材料和试剂

注：列出的具有特定目录号的材料和试剂是通用的，可以用其他供应商的类似产品替换。标有星号（*）的材料和试剂最好不要替换为其他品牌或供应商。
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p1000吸管
对象玻璃（各种供应商）
取盖玻璃用镊子（各供应商）（见图2A）
超离心机Beckman Coultier Optima或类似设备
适用于盖玻片的Harric等离子清洗剂（或类似产品）
400毫升玻璃烧杯
空PD-10列（GE Healthcare，目录号：17085101）
*直径为25 mm、厚度为1的覆盖玻璃（VWR631-1346）
细胞培养瓶表面积25 cm2，斜颈，瓶盖（通风）（康宁，西格玛奥尔德里奇，目录号：CLS430639）
1.5毫升eppendorf试管
细胞培养板6孔平底（各种供应商，聚苯乙烯，无菌）
50毫升Falcon试管（各种供应商）
15毫升猎鹰管
沃特曼纸
副膜10厘米宽（各种供应商）
注射器针头，弯曲针尖（！）用于拾取玻璃罩（各种供应商）（见图2a）
10毫升注射器顶部（平柱塞）（见图2A）
方形生物测定盘（NUNC，Thermo Fischer，目录号：240835）（见图2A）
软橡皮吸管
构造（请参见erlendsson等，2019年）示例：
1. 标记的质膜定位受体或yfp标记蛋白（在这种情况下无需标记）
2. 捕捉标记支架蛋白
*抗-flag？m1抗体（微孔，sigma-aldrich，目录号：f3040）
*HEK 293 Grip-Tite电池（Thermo Fisher，产品目录号：A14150）
KCL（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
MGCL2（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
cacl2（sigma-aldrich，目录号：c1016）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
Bovine Serum Albumin（西格玛奥德里奇，目录号：A2153）
Trizma Base（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
NAHCO3（Sigma-Aldrich，目录号：S8875）
1,4-二硫苏糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：DTT-ro）
多聚甲醛结晶（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
*延长tm金色防脱落贴片（Thermofisher，目录号：p36930）
聚L-氢溴酸鸟氨酸（Sigma Aldrich，目录号：P-8638）
*Alexa FluorTM488 NHS酯（琥珀酰亚胺酯）（Invitrogen，Thermofisher，目录号：A20000）
*SNAP表面染料568/647（新英格兰生物实验室，目录号：S9112S，S9137）
D-Mem（Gibco，Sigma-Aldrich，目录号：11965-092）
胎牛血清（GIGBO，目录号：16000044）
OPTI MEM降低血清培养基（GIGBO，Sigma Aldrich，目录号：31985062）
LipofectamineTM2000转染试剂（Invitrogen，Thermo Fischer，目录号：11668027）
Dulbecco磷酸盐缓冲盐（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
GibcoTM胰蛋白酶EDTA（0.25%），酚红（Gibco，目录号：25200056）
基因选择抗生素（G418硫酸盐）（Gibco，目录号：10131027）
青霉素链霉素（罗氏，目录号：11074440001）
台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
细胞培养污染检测试剂盒（invitrogen，目录号：c7028）
TBS缓冲区（见配方）
DMEM媒体（见配方）
纸张缓冲区（参见配方）

设备

invitrogen countesstm自动细胞计数仪（或类似设备）
伯爵夫人细胞计数室玻片（invitrogen，目录号：c10228）
NAP-5列（GE Healthcare，Sigma Aldrich，目录号：GE17-0853-01）
用于测量蛋白质浓度和标记度的纳米粒或类似物
快速去除介质和缓冲液的抽吸或大注射器
帝肯M200无限专业
共焦激光扫描显微镜（蔡司，型号：LSM510）
我们使用LSM 510卡尔蔡司63x/1.3浸油物镜或类似物镜：
1. 氩氪激光488nm激光线，505-550nm带通滤波器
2. 用氦氖激光器在543 nm处激发568，用585 nm长通滤光片检测。
3. 用氦氖激光器在642 nm处激发647，用650 nm长通滤光片检测。

软件

Microsoft Excel（微软）
ImageJ（美国国家卫生研究院；RRID:scr_003070）
GraphPad棱镜（GrofPad软件公司，圣地亚哥，美国；RRID:SCRY900798）< BR/>

