软件

本文提到的所有软件都可以在任何运行工作站或服务器的基于UNIX的系统上运行，例如Linux和Mac OS。另外，对于Windows计算机，可以启用Windows 10附带的Linux的Windows子系统来运行Bash。

FastQC v0.11.8 （https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）
TopHat v2.1.1 （Trapnell 等，2009）（http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml）
Bowtie 2 v2.3.1 （Langmead和Salzberg，2012年）（http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）
HISAT2 v2.1.0 （Kim 等人，2015）（http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml）
RSEM v1.2.31 （Li和Dewey，2011）（https://github.com/deweylab/RSEM）
STAR v2.7.3a （Dobin et al。，2013）（https://github.com/alexdobin/STAR）
SAMtools v0.1.19 （Li 等，2009）（http://samtools.sourceforge.net/）
Picard v2.9.0 （https://broadinstitute.github.io/picard/）
GATK v3.7 （DePristo 等，2011）（https://software.broadinstitute.org/gatk/）
VarScan v2.3.9 （Koboldt 等，2009）（http://varscan.sourceforge.net/）
HTSeq v0.11.1（Anders 等，2015）（https://htseq.readthedocs.io/en/release_0.11.1/）

上述所有软件均带有自己的README页面，详细说明如何安装和使用程序的教程和/或手册。用户可以选择以本地/全局方式安装软件，方法是使用root /管理特权进行安装，或者仅将程序可执行文件复制到/ usr / bin目录（文件夹）。

再修改的 è

RNA测序：对CCLE细胞系进行在Broad研究所进行的非链特异性RNA测序（Tsherniak 等，2017）。RNA测序包括poly-A选择，cDNA合成，文库制备（400 bp插入片段），sequencin g（101 bp配对读数）和样品鉴定质量控制检查（Tsherniak 等，2017）。使用Illumina TruSeq TM RNA样品制备方案的自动变体制备样品（https://www.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/truseq-rna-v2.html）。以200 ng的总RNA量为起始原料，然后使用oligo dT珠子从总RNA中选择mRNA ，进行热裂解，cDNA合成和Illumina文库制备（末端修复，碱基“ A ” 添加，衔接子连接和富集；请参阅https://www.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_truseq_sample_prep_kits.pdf）。使用Illumina HiSeq 2,000或HiSeq 2,500平台（Illumina Inc.，圣地亚哥，CA）进行测序。

数据分析

质量评估
检查原始测序数据的质量是任何基于测序的数据分析的第一步。开- 源软件快速QC 和它PR ovides不同实用程序模块，以计算每碱基序列的质量，每碱基序列内容和顺序复制水平。有关不同FastQC 模块的详细信息，请访问https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/。使用以下命令检查读取的质量（如果使用配对末端测序，则可能还必须为read2.fastq 文件运行fastqc ）：

fastqc- 提取read1.fastq -o read1_reports /

与参考基因组比对
在CCLE项目中使用TopHat将RNA测序读数映射到人类参考基因组hg19。过程包括小号创建用于hg19参照基因组和映射bowtie2索引的顺序读取要被索引的基因组中。有关详细信息，请参见https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml。

从人类基因组FASTA文件hg19.fa构建领结索引，如下所示：

bowtie2-build hg19.fa hg19

使用结果索引完成对齐，如下所示：

tophat -p 30 -r 80 --mate-std-dev 40 --no-sort-bam --no-convert-bam --no-coverage-search --library-type fr-unstanded -o tophat_out --GTF基因hg19.gtf-转录组索引否hg19 read1.fastq read2.fastq

在这里，我们使用30个CPU线程（-p 30）完成此对齐请求。虽然我们建议使用TopHat Aligner来匹配CCLE RNA-seq所使用的aligner，但我们较早的结果表明就变异调用而言，使用RSEM具有可比的结果（Mohammad et al。，2019）。我t可以在这里指出的是，高顶礼帽已经进入低维护阶段，并通过所谓的HISAT2用更准确，更高效的程序已被取代了相同的核心功能。HISAT2与TopHat相似，有关HISAT2的更多详细信息，请参见http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml。

建立HISAT2的基因组索引：

hisat2-build hg19.fa hg19

与基因组比对：

hisat2 -x hg19 -1 read1.fastq -2 read2.fastq -S align.sam

此外，在之前的研究中，我们还测试了RSEM对准器以排除对准器的影响，并观察到RSEM 具有相对的性能。RSEM的详细文档可从http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/README.html获得。比对过程包括创建基因组索引，然后作图。可以使用以下命令准备参考基因组的索引：

