材料和[R eagents

宫颈感染和DNA提取

1. Eppendorf管（Stastedt GmbH ，目录号：72.688.004）

2. 超速离心管（Beckman Coulter ，目录号：NC9146666）

3。 15毫升˚F 爱尔康 S（康宁，目录号：430791）

4. 50毫升猎鹰

5. 12孔和24孔板

6. 橡胶刮ř

7. 75厘米2 或150厘米2的烧瓶（Corning，目录号：CLS3290和CLS3291）

8. 丁腈手套（Microflex Neotouch ，目录号：93-833）

9. 无菌200μl 移液器吸头（Stastedt GmbH ，目录号：25-201）

10. 1毫升注射器（BD Leur-Lok TM ，目录号：309628 ）

11. NSET：非手术胚胎移植装置（ParaTechs Corp，产品编号：60010）

12. 青春期后和性成熟（> 42天大）雌性小鼠（任何品系）

13. 甲羟孕酮乙酸酯（醋甲孕酮- [R 250毫克片剂; 赫素）

14. 沙眼衣原体L2储备液（1 x 10 7 细菌：ATCC VR-902 B）

15. RPMI Media 1640+ GlutaMax （Gibco ，目录号：11875 ）

16. 热灭活胎牛血清（FCS）（Sigma ，目录号：F2442 ）

17. DNeasy 血液和组织试剂盒（Qiagen ，目录号：69504）

18. 组织匀浆珠（MP B iomedicals，目录号：6913-500）

19. 1x DPBS（Gibco ，目录号：14190）

20. 蔗糖（Sigma ，目录号：S0389）

21. 谷氨酸（Sigma ，目录号：G1251）

22.无核酸酶的水（Sigma ，目录号：7732-18-5）

23. SYBR绿（热小号系统求解，目录号：A25741）

24. 底漆（Sigma）

25. 甲基葡胺泛影葡胺（Sigma公司，CAS ：131-49-7）

26. 水合重氮酸钠（Sigma ，CAS ：737-31-5）

27. 柠檬酸钠脱水（Sigma ，目录号：106447）

28. EDTA（Sigma ，CAS ：60-00-4）

29. HBSS（Sigma ，目录号：H4385）

30. 肾上腺素

31. 10 mM磷酸钠（8 mM Na 2 HPO 4 和2 mM NaH 2 PO 4 ; Sigma ，CAS ：7558-79-4; CAS ：7558-80-7）

32. SPG缓冲区（请参阅食谱）

33. 肾上腺素（见食谱）

设备

P ipettes
培养箱（热小号系统求解）
离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti TM J 25I）
超速离心机（贝克曼库尔特（Beckman Coulter），型号：Optima L-80 XP）
-80℃冰箱（新不伦瑞克小号系统求解）
RT-PCR仪器（ABI 7500）

软件

微软Excel
Step One Plus软件包（ABI 7500 ）
图P 广告P RISM 7

程序

细菌菌种的制备
注：T 他亲下面母育酚是用于沿两个75的Ct生长厘米2 烧瓶的细胞。

衣原体储备的制备（Mukhopadhyay 等，2004 ; Rajeeve 等，2018）。

用于感染在小鼠中，沙眼衣原体（的Ct ）在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中）被传播。细胞在含有5 ％热灭活的FCS的RPMI 中的75 cm 2 或150 cm 2 烧瓶中生长。
细胞用Ct 感染48小时。用橡胶刮刀刮擦细胞，并收集在无菌的50ml F alcon中。
使用玻璃珠通过涡旋将细胞裂解3分钟以释放细菌。
将溶胞产物佩尔eted通过在1离心以除去细胞碎片，344 X 克10分钟在4℃下。
将来自S tep A 4 的裂解物以30,000 x g 离心30分钟。将沉淀用10ml 1×SPG缓冲液在30,000 克30分钟。
现在将沉淀重新悬浮在2 ml SPG缓冲液中，并通过20 G 粗注射器和18 G注射器的5次。
为防止任何细胞碎片，应使用肾上腺素梯度蛋白纯化细菌悬液。
在无菌的38.0 ml高速离心管（Beckman Coulter聚碳酸酯涂层）中，准备一个20 -50％（体积/体积）肾上腺素梯度的步骤。
梯度应使用3.0 ml的50％肾上腺素和7.0 ml的20％肾上腺素小心地铺在50％肾上腺素上方。
将2.0 ml Ct 悬浮液添加到20％相的顶部。
以60,000 xg离心60分钟。EB将显示为20 -50％界面的不同波段。该层应仔细分离，并用冰冷的SPG缓冲液稀释。重复30,000 x g 的离心步骤，收集细菌沉淀（可能非常粘）。
将重悬的细菌悬液制成小等分试样（20-50 μ升），并在-80℃下冷冻直至使用。应使用一份等分试样来检查感染的多重性（MOI）。我们需要1 x 10 6 -1 x 10 7 细菌来感染小鼠。