程序

标记
A1蛋白质标记
用于以下结合研究的蛋白质在纯化后，应在高于预期kd10倍的浓度下至少在10℃下稳定1天。在我们的实验中，我们为每个独立的实验重复纯化和标记一批新的蛋白质。由于马来酰亚胺或nhs标记可能会干扰膜结合，我们建议在最初的结合研究中使用snap标记的结构。我们使用一个n端gst snap标签，在gst和snap标签之间有一个凝血酶切割位点。
1. 用于标记GST标记蛋白（浓度应为2-4 mg/ml，体积约为1 ml）与约500μl谷胱甘肽-琼脂糖珠浆（总体积约为1500μl）结合，加上表面染料（DMSO中的2.5毫米原料），使用浓度为10-20μm的最终浓度进行标记，在4℃下孵育2小时，将珠蛋白/染料/染料浆液包含在PD-10柱中。
2. 标记后，只需清洗柱上标记的蛋白质珠即可去除多余的染料。使用5-10珠体积的TBS缓冲液（或类似物）完全去除游离染料。在至少3个胎圈体积的TBS缓冲液（或类似的）中放置。
3. 现在，你可以把蛋白酶（在我们的情况下凝血酶5 U）加入到仍然附着在珠子上的染色蛋白（2-2-4毫克）中，并在4°C温和搅拌下离开直到一夜之间（10-16小时通常足以完全解理）。
4. 使用重力流从珠子中洗脱裂解和染色的蛋白质，并在100000x g下离心样品1h以去除所有潜在聚集物。当蛋白质离心完成后，立即将上清液移到干净的冰管中，以测定蛋白质浓度和标记度。< > < >
A2抗体标记
抗体的主要染料结合是使用invitrogen alexa fluortmnhs酯（琥珀酰亚胺酯）染料和小鼠产生的单克隆抗-flag？m1抗体进行的。原则上，染料和抗体（如果你的蛋白质上有其他标签）可以适合你的需要和显微镜设置。
1. 将抗体储备稀释至1μg/μl，总体积为100μl–使用PBS缓冲液（不含Tris或其他含有游离胺的缓冲液）。
2. 加入10μl 1 m NaHCO3以确保碱性反应条件。
3. 在110μl碱性抗体溶液中溶解~200μg染料（制造商提供的标准等分量），然后用铝箔包裹试管，在4℃下缓慢搅拌过夜。
4. 第二天，用PBS缓冲液（三柱体积）平衡NAP-5凝胶过滤柱。
5. 用PBS使反应体积达到200μL（加入90μL），并轻轻混合。< >
6. 将整个卷添加到列的中心。
7. 让样品进入色谱柱，在最后一滴后，加入550μl PBS进行清洗。< >
8. 加入300μl PBS，通过滴落计数（每管3-4滴）将洗脱液收集到1.5 ml微型离心管中。
< > A3标记度
确定所有结构物的蛋白质浓度和标记程度。我们使用帝肯M200无限专业仪器。标记度确定如下：
< > 首先，考虑到荧光团的贡献，计算蛋白质浓度：
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< > 然后计算每摩尔蛋白质的染料摩尔数：
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< > a280和a染料分别表示280nm处的样品吸光度和染料激发波长处的吸光度，e280和e染料的消光系数280nm和适当波长下的染料。cf280是指示染料在280nm处对吸光度的贡献程度的校正因子。对于Alexa面粉488标记抗体，使用e280=203000和cf280=0.11。对于咬合表面549（DY-549），使用e染料=150000和cf280=0.08。对于卡扣表面647（Alexa Fluor 647），使用e染料=239000和cf280=0.03。如果发现其他染料更适合您的系统，请使用染料供应商提供的消光系数和校正系数。在我们的实验中，我们的目标是标记抗体的每摩尔蛋白质5摩尔染料和蛋白质的每摩尔蛋白质0.7摩尔染料以上的效率。
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细胞培养
HEK293 GRIP TIE 293细胞应在无菌t25 cm2烧瓶中的5%co2下保持在37°C。细胞应定期分裂1/10星期一和星期五，绝不能达到超过90%的融合。如果使用不同大小的烧瓶，请相应地放大或缩小试剂体积。应使用细胞培养污染检测试剂盒（invitrogen）或类似工具对细胞培养物进行支原体污染常规检测。