RSEM -prepare参考- GTF hg19-genes.gtf hg19.fa hg19

然后使用以下命令将序列读数映射到索引的基因组：

rsem -calculate-expression --paired-end read1.fastq read2.fastq hg19 sample_name

根据我们的经验，所有上述三个对准给性能比较小号就在当前的任务而言。一项单独的基准研究表明，STAR对准剂对SNP以及重要的indel都达到了最高灵敏度（Engstrom 等，2013）。因此，用户可以自行决定并使用其首选的对准器。

对齐后处理：
从以上地方产生的对准文件TEP 小号现在是使用通常的处理SAMtools ，皮卡德和GATK（基因组分析工具箱）一个第二的处理步骤includ ES 加入读取组信息，排序，重复标记和索引。交- 可以通过以下两种方式之一来执行的处理：（a）首先只涉及分选和indexi 纳克而; （b）第二种方法涉及更多的处理，以处理PCR重复项，使用Picard和GATK进行局部重排和碱基重校准。在一般情况下，在后者的结果在更好的整体变形打电话，但是当应用于高质量的数据甚至是第一个导致相当不错的变种通话。

一种。简单的比对后处理：这仅包括比对排序和索引，以创建可进行分析的校准（ba m ）文件。使用SAMtools 实用程序对对齐文件进行排序和索引。SAMtools 排序将生成排序的bam文件，SAMtools 索引将生成.bai文件。排序后的bam文件将在第5步中用于变体调用。

samtools 排序-o align_sorted.bam align .bam

samtools 索引-b align_sorted.bam

b。高级比对后处理：这涉及更复杂的比对后处理，包括本地重新比对，基本重新校准以及比对排序和索引，以使分析准备就绪的bam文件成为可能。

对准过滤，排序，以及索引
此命令删除非主要对齐

samtools 查看- hS的-F 0x100的align.sam > align_filtered.sam

以下3条Picard命令根据染色体坐标对BAM（比对）进行排序，删除重复项并添加读取的组ID。

java -Xmx4g- Djava.io.tmpdir = temp / -jar picard.jar SortSam SORT_ORDER =坐标CREATE_INDEX = true INPUT = align_rmContam.sam OUTPUT = align_sorted.bam VALIDATION_STRINGENCY = LENIENT

java -Xmx4g- Djava.io.tmpdir = temp / -jar picard.jar MarkDuplicates INPUT = align_sorted.bam OUTPUT = align_sorted_marked.bam METRICS_FILE = metrics CREATE_INDEX = true VALIDATION_STRINGENCY = LENIENT REMOVE_DUPLICATES = true

的java -Xmx4g - Djava.io.tmpdir =温度/ -jar picard.jar AddOrReplaceReadGroups INPUT = align_sorted_marked.bam OUTPUT = align_sorted_marked_readGroup.bam RGID = 2 RGLB =未知RGPL = Illumina公司RGPU = sampleIndex RGSM = sampleName VALIDATION_STRINGENCY = SILENT

将SAM重新排序为数字染色体1、2、3 等的命令。，而不是典型的字母顺序1、10、11、12等。如果您的默认hg19.fa并非以相同的顺序组织，则必须为“ sorted_hg19”提供正确的数字染色体顺序。用户应确保临时目录（temp /）的磁盘空间足够大，考虑到许多排序数据都比典型的Linux 系统存储分配给默认“ temp”目录的空间大。

java -Xmx4g- Djava.io.tmpdir = temp / -jar picard.jar ReorderSam INPUT = align_sorted_marked_readGroup.bam OUTPUT = align_sorted_marked_ordered.bam R = sorte d_hg19

samtools 索引-b align_sorted_marked_ordered.bam

本地重新调整和基本质量重新校准
尽管局部重新排列的总体效果是微不足道的，但在插入缺失周围执行局部重新排列有助于挽救原本会遗漏的少数插入缺失。因此，仅在有备用计算和时间可用时才建议执行此步骤。

的java -Xmx4g - Djava.io.tmpdir =温度/ -jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R sortedGenome -I align_sorted_marked _ ordered.bam -o realignment_targets.list

的java -Xmx4g - Djava.io.tmpdir =温度/ -jar GenomeAnalysisTK.jar -I align_sorted_marked_ordered.bam -R sortedGenome -T IndelRealigner - targetIntervals realignment_targets.list -o aligned_sorted_marked_realigned.bam

java -Xmx4g- Djava.io.tmpdir = temp / -jar picard.jar FixMateInformation INPUT = align_sorted_marked_realigned.bam OUTPUT = align_sorted_marked_realigned_fixed.bam SO =坐标VALIDATION_STRINGENCY = LENEENT CREATE_INDEX =