确定感染复数（MOI）
Hela细胞接种在重复12 - 玻片孔板获得60-70％汇合第二天。
不同浓度的不同的稀释1:10至1:10细菌等分试样的-10 用于感染每个孔（例如克，0.25 μ 升，0.50 μ 升，1 μ 升，2微升等）。
在48 hpi之后，通过计算包含物的数量和细胞的数量来计算MOI。MOI为1表示一种细菌感染一个细胞，因此所有细胞都在孔中感染。

小鼠的选择
在雌性小鼠中进行跨颈感染，雌性小鼠的性成熟期至少为8周。每个治疗组应考虑五只雌性小鼠。每个实验中的小鼠应与年龄相匹配，并且应将笼伴侣随机分配到不同的治疗组中，以避免笼效应。

宫颈感染
为了建立生殖道感染，有必要控制子宫的脱落。Propo-provera ，激素黄体酮可防止排卵，从而同步发情周期并增加对衣原体感染的易感性。经宫颈感染前五天，给小鼠皮下注射2.5 mg的DepoPro vera （醋酸甲羟孕酮）：将1片（250 mg）溶于PBS中，每只小鼠使用200μl 。
在经颈感染的当天，将细菌原种在冰中融化。还应在50 ml F alcon，200μl 移液管和非手术胚胎移植（NSET）装置中携带无菌PBS （图2）。

D：\ Reformatting \ 2019-12-23 \ 1902758--1272 Karthika Rajeeve 771274 \ Figs jpg \ Fig 2.jpg

˚F igure 2.非手术胚胎移植（NSET）设备。1、2和3表示NSET设备的部件。

感染程序应在生物安全2级设施中进行。从笼子中取出鼠标并将其放在烤架的顶部。轻轻握住尾巴，让老鼠抓紧笼子的顶部。现在调整鼠标的方向，使后部可见。
将拇指的尾巴轻轻握在拇指和食指之间，然后向上拉，使脚脱离笼子。现在，用无名指推动老鼠的背部，使臀部向上倾斜，轻松进入阴道。
小心地将200 微升移液管尖端插入阴道深几乎0.2厘米并吸出液体，其累积子宫颈。确保不要将其插入太深，以免伤害小鼠并导致内部伤害。
现在，按照下面的图像和视频（图3）中的顺序按顺序放置部件1、2和3（图2），将NSET设备缓慢插入阴道穹ault 。向上和向下穿过针，直到它穿过子宫颈开口。这需要一些小径和一个可以使用溴酚蓝，以确认通过子宫颈（小号EE视频1 ）。

D：\ Reformatting \ 2019-12-23 \ 1902758--1272 Karthika Rajeeve 771274 \ Figs jpg \ Fig 3 .jpg

图3. 经宫颈感染的步骤。A.鼠标如上所述按住尾巴（步骤D4 ），然后将NSET设备的适配器插入阴道。B.将NSET针进一步插入适配器，直到到达小鼠的子宫颈。C.确保将针头完全插入子宫颈。D.一个可以插入吸管进入NSET针并加载细菌接种物（[R EFER到V IDEO 1 ）。

D：\ Reformatting \ 2019-12-23 \ 1902758--1272 Karthika Rajeeve 771274 \ video1.jpg

视频1. 宫颈感染的步骤。该视频是在维尔茨堡大学制作的，津贴为A2 55.5-2531.01-49 / 12。在动物实验均按照德国动物保护法的动物保健和试验批准的方案进行动物所批准（科学规程）1986年法令（项目许可证55.2-2532-2-762）。