1. 从烧瓶中取出介质。用5毫升不含Ca2+或mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）冲洗细胞。
2. 向烧瓶中加入1.5 ml预热的0.25%胰蛋白酶-1 mm EDTA溶液。
3. 在37℃下培养直到细胞分离（约2分钟）。在显微镜下检查细胞，确认大部分细胞已经分离。如果细胞仍然附着在一起，则再培养一段时间，直到大部分细胞分离。
4. 加入8.5毫升含有10%FBS和青霉素链霉素的预热D-Mem培养基（见材料）。小心地上下吸管细胞悬浮以打破细胞团。
5. 对于细胞传代，将1.5毫升细胞悬液加入含有10%FBS和青霉素链霉素的13.5毫升新鲜预热D-Mem培养基中，并加入新的t25 cm2烧瓶中。添加600微克/毫升geneticin并置于培养箱中。
6. 将10μl细胞悬液与10μl台盼蓝混合，加入10μl至细胞计数室，计数细胞。将4x 106细胞加入到一个新的t25 cm2烧瓶中，该烧瓶的总体积为15ml新鲜预热d-mem培养基中，含有10%FBS和青霉素链霉素。加入600微克/毫升geneticin并孵育过夜。
7. 第二天在15毫升Falcon试管中向1.5毫升Opti-Mem培养基中加入10微升Lipofectamine准备转染，并摇晃2秒。在另一个试管中向1.5毫升Opti-Mem中加入3微克含有标记结构的载体DNA，并翻转几次。两种方法均静置30分钟。5分钟后，混合并再孵育30分钟。
8. 从含有细胞的t25烧瓶中取出培养基进行转染。用不含Ca2+或mg2+的D-PBS清洗，并添加1毫升Opti Mem。
9. 将转染混合物添加到t25烧瓶中并培养过夜。烧瓶应总共含有4毫升（步骤8中的1毫升和步骤7中的3毫升）。
10. 第二天重复步骤1-4，但这次将转染细胞稀释至4x 105细胞/ml。
11. 在六孔板中向每个孔中加入1毫升预热D-Mem培养基，并向每个孔中加入4 x 105细胞（每孔2毫升中加入2 x 105细胞）孵育过夜，以便细胞附着。细胞应展平，40%至60%汇合。
12. 标记标记的质膜表达靶点时，从每个细胞孔中取出1毫升培养基，留下1毫升。向每个孔中加入1μg/ml Alexa-Fluor 488标记的抗标记M1抗体（见A2），并在冰上保存1小时。< > < >
支撑膜板
C1制备倒置膜片的准备工作
1. 使用Harric等离子清洗机（或类似设备）在最大功率下清洗20分钟，然后涂上1-2毫升0.3毫米聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐30分钟，然后在水中清洗两次，开始制备覆盖玻璃：将8个玻璃放在物体玻璃上，一次清洗8个。清洁后，立即将玻璃转移至六个井板井，并覆盖0.3 mm聚L-鸟氨酸氢溴酸盐。30分钟后，取下聚-L-鸟氨酸氢溴化物溶液，在井内约2毫升水中清洗一次盖玻片，最后加入1毫升水以保持盖玻片。
2. 通常准备24个玻璃杯。多做几件比需要的多-有些会坏的。
3. 将50毫克新鲜牛血清白蛋白加入50毫升的缓冲液中，在50毫升的猎鹰管中，制备“片状缓冲液”（见配方），并将其保存在冰上。另外，在冰上放2 x 50毫升的毫厘水。
4. 湿润沃特曼纸，准备纸巾盒，并用副膜覆盖。制作网格并用永久性标记写标签。不要使用红色标记，因为这将在下面的pfa固定期间溶解（图2）。
5. 把M1标记的细胞放在冰上，开始超离心蛋白制剂（见B12）。
注意：您现在有了（参见图2a）：
1. 荧光标记蛋白质。
2. 冷M1标记的单元格（标记M1仍处于打开状态）。
3. 根据所需的曲线和取样点，清洗和聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐处理过的玻璃罩在水中大约24个。
4. 用湿润的沃特曼纸和标记的副膜制作的生物测定盘（图2a）。
5. 50毫升冷板缓冲液，含1毫克/毫升牛血清白蛋白。 < BR>
6. 2x 50毫升冷水。
7. 此外，你需要镊子，平针筒雌蕊和弯针（图2a）。另外，你需要一个1000磅的吸管，一个时钟和吸管。 < BR>
