳的共识预测，而RNAalishapes 基于抽象结构形状的概念，并且还包括缺口感知能量评估，当序列包含插入序列和/或比对质量较差时，它的性能优于RNAalifold （Voß ，2006）。根据我们的经验，RNAalishapes的表现很好。RNAalishapes 依赖于较旧的Linux库，因此可能无法安装在当前的体系结构上，因此我们可能必须使用在线版本。

分析比对中的协变，并使用R- chie 生成带协变注释的比对的图像：
Ç ovariation由参考二级结构映射到所述多个比对揭示小号。可以采用结构预测和分析软件使用的一种常见格式将结构提供给R- chie ，包括点括号（或Vienna;“ .b”），连接表（“ .ct ”）。bpseq （来自比较RNA网站[ Cannone 等，2002 ] ，http：//www.rna.icmb.utexas.edu/ ）。对齐方式必须为FASTA格式。

rchie.R - msafile = mafft_alignment.fasta --pdf --output = alignment_covariation_figure.pdf --format1 = 维也纳--rule1 = 7 --group1 = 4 --legend1 --legend3 - msaspecies - msagrid - msatext reference_structure.b ＆> rchie.log

这将创建的PDF格式的对准，其中，在所述基准的二级结构成对的区域由根据共变着色弧表示得分的数字序列中的第二个核苷酸是根据其基着色- 配对状态（图3 ）。

笔记：

在点托架参考结构上面的命令运行（“.B”）格式，whic ħ 由指示选项“--format1 = 维也纳”。用于连接的结构（“ CT ”）或bpseq 格式“--format1 =连接”或“--format1 = bpseq ”瓦特乌尔德分别使用。
选项“ --rule1 = 7”用于对协方差得分的碱基对进行分组，选项“ --group1 = 4”用于将组数设置为4。可以选择其他各种标准进行分组；运行“ rchie.R --help”了解详细信息。
R-chie是高度可定制的。可以随意调用或省略选项“ --legend1”，“-legend3”，“- msaspecies ”，“- msagrid ”和“ -msatext ”，以便打开或关闭图例，序列名称，和其他图形设置。可以通过其他选项指定图像中每个元素的颜色，例如“ --colour1 ” ，“ --palette1 ” 或“ --msacol ” ；运行“ rchie.R --help”了解详细信息。

D：\陈丹工作\ 1902938--1255 Nicolas Tourasse 819848 \ Figs jpg \ figure3.jpg

图3. R- chie 绘制的带结构和协方差注释的比对

（ø ptional）如果需要，手动编辑由MAFFT产生的取向纠正错误或使用结构的编辑器如RALEE（调整对齐格里菲思-琼斯，2005），http://sgjlab.org/ralee/）， 4SALE（Seibel et al。，2006）; http://4sale.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/），S2S（Jossinet和Westhof ，2005年）; http://bioinformatics.org/assemble/），构建体（肾母细胞等，2008B）; http://www.biophys.uni-duesseldorf.de/construct3/）或SARSE （Andersen 等，2007）。然后，使用R- chie 重新生成带协变注释的图形。

数据分析

本文描述的方案已用于检查来自幽门螺杆菌属细菌的I型毒素-抗毒素系统的107个mRNA的结构比对中亚稳态区域内的协变（Masachis 等，2019 ，图8，图补充1和2在其中）。所有文件，包括未对齐的序列（采用FASTA格式），由MAFFT生成的未经编辑的对齐（使用“ -Scarnapair ”选项运行；以FASTA格式运行），手动编辑的对齐（以FASTA格式），参考二级结构（Masachis 等人分析了两个数据集（分别为1和2）的R- chie （以PDF格式）绘制的，带有点括号/维也纳格式的协方差注释的对齐方式（PDF格式）。（2019）作为补充材料包括在内，以允许用户学习和重现分析。

笔记

在这个协议中，我们采用MAFFT到计算结构比对，但也可以类似地使用任何其他工具来执行的程序小号产生结构感知序列比对。

致谢

该方案源自我们对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）中I型毒素-抗毒素系统的mRNA 中亚稳结构的原始研究（Masachis 等，2019）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突或利益冲突。

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