通过NSET设备吸取所需的细菌MOI，并将细菌加载到子宫底。保持鼠标髋部向上3-5分钟，以确保接种物正确扩散。将鼠标放回其本机笼。

细菌负荷的确定
通过RT-PCR检测拷贝数

在小鼠进行安乐死7 天感染后和在子宫角都采取了进一步的分析。
将子宫角在SPG缓冲液中匀浆，并按照制造商的规程使用DNeasy 血液和组织试剂盒（Qiagen）分离DNA 。
定量PCR用于计数衣原体和宿主基因组拷贝数。
为了确定标准曲线，用编码的质粒首先执行拷贝数衣原体升链球菌lytA 基因和小鼠基因Synectin 。一个可以使用任何细菌/宿主基因为这个目的。将下列引物被用于对放大的C. 衣原体链球菌lytA 基因该被克隆到所述载体中：FWD ，5'-TCTAAAGCGTCTGGTGAAAGCT-3' 和REV，5'-GAAATAGCGTAGTAATAATACCCG-3'。归一化的细菌基因组中，以该中的宿主是进行使用鼠标synectin 引物：FWD ，5'-ACTAATGTCAAGGAGCTGTACG-3' 和REV，5' - CCTCCGACTTGAACACTTCC-3'。
为（首先创建标准曲线中，感兴趣的基因LYT 甲从衣原体/ Synectin 从小鼠）应该例如合适的质粒中克隆TOPO 的pCR 2.1载体（Life Technologies公司，德国）。质粒的不同稀释度用于执行标准曲线。这给出了有关DNA拷贝数和相应CT值的主要信息（图4）。

D：\ Reformatting \ 2019-12-23 \ 1902758--1272 Karthika Rajeeve 771274 \ Figs jpg \ Fig 4.jpg

图4.确定份数的示例。使用质粒DNA的不同稀释度绘制标准曲线。根据给定线的斜率，可以根据相应的CT值（Y值）计算未知样品中存在的DNA量（在该图中为X值）。

从该标准曲线，对数的拷贝被样品每微升确定作为该比率的衣原体升基因组到所述宿主基因组中。

数据分析

数据进行了分析使用步骤的一个加软件包（应用生物系统公司）和表示为所述比率的衣原体升基因组到宿主基因组中（链球菌lytA / synectin ）。GraphPad Prism 7用于生成散布柱形图并进行统计分析。单因子变异数分析（ANOVA）与Newman- 科伊尔斯多重比较测试被执行与所述显着性水平设定到较少比0.01。

拷贝数检测的另一种方法：

由于RT-PCR方法可以检测死细菌的DNA，因此也可以使用小鼠MOI 检测的另一种方法。

HeLa细胞在24接种于玻璃载片- 孔板。
将子宫角在SPG缓冲液中匀浆，或将阴道拭子收集在SPG缓冲液中。
样品进一步用玻璃珠涡旋，并在HeLa细胞单层上一式两份测定释放到上清液中的衣原体微生物的滴度。
形成单元的内含物数量将赋予细菌负荷。
每支拭子的IFU总数是根据稀释因子，接种剂量和总样品量计算得出的。从任何给定拭子的连续稀释样品和重复样品中取平均值。将计算出的每个棉签的IFU总数转换为log 10 ，并将log 10 IFU计数用于计算每个时间点的平均值和标准偏差。

笔记

这是重要的，以具有在需要的MOI 在50-100 微升的SPG 缓冲。
该细菌股票即是正在使用应该被测试为支原体污染。
年轻的小鼠，其是性成熟的，应该被选择用于该研究。老年小鼠也没有表现出一个输卵管病理和根本没有起到作为一个合适的模型。
每种条件包括5-10 只小鼠，也包括PBS 注射的小鼠，以激素诱导的热灭活衣原体感染的小鼠作为对照。
当选择一个基因用于拷贝数分析，一个应该采取照料为一个单拷贝基因，如果多个拷贝是本然后该计算必须被适配相应。

菜谱

SPG缓冲区
10 mM磷酸钠（8 mM Na 2 HPO 4 和2 mM NaH 2 PO 4 ）

220毫米蔗糖

0.5 mM谷氨酸，pH 7.4

肾上腺素
26克葡糖胺酸

4克泛影酸钠水合物

0.16克柠檬酸钠脱水

0.02 g EDTA溶于50 ml pH 7.4的HBSS中

Acknowledg 换货

我们承认海克Czotscher 和纳丁Vollmuth 为鼠标保存/ 基因分型和教授托马斯· 鲁德尔为提供的鼠标设备。本研究是优化与该“ Frauenburo 资金用于青少年科学家” 从DFG 的KR 和GRK2157 补助从托马斯· 鲁德尔。上述协议是适于从Rajeeve 等人。，2018 KR 开发的技术和写的手稿。RS 编辑的稿件和提供的图片和视频所需的的出版物。