同样，基本校准应用于高质量数据时效果有限，但在质量具有系统误差模式的情况下有很大帮助。

的java -Xmx4g - Djava.io.tmpdir =温度/ -jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R sortedGenome -I aligned_sorted_marked_realigned_fixed.bam - knownSites vcf_dbSNP135 -o recal_data.csv

java -Xmx4g- Djava.io.tmpdir = temp / -jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads -R sortedGenome -I align_sorted_marked_realigned_fixed.bam -BQSR recal_data.csv -o align_sorted.bam

瓦里安电话
最后，变体从称为在排序并使用对准文件VarScan 和所述所得呼叫组进行过滤，以排除至少3个SNP是35个碱基的窗口内的簇。

samtools mpileup -B -C 50 -q 10 -d 10000 -f hg19.fa align_sorted.bam | java –jar VarScan.v2.3.9.jar mpileup2cns --min- avg - qual 10- mpileup 1 --min-coverage 10 --min- var - freq 0.05 --output- vcf 1 --p值0.05- -variant 1> outVCF.vcf

这将生成单元格行中所有发现的变体的变体调用格式（VCF）文件。输出。在下一步中，将使用vcf 文件提取DP和频率值。

注：牛逼，他再次是适合这个任务很多不同的调用程序，他们都有自己的长处和弱点，在几个早期出版物审查（Wang等，2013;徐，2018）。提供的CCLE RNA-seq FREQ和DP矩阵来自VarScan ，而我们建议匹配变体调用程序。我们认为不同变体调用者之间的差异应最小，因为我们仅选择在CCLE样本中检测到的变体。对于其他想了解这些变体功能的人来说，可以选择许多变体注释程序，例如ANNOVAR （Wang等，2010）（更多的选择可以在最近的评论文章中找到（Bailey等，2018）。））。

单元格识别：我们首先从生成的变量调用文件中选择934个单元格中存在的所有变量，然后使用内部Perl代码（vcfFilter_DP_Freq.pl）提取每个变量的DP和FREQ 值。上一步的输出文件s 包含变异信息（染色体编号，位置，REF和ALT等位基因）及其在934个细胞系中发现的DP或FREQ 值。这些文件可从CeL -ID GitHub页面（https://github.com/chenlabgccri/CeL-ID/blob/master/README.md）上提供的链接下载，并且用户不应重复要求934的变体。 CCLE细胞系。用户只需要对感兴趣的单元格行（查询单元格行）进行变体调用，并使用上述Perl代码-vcfFilter_DP_Freq.pl为在查询单元格中发现的所有变体提取DP和FREQ值。

可以使用以下命令从输出vcf 文件获取DP和FREQ值：

perl vcfFilter_DP_Freq.pl --input = outVCF.vcf --list = sampleList.txt --DP = 30 --AD = 5 --FREQ = 25

随后，我们将查询单元格行中的DP或频率值与934个单元格队列中每个单元格行的值进行比较，并使用R脚本（在R版本3.5及更高版本上进行测试）计算相关系数。查询被签名为最相关的单元格。可从https://github.com/chenlabgccri/CeL-ID获得执行细胞系鉴定步骤所需的所有代码。一旦用户具有查询单元格行的DP和FREQ值，就可以通过在R中执行以下命令来执行单元行识别步骤：