8. 在这一点上，每片约700微升4%pfa和100毫升pbs放在冰上，以备日后使用。
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C2倒置膜片的生产
要准备床单，请按以下步骤为每个带有单元格的井准备床单：
1. 吸入含有M1抗体的培养基（图2b）。
2. 加入大约2毫升冷水清洗电池并启动时钟（图2b）。
3. 用清水代替水，使渗透性膨胀。
4. 60秒后，除去水，拿起玻璃罩，将经过聚-L-鸟氨酸氢溴化物处理的表面朝向电池的电池放在电池顶部（图2d-2e）。现在用雌蕊用力按压盖玻片（图2f）。在玻璃上的雌蕊周围移动1分钟时施加恒定的压力。可能需要几次尝试才能在不打破玻璃盖的情况下获得正确的压力。为了获得正确的压力，进行一个初始系列，其中施加的压力逐渐增加，并使用共焦显微镜评估板材的数量（见下文）。
  所需的压力比你想象的要大。另一种生产倒膜板的方法是将电池上的盖玻片压下10秒，然后将水完全除去。确保覆盖玻璃完全附着在井底的电池上。然后等待120秒-盖玻璃和井壁之间的气压/表面张力也足以产生倒膜片。
5. 接下来，再次使用弯曲的针头和镊子拿起盖玻片，并将其转移到生物测定皿中，使包含薄片的表面朝上。要有耐心，可能需要几次尝试才能学会如何用针拾起玻璃罩。如果施加了足够的压力，盖玻璃将很好地粘附在电池表面。
6. 转移后，立即用大约700μl的牛血清白蛋白缓冲液覆盖板材，以防止干燥，并用牛血清白蛋白覆盖表面（图2g）。
7. 对所有纸张预处理重复此过程。
8. 将最后准备好的床单放在寒冷和黑暗中20分钟，以便BSA覆盖床单。
9. 同时，在平板缓冲液中稀释蛋白质，制备上述计算的蛋白质稀释液。在蛋白缓冲液中对较低浓度进行初始稀释。每个条件准备1毫升。
10. 从片材中抽出片材缓冲液，用含蛋白质的片材缓冲液代替。优选约700-1000μl，不小于500μl。除了盒盖外，还应将塑料容器盖上，并在浓度系列中通常培养2小时或更长时间，并在黑暗中保持所需温度。
11. 孵育后，用1X 700μL的牛血清白蛋白缓冲液和两次冷PBS缓冲液去除副膜表面的缓冲液和洗涤片（在洗涤缓冲液中不孵育，在覆盖最后一片后按相同顺序开始去除）。使用软橡胶吸管。
12. 接下来，在700μl 4%冷pfa和黑暗中固定床单40分钟。此时，取出防雾安装介质，使其达到室温。
13. 固定后，用PBS清洗床单三次，最后一次清洗时离开。对于当时的一些盖玻片，取下PBS并在含有约400毫升水的烧杯中清洗玻璃。使用纸巾从边缘去除水滴，并在物体玻璃上安装一滴防雾玻璃（图2H）。多余的抗衰落可以被吸走。准备。在室温下保持在黑暗中。干燥后，应在4°C下储存。
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  图2。工作站和工作流程。a.工作站概述。如果你的蛋白质在室温下是不稳定的，或者你希望在较低（或更高）的温度下探测结合，你可以将生物测定皿放入冰或任何合适的加热装置中。插页显示针尖弯曲的针头，用于拿起护目镜。B-I.生产SCMS的工作流程-正文中的详细说明。< > < >
共焦成像
共焦显微镜、滤光片、照相机、激光器等。您可以使用不同于我们的设置。如有疑问，请咨询当地的显微镜专家。下面，我们简要介绍了用于erlendsson等人（2019年）分析的倒置膜板的设置。< >
1. 共焦显微镜：蔡司LSM 510共焦激光扫描显微镜，配备1.463x油浸式数字孔径物镜（蔡司，德国耶拿）。
2. 用氩氪激光器的488 nm激光线激发Alexa Fror 488染料结合抗体和YFP，用505-550nm带通滤光片检测发射光。
3. 用氦氖激光器在543 nm处激发547个捕捉表面标记的物种，并使用560-615nm带通滤波器检测发射光。用另一氦氖激光激发Alexa Fror 647在633 nm处，用650 nm长通滤光片检测发射光。
4. 样品将主要包含单层薄片，但也包括未破碎的细胞和细胞碎片。膜片可以通过非常扁平和薄而与细胞和碎片区分开来。细胞和碎片通常在直接传播中可见，而单层膜片则不可见（图3A）。< >