利益争夺

该作者声明没有竞争利益。

伦理

统计分析被执行，以决定该样品尺寸用于在小鼠感染由该研究所的数学大学的维尔茨下的津贴A2 55.5-2531.01-49 / 12。所有的动物实验均进行中按照与协议批准的动物护理和实验的德国动物保护法批准下的动物（科学程序）法案1986年（项目许可证55.2-2532-2-762 ）。

参考文献

Abdelrahman，YM和Belland，RJ（2005）。该衣原体升发育周期。FEMS微生物修订版29（5）：949-959。
Buckner，LR，Amedee，AM，Albritton，HL，Kozlowski，PA，Lacour，N.，McGowin，CL，Schust，DJ和Quayle，AJ（2016）。沙眼衣原体感染宫颈上皮细胞可增强早期HIV传播事件。 PLoS One 11（1）：e0146663。
Carmichael，JR，Tifrea，D.，Pal.S. and de la Maza，LM（2013）。感染性和不育诱导的差异：鼠模型中沙眼衣原体菌株的比较研究。微生物感染15（3）：219-229。
达维尔（Tarville），安德鲁斯（Andrews），CW，Jr。，拉弗恩（Laffoon），KK，什马萨尼（Whysaniani），基什恩（Kishen），LR和兰格（Range）（1997）。衣原体生殖道感染过程和结局中小鼠品系依赖性变化与宿主反应的差异有关。感染免疫65（8）：3065-3073。
De Clercq，E.，Kalmar，I.和Vanrompay，D.（2013）。沙眼衣原体感染女性生殖道的动物模型。感染免疫81（9）：3060-3067。
Gondek，DC，Olive，AJ，Stary，G.和Starnbach，MN（2012）。CD4 + T细胞对于在鼠的上生殖道中抵抗沙眼衣原体感染具有必要的作用和足够的保护作用。免疫学杂志189（5）：2441-2449。
RP的Morrison和HD的Caldwell（2002）。免疫鼠类衣原体生殖器。感染免疫70（6）：2741-2751。
Mukhopadhyay，S.，Clark，AP，Sullivan，ED，Miller，RD和Summersgill，JT（2004）。纯化肺炎衣原体基本体的详细协议。临床微生物学杂志42（7）：3288-3290。
O'Connell，CM和Ferone，ME（2016）。沙眼衣原体生殖器感染。微生物细胞3（9）：390-403。
Pal，S.，Tifrea，DF，Zhong，G.和德拉马萨，LM（2018）。经子宫颈接种Ç hlamydia 衣原体诱导不育HLA-DR4转基因和野生型小鼠。感染免疫86（1）。
TB的Poston，SL的Gottlieb和T.的Darville（2017）。沙眼衣原体感染疫苗研究与开发现状。疫苗37（50）：7289-7294。
Rajeeve，K.，Das，S.，Prusty，BK和Rudel，T.（2018）。沙眼衣原体使中性粒细胞麻痹，从而逃避宿主的先天免疫反应。 Nat Microbiol 3（7）：824-835。
拉姆齐（K.H. Ramsey），德沃尔夫（DeWolfe），JL和塞勒（Salyer），RD（2000）沙眼衣原体鼠或人类生物变种原发性和继发性泌尿感染后的疾病结果。感染免疫68（12）：7186-7189。
Shah，AA，Schripsema，JH，Imtiaz，MT，Sigar，IM，Kasimos，J.，Matos，PG，Inouye，S.和Ramsey，KH（2005）。鼠衣原体感染小鼠生殖道后纤维化输卵管阻塞的组织病理学变化。性传播疾病32（1）：49-56。
明尼苏达州斯塔恩巴赫（2018）。需要对衣原体疫苗采取行动。趋势微生物26（8）：639-640。
Sturdevant，GL和Caldwell，HD（2014）。先天免疫足以清除女性小鼠生殖道的沙眼衣原体。病历Dis 72（1）：70-73。