＃安装软件包data.table 和corrplot ，如果尚未安装

if（！requireNamespace （“ data.table ”，静默= TRUE））{

install.packages （“ data.table ”）}

库（data.table ）

if（！requireNamespace （“ corrplot ”，静默= TRUE））{

install.packages （“ corrplot ”）}

图书馆（Corrplot ）

＃Cel-ID_functions.R 参见https://github.com/chenlabgccri/CeL-ID

＃包含执行细胞系鉴定的功能

来源（“ Cel-ID_functions.R ”）

##读取934个细胞系的DP和FREQ文件（请参见GitHub页面）

ccle_dp < - read.delim （“CCLE_DP.txt”，月 = “\ t”的，标题= TRUE，

row.names = 1，stringsAsFactors = FALSE）

ccle_freq < - read.delim （“CCLE_FREQ.txt”，月 = “\ t”的，标题= TRUE，

row.names = 1，stringsAsFactors = FALSE）

＃读取查询单元行的DP和FREQ文件

＃（来自GEO（MCE86316）的MCF7细胞系，请参见GitHub页面）

query_dp < - read.delim （“Query_DP.txt”，月 = “\ t”的，标题= TRUE，

row.names = 1，stringsAsFactors = FALSE）

query_freq < - read.delim （“Query_FREQ.txt”，月 = “\ t”的，标题= TRUE，

row.names = 1，stringsAsFactors = FALSE）

＃找到最佳匹配，sdx会根据以下内容对已排序的匹配顺序进行编码

＃相关系数

rt = CCLE_Identification （ccle_freq ，ccle_dp ，query_freq ，query_dp ）

＃返回相关系数，排序后的索引，

＃和上下5个相关矩阵

rho = rt [[1]]

sdx = rt [[2]]

corMatrixTop5Bottom5 = rt [ [3]]

＃绘制相关矩阵

corrplot （corMatrixTop5Bottom5，方法=“ pie”，类型=“ lower”）

标准输出包含三个最佳匹配单元格的名称，相关系数和d P值。给定示例查询单元格行（MC F7）的典型输出如下：

总共选择了17730个变体

第一个匹配的细胞系是G41726.MCF7.5，rho = 0.906 p = 8.592e-21 <<<匹配的细胞系（> L0.001）

第二个匹配细胞系是G28020.KPL.1.1，Rho = 0.891 p = 1.743e-19

第三个匹配细胞系是G25206.NCI.H1694.1，Rho = 0.434 p = 0.781

此外，该程序还提供了前5个匹配项和后5个匹配项的相关图，图2中显示了示例查询单元格的结果。应该注意，MCF7和KPL1是已知的相同单元格，共享高SNP标识因此，两者都是具有高相关系数和显着P 值的最佳匹配，但次佳匹配则显示出相关系数很低且P 值较高。

D：\ Reformatting \ 2019-12-16 \ 1902615--1249 Chen Yidong Chen 746369 \ Figs jpg \ Fig2.jpg

图2. Query示例的前5个和后5个最佳匹配的相关图

而且，在未检测到完全匹配的情况下，CeL -ID还包括估算可能的细胞系污染水平的功能。可以使用R中的以下命令来执行此操作：

rt = CCLE_MixtureEstimate （ccle_freq ，ccle_dp ，mixFreq ，mixDP ，matched_ccleID ）

其中，mixFreq 和mixDP 是受污染（混合）细胞系的FREQ和DP文件，matched_ccleID 是最匹配查询细胞系（或在这种情况下为要测试的混合细胞）的CCLE细胞系ID。为了说明起见，我们创建了一个伪造的混合物（70％的目标细胞，30％的污染物）样本（请参阅cellAuthentication.R，可从CeL -ID GitHub页面获得详细信息），并且CeL -ID混合物模型可以正确估算污染。下面显示的是使用源自上述假混合物的mixFreq 和mixDP 作为输入的污染估算值的输出：

可能的混合物包含G20469.JHOS.2.2，其比例= 26.9％，t-stat = 53.6，p值6.734348e-231

这表明假冒混合物中含有26.9％的污染细胞系（G20469.JHOS.2.2），非常接近实际数量的30％。有关方法和基准测试过程的详细信息，读者可参考于我们之前的出版物（穆罕默德等人，2019）。值得一提的是，使用HTSeq 获得的基因的表达值（如图1中的虚线箭头所示）也可以用于计算相关性，但是最佳匹配和次最佳匹配的相关系数之差为与从其他变型文件中导出的文件相比，它要小得多。CCLE细胞系的基因表达数据可从https://portals.broadinstitute.org/ccle获得。

笔记

该协议中提到的所有软件都是免费提供的，可以轻松安装并在具有64 GB RAM，体面处理器和50 -100 GB磁盘空间的工作站上运行。此外，Galaxy（https://usegalaxy.org/）和Illumina BaseSpace （https://www.illumina.com/products/by-type/informatics-products/basespace-sequence-hub/apps.html）等在线平台还提供了上述软件以及更多用于轻松进行数据分析的软件。在此可能要注意，为一个对准器生成的索引不能用于另一对准器。

致谢

这项工作的资金部分来自NCI癌症中心共享资源（NIH-NCI P30CA54174）和CPRIT（RP160732 和RP120685-C2 ）对TAM和YC的资助。该协议改编自Mohammad 等。（2019）。TAM和YC设计了这项研究，起草并最终确定了方案。所有作者阅读并认可的终稿。

利益争夺

作者宣称他们没有竞争利益。

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