数据分析

然后使用imagej和excel（或类似工具）分析得到的图像。请看视频1。我们建议使用GraphPad Prism（或类似的）进行后续绘图和拟合。

确保来自不同频道的图像完全对齐。有专门的显微镜操作程序-如有疑问，请咨询当地的显微镜专家。图像应堆叠以便于分析。
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视频1。使用imagej和excel对绑定进行量化 < >
当发现平板膜片时，定义感兴趣区域（roi），并使用测量工具（在imagej中）测量各个通道的平均强度。另外，测量所有图像的所有通道的背景强度。应丢弃像素过饱和或平均强度低于背景+2σ（背景强度+背景强度标准差的两倍）的区域（图3A）。
对于结合曲线，每种情况下从8-10个单元格中只测量一个ROI。
接下来，需要根据标记程度和某些情况下的激光增益设置来校正强度。测量的通道强度的修正可用下列公式计算： < >
< > 其中，iobs是薄片（图3a中的i膜蛋白或配体（图3a和视频1中的i标记蛋白的平均强度），iback是背景的平均强度，l是每摩尔蛋白质的染料摩尔数或受体（见第A3节）。我们不建议改变独立的N之间的PMT增益设置，但是，如果必要的话，这可以通过乘以G（V）来校正（如果增益设置相似，则为1）。g（v）计算如下：
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< > 式中，α是pmt中dynodes的电导，n是pmt中dynodes的数目。α和n是显微镜上的pmt特有的。< >
最后，分数绑定可以使用：
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< > 所有用于直接比较的结合曲线应平行进行，并存在阳性和阴性（非结合）对照。< >
浓度系列和定量结合的一个例子可以在图3B-3C中找到。 < >
图3。识别scms并进行定量分析。a.单双层细胞与未分裂细胞或细胞器的区别在于它们缺乏三维结构。这些结构在直接传输中清晰可见。使用Image J（如在正文中所描述的）测量每个通道的纸张和背景的强度，并且可以在B中呈现浓度系列，并且如C误差棒中所示的量化，意味着±SE（n＝6）。为了在线性尺度上拟合这些数据，我们使用一个单位点总结合模型：y=bmax*x/（kd+x）+ns*x，其中ns是非特异结合的斜率。在对数标度上，我们使用具有可变斜率的乙状结肠剂量反应：y=底部+[（顶部-底部）/（1+10（kd-x）*s）]，其中s是斜率陡度。请注意，强制接近/阻碍扩散将影响斜率陡度，因此这不一定是约束合作性的良好度量。图改编自Erlendsson等人（2019年）。比例尺：10μm.

笔记

该方法不限于任何特定的细胞类型，原则上可以使用任何贴壁细胞类型。如果可以获得足够的信噪比，我们也可以推荐使用稳定转染的细胞系（甚至是具有良好单克隆抗体的天然细胞系）。这将为受体的有效浓度、它们的聚集性和潜在的亲和力效应提供一个更加真实的视角。
< > scms是天然细胞质膜，它们包含大部分（如果不是全部的话）天然细胞受体、转运蛋白、离子通道等。以及细胞骨架和较小的膜相关的细胞器，如囊泡。由于这个原因，蛋白质配体可以与这些成分中的许多结合，以及与膜的非特异性结合（这被称为背景）。在瞬时转染的细胞培养中，感兴趣受体的过度表达会忽略天然的“背景”结合。在Erlendsson等人（2019年）中，通过在配体结合域中引入单一但完全破坏性的点突变来检测非特异性结合是不可检测的。使用受体结合表位中单一但完全破坏性的点突变进行的特异性结合试验是野生型受体结合观察到的15-20%。请注意，后台绑定高度依赖于系统，应与任何绑定实验同时进行测试。

食谱

tbs缓冲区
150毫米氯化钠
50毫米Trizma
将pH值调整到7.35
dmem媒体
D-Mem（高糖：4500 mg/L，L-谷氨酰胺：584 mg/L）
10%胎牛血清（FBS）
0.1 mM非必需氨基酸（NEAA）
纸张缓冲
120毫米kcl
2毫米氯化镁2
0.1毫米cacl2
10毫米HEPES
30mm葡萄糖
将ph值调整为7.35
在50ml缓冲液中加入50mg牛血清白蛋白

致谢

本研究的目的是研究支架蛋白与Erdsson Em＞等人提出的膜嵌入受体的结合亲和力。（2019）。我们要感谢由凯伦·马丁内斯（丹麦哥本哈根大学）和霍斯特·沃格尔（瑞士洛桑化学科学与工程研究所）领导的研究小组为制定原始SCMS协议所做的努力et al.，2006）和thor c.m_ller（丹麦哥本哈根大学）帮助调整scms协议，以同时探测绑定亲和力。这项工作得到了丹麦独立研究委员会——医学科学、哥本哈根大学生物车卓越计划、Nanomedicine伦德贝克基金会生物膜中心、UNIK合成生物学中心和诺和诺德基金会的支持。

相互竞争的利益

作者声明没有财务或非财务竞争利益。

工具书类

Erlendsson，S.，Thorsen，T.S.，Vauquelin，G.，Ammendrup Johnsen，I.，Wirth，V.，Martinez，K.L.，Teilum，K.，Gether，U.和Madsen，K.L.（2019年）。使用支持的细胞膜片照明的pdz域支架组件的机制。elife8。Pii：E39 180。
Miles，T.F.，Dougherty，D.A.和Lester，H.A.（2013年）。5-ht3ab受体在质膜上显示A3B2化学计量。Biophys J105（4）：887-898。

Perez，J.B.，Martinez，K.L.，Segura，J.M.和Vogel，H.（2006）。支持的细胞膜片，用于膜蛋白的功能性荧光成像。adv funct mater16:306-312。

Roizard，S.，Danelon，C.，Hassaine，G.，Piguet，J.，Schulze，K.，Hovius，R.，Tampe，R.和Vogel，H.（2011年）。激活多孔微珠支持的细胞源性质膜中的G-蛋白偶联受体。j am chem soc133（42）：16868-16874。

Scarselli，M.，Annibale，P.和Radenovic，A.（2012年）。用光激活定位显微镜鉴定的细胞类型特异性β2肾上腺素能受体簇与脂筏无关，但依赖于肌动蛋白细胞骨架的完整性。J Biol Chem287（20）：16768-16780。

3369 细胞表面toll样受体4（tlr4）的内化是一种测量trif受体通路lps依赖性激活的简便方法。我们提供了一个用流式细胞术定量硫乙醇酸盐诱导的腹腔巨噬细胞对脂多糖依赖的TLR4内化的方法。【背景】Toll样受体4（TLR4）在Toll样受体中是唯一的，它可以从两个不同的细胞位置递送不同的信号（在TuDA和阿基拉，2004中评论）。细胞表面tlr4/md2最初由胞外细菌脂多糖（lps）连接，与细胞内适配器mal和myd88结合。随后，一部分细胞表面脂多糖结合的TLR4/MD2将经历CD14和氯氰菊酯依赖的内化，并转移到早期的内质室（Zanoni等人，2011年）。在这个内胚体室TLR4中，与信号转导受体TRAM和TRIF结合。tlr4内化和转运的调节机制仍有待进一步研究。Jonathan Kagan和同事首次在骨髓源性巨噬细胞（BMDMS）中描述了一种定量测定TLR4表面表达缺失的流式细胞术（TMR4）的表达方法（卡根等，，2008）。在这里，我们描述了本方案的一个改进版本，以量化我们已发表的硫乙醇酸盐诱导的腹腔巨噬细胞中的TLR4内化（Rajaiah等人，2015年；Perkins等人，2018年）。

材料和试剂

消耗品
1. 吸管尖头
2. 冰桶
3. 微量加样器
4. 10ml注射器（bd，目录号：309604）
5. 18 g x 1针（bd，目录号：305195）
6. 50毫升锥形管（Denville，目录号：C1062-P）
7. FACS试管（圆形），无菌，带盖（康宁，Falcon，目录号：352054）
8. FACS管（圆形），非无菌，无盖
9. 单元过滤器，70μm（Fisherbrand，目录号：22363548）
10. 用于过滤培养基和facs缓冲液的0.22μm过滤器（sarstedt，目录号：83.1823.001）
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试剂
1. 超纯脂多糖，如前所述通过热酚法从大肠杆菌k235中纯化（McIntire等人，1967）
2. 未结合大鼠igg2a，λ抗鼠cd16/32（fc受体）抗体，克隆93（biolegend，目录号：101302）
3. pe结合抗小鼠cd284（tlr4）抗体，克隆sa15-21（biolegend，目录号：145404）
4. pe结合型同型对照抗体，大鼠igg2a，k，克隆rtk2758（biolegend，目录号：400507）
5. 可选：用于细胞鉴定的其他抗体（例如，Alexafluor结合抗鼠F480；BioLegend，目录号：123119）
6. 可选：多聚甲醛溶液（PFA），4%PBS（Affymetrix，目录号：19943）
7. 无菌生理盐水（巴克斯特，目录号：0338-0048-03）
8. 可选：ACK裂解缓冲液（Quality Biological，Inc.，目录号：118-156-721）
9. 无菌磷酸盐缓冲盐（PBS）（康宁，目录号：21-040-cv）
10. 培养基（见配方）
  1. RPMI 1640（康宁，目录号：15-040-cv）
  2. 胎牛血清（FBS）（亚特兰大生物制品，目录号：S11550）
  3. 青霉素/链霉素（Gibco，目录号：15140-122）
  4. L-谷氨酰胺（GIBCO，目录号：25030-081）
11. FACS缓冲区（见配方）
  1. 无菌磷酸盐缓冲盐（PBS）（康宁，目录号：21-040-cv）
  2. EDTA，0.5米（Quality Biological，Inc.，目录号：351-027-101）
  3. 胎牛血清（FBS）（亚特兰大生物制品，目录号：S11550）

设备

带血细胞仪玻片的光学显微镜
37°C培养箱，CO2对照，用于细胞培养工作（无细菌/病毒工作）
用于细胞培养工作（无细菌/病毒工作）的生物安全柜无菌培养罩
漩涡精灵
50毫升锥形管和流式细胞仪管用带插入件的冷冻旋斗离心机
流式细胞仪（例如，Becton Dickinson LSR II）
分析用计算机

软件

“未来作战系统快车”6.0流程（De Novo软件；美国加利福尼亚州格伦代尔）
GraphPad Prism 7（Graph Pad软件；加利福尼亚州拉乔拉市，美国）

程序

第一天

用2×10毫升无菌生理盐水腹腔灌洗，用10毫升注射器和18克针头从先前注射过巯基乙酸的动物体内收集巨噬细胞。我们通常收集2-5窝同性别的腹膜渗出液，以确保所有对照组和时间点都有足够的产量。一个典型的协议可以在这里找到：< HRFF＝“http://www. Jovi.com／VIED/1488／隔离-鼠标-腹膜腔细胞”目标＝“空白”＞http://www. jvv.com／视频/ 1488 /小鼠腹腔细胞的分离。
在93-218x g（热科学TX-750 4转子上1000转/分）下离心10分钟，然后在培养基中重新培养颗粒细胞。
使用血细胞仪（或细胞计数仪）计数细胞，并在1.5毫升培养基中向每个无菌的FACS管中添加1 x 106-1.5 x 106巯基乙酸诱导的腹腔巨噬细胞（TEPM）（见以下配方）。一个典型的实验包括三个时间点在非刺激和三个时间点在刺激巨噬细胞。对于每个时间点，您可以设置管如下：
1）未染色对照管，2）同型对照管，3）tlr4抗体染色未染色对照管，4）tlr4抗体染色lps刺激管，5）细胞与其他细胞标记物共染色时为单色对照，6）双色染色时为使用。轻轻地重述FACS管，以便在培养箱中进行气体交换。
让TEPM在37°C的培养箱中休息一整夜，培养箱中含有5%的一氧化碳2
< >

第2天

第二天早上，将100 ng/ml超纯大肠杆菌k235 lps添加到用于测量tlr4内化的每根试管中（非刺激对照组除外）。在刺激期间，轻轻地回顾FACS试管并返回37°C培养箱。
在适当的时间点，将每一管对照或lps刺激的tepms转移到冰浴中，并添加两体积的冰冷培养基或facs缓冲液（见下面的配方）以阻止tlr4内化。
在112-264x g（TX-750 4转子转速为1100转/分）下离心5-10分钟，在预冷的摆桶中放置颗粒电池。
注意：对于此清洗和所有后续清洗：倾析介质，通过在空管架上轻轻地运行流动管来重新消耗细胞，然后立即返回冰桶。如果要收集更多的时间点，请将这些细胞重新置于冰冷培养基中，并保持在冰上，直到最后一个样本从培养箱中取出。
用冰冷FACS缓冲液再清洗细胞两次。在最终体积为100μl的冰冷FACS缓冲液中再次使用。
加入2μgαfc cd16/32–（约4μl biolegend 101302）ab，在冰上孵育15分钟。这可防止fc介导的非特异性抗体结合。
加入0.5μg PE标记的抗TLR4抗体或同型对照品（可选：与其他抗体共染色以帮助识别细胞亚群）并在冰上孵育30分钟。
用冰冷FACS缓冲液清洗3个电池。
用冷冻PBS清洗1个。
要么立即进行流式细胞术，要么在100μl PBS中使用1%pfa（最终浓度）固定细胞。在0.5-1.0 ml PBS中重新培养细胞，并在流式细胞仪上运行之前，将样本通过70μm细胞过滤器进入干净的流管（无需无菌）以去除结块。

数据分析

流式细胞术分析
1. 对于流式细胞术分析，通过前向散射（fsc）曲线（峰高和峰面积）选择单个细胞。将每个样本的“停止门”设置为≥20000个单个事件。离开“记录门”记录所有事件。
2. 为了进行分析，fsc-a和ssc-a剖面上的门事件排除死细胞和细胞碎片。
3. TLR水平可在PE强度直方图中显示。
4. 数据（所有事件）将导出为fcs3.0文件。
TLR4内吞测定的数据分析。
1. 在fcs express 6.0中打开数据文件，微调“单细胞”和“活巨噬细胞”门。
2. 记录每个样品的中值荧光强度（mfi）。
3. 从每个样品的mfi中减去未染色细胞的mfi（自体荧光）。
4. 平均“0分钟时间点”TLR4染色样本的MFI（如果使用多个小鼠菌株，则对每个基因型进行此操作），并将MFI数据标准化为平均值（时间0分钟=100%）。
5. 内部化率计算为随着时间推移从表面损失的TLR4的百分比。
预期结果：在野生型小鼠中，未刺激细胞的tlr4表面表达水平在整个实验过程中应保持恒定，并远高于同型对照染色细胞的水平。lps刺激的细胞应以稳定的速率（至少在最初的90分钟内）失去表面表达。例如，请参见图1。
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图1。具有代表性的数据显示，在指定的时间点，tepms中tlr4对100 ng/mle colilps的内吞反应。tepms用抗小鼠tlr4抗体（克隆sa15-21）染色，并用流式细胞术分析。

笔记

我们强烈建议在开始这些实验之前测试不同数量的硫乙醇酸盐，因为内毒素污染是常见的，会预先激活巨噬细胞。
硫乙醇酸盐诱导的巨噬细胞的产量不仅取决于硫乙醇酸盐的数量，而且还取决于进行腹腔灌洗的实验室成员的经验水平，以及小鼠的年龄和菌株。下表（表1）显示了我们实验室6-8周龄常用菌株小鼠腹腔灌洗细胞产量的范围。
< > 表1。硫乙醇酸盐诱导巨噬细胞的典型产量。对于每个小鼠基因型，提供腹腔灌洗后获得的巨噬细胞的预期产量。对于c57bl/6j动物，新研究者获得的平均产量也显示出来。

< >
如果腹腔灌洗后的细胞颗粒看起来像血，我们使用ack缓冲液进行红细胞溶解，然后用无菌pbs进行两次洗涤，然后再在培养基中继续使用。
重要的是让巨噬细胞在分离后休息一整夜，以实现从一个实验到另一个实验的一致的内吞动力学。
添加脂多糖前检查每根管子。任何在夜间培养过程中酸化或变浑浊的试管都可能受到污染，应丢弃。
这个实验的成功依赖于保持细胞的低温以防止tlr4复合物的进一步内化。在低温下，细胞膜的物理性质从流体转变为凝胶（thewalt和bloom，1992；spink等，1996）。内化所需的蛋白质复合物仍将在膜内形成，一旦膜液化，内化将继续进行。因此，请务必对离心机进行预冷，并在将其从培养箱中取出时，提供一个冰桶和冰冷FACS缓冲液或用于快速冷却细胞的介质。尽量缩短离心机盖子打开的时间，避免接触流式细胞仪试管的底部，从离心机上取下试管时应立即将试管放回冰桶。在不接触底部的情况下，你可以在试管离心后用光托起试管进行目视检查：冷细胞的颗粒具有更高的不透明性。实验也可以在冷藏室进行。
该方法与其他细胞标志物的表面染色相一致。如果需要细胞内染色，我们建议设置一组平行的样品进行渗透性测试。

食谱

培养基
1. RPMI 1640+2%FBS+2 mm L-谷氨酰胺+1%PEN/STREP
2. 0.22μm过滤器灭菌
3. 在4°C下储存3周
facs缓冲区
1. 冰冷PBS+0.5%FBS+2 mm EDTA
2. 在4°C下储存3周

致谢

由美国国立卫生研究院（AI123371和AI125215 to S.N.V.）资助。这一协议是从以前的工作中得到修改或修改的（卡根等人），2015，2008，2011。

相互竞争的利益

我们声明这项工作没有任何利益冲突。

工具书类

Kagan，J.C.，Su，T.，Horg，T.，Chow，A.，Akira，S.和Medzhitov，R.（2008年）。tram将toll样受体4的内吞作用与干扰素-β的诱导作用结合起来。nat-immunol9（4）：361-368。

McIntire，F.C.，Sievert，H.W.，Barlow，G.H.，Finley，R.A.和Lee，A.Y.（1967年）。大肠杆菌中脂多糖的化学、物理和生物特性生物化学6（8）：2363-2372。

Perkins，D.J.，Richard，K.，Hansen，A.M.，Lai，W.，Nallar，S.，Koller，B.和Vogel，S.N.（2018年）。自分泌旁分泌前列腺素e2信号限制tlr4内化和trif信号。nat-immunol19（12）：1309-1318。

Rajaiah，R.，Perkins，D.J.，Ireland，D.D.和Vogel，S.N.（2015年）。tlr4内吞和trif信号的cd14依赖性显示配体特异性，在内毒素耐受中不可分离。原发性脊髓损伤a112（27）：8391-8396。

Spink，C.H.，Manley，S.和Breed，M.（1996年）。< HREF＝“Htp://www. NcB.NLM.NIH.GOV/PUMEDME/8603086]目标＝“空白”＞磷脂从凝胶到磷脂双层的液相传递热力学。 EM> Biochim Biophys Acta 1279（2）：190～196。

Takeda，K.和Akira，S.（2004年）。tlr信号通路。精原免疫16（1）：3-9；

Thewalt，J.L.和Bloom，M.（1992）。磷脂酰胆碱：胆固醇相图。Biophys J63（4）：1176-1181。

Zanoni，I.，Ostuni，R.，Marek，L.R.，Barresi，S.，Barbalat，R.，Barton，G.M.，Granucci，F.和Kagan，J.C.（2011年）。cd14控制lps诱导的toll样受体4的内吞作用。细胞147（4）：868-880。