材料和试剂

生物材料
注意：FIB研磨程序与广泛的细胞类型相容，包括单细胞真核生物，原核生物和哺乳动物细胞例如HeLa和神经元培养物。本协议使用以下示例：
1. 衣原体（ C。reinhardtii ）野生型菌株CC-124 （137c）（Chlamydomonas Resource Center，University of Minnesota， Minneapolis，MN）
2. B mat3-4 （Umen和Goodenough，2001）
3. C酵母菌株酿酒酵母（酿酒酵母）
Tris-乙酸 - 磷酸（TAP）培养基（Harris等人，2009; Culture media recipe at available at http://www.chlamy.org/media.html ）
Lugol碘溶液（Sigma-Aldrich，目录号：62650-100ML-F）
液氮
乙烷/丙烷高纯度气体混合物（37％乙烷）（Linde）
过滤纸
YPD液体培养基（见配方）

设备

R 2/1多孔碳涂覆的200目铜网格（Quantifoil Micro Tools GmbH，目录号：Q2100CR1）
镊子
螺丝刀
光学显微镜
特氟龙片材（定制，从较大的片材切割成与用于切入冻结的滤纸精确的形状和尺寸）
玻璃培养皿（9-12厘米）
玻璃显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：10144633B）
Cryo网格框（定制的，或FEI，Eindhoven，荷兰）
Cryo AutoGrid框（定制，或FEI，Eindhoven，荷兰）
AutoGrids（为FIB工作定制和修改，见图1a）
夹环（FEI，Eindhoven，荷兰，见图1b）
液氮杜瓦瓶
使用液氮工作的个人防护设备（安全眼镜，面罩和防寒手套）
血细胞计数器（Neubauer）
移液器和提示
剪切工具（定制，或FEI，Eindhoven，荷兰）
使用液氮和液体乙烷/丙烷的个人防护设备
等离子体清洁器（Harrick，型号：PDC-3XG）
Vitrobot Mark 4（FEI）
聚焦离子束显微镜（FEI，型号：DB Quanta 3D FEG），Cryo系统（Quorum Technologies，型号：PP3000T），Cryo-stage（定制，Max Planck Institute）
透射电子显微镜I.（FEI，型号：Tecnai G2 Polara，FEG 300kV），柱后能量过滤器（Gatan，型号：HR-GIF 2002），直接检测相机（Gatan，型号：K2 Summit），SerialEM软件 Mastronarde，2005）
透射电子显微镜II。（FEI，型号：Titan Krios，FEG 300kV），柱后能量过滤器（Gatan，型号：968 Quantum K2）直接检测相机（Gatan，型号：K2 Summit），SerialEM软件（Mastronarde，

图1.为cryo-FIB修改的AutoGrids。 a）顶部和b）AutoGrid的底部，持有剪辑的TEM网格。平顶侧显示了cryo-FIB铣削所需的切口。 c）装有两个AutoGrids的FIB梭子。详细视图显示正确定向的AutoGrid加载到班车。请注意，AutoGrid开口朝上。

软件

FIB软件

程序

注意：使用液氮和液体乙烷/丙烷混合物是潜在的危险。应使用个人防护装备。

插入冻结玻璃化
注意：标准方案可用于冻结细胞（例如Iancu等人，2006）。为了适当的玻璃化（在非结晶冰中冻结）和细胞密度，必须针对每种特定细胞类型优化参数。
1. 通过使用血细胞计数器计数来测定细胞浓度。（ C。reinhardtii 细胞用Lugol的碘溶液固定计数过程，以停止细胞运动。卢戈的解决方案细胞培养物比例1:10就足够了。）
2. 浓度将细胞在新鲜TAP中稀释至200-750个细胞/μl。莱茵衣藻野生型菌株，500-4,000个细胞/μl的新鲜TAP 英格兰氏菌菌株，以及10,000-15,000个细胞/μl。酿酒酵母细胞在YPD培养基中
3. 碳涂层200目铜TEM栅格将放置的碳面朝上放在载玻片上30秒钟发光放电等离子清洗。然后将玻片保存在玻璃培养皿中，直到暴跌，应立即进行。
4. 使用Vitrobot将细胞冷冻冻存：
  1. 将Vitrobot设置为90％湿度，印迹力10，7至10秒印迹时间，室温（细胞）或27℃（酿酒酵母细胞）。
  2. 将3.5μl稀释的细胞培养物吸移到Vitrobot内部的TEM网格上。
  3. 网格使用特氟隆片从背面吸干两侧和滤纸在背面。然后他们立即在液氮下浸入液体乙烷/丙烷混合物中温度。
  4. 然后将插入冷冻网格在液氮下储存在密封箱中直到使用。
使用cryo-FIB铣削的样品稀化
1. 将FIB系统从室温冷却至低温条件。
  1. 在开始冷却之前，在FIB室中的真空和预备室必须低于4×10 -6 -6毫巴，以避免污染从水蒸气。
  2. 液氮杜瓦瓶和FIB室（真空隔离管线）之间的N 2气体管道被泵送到2×10 -2 -2mbar。
  3. 阶段和抗污染物的氮气流为分别调节至3.8L/min和4.2L/min。这些值确保冷却后达到182℃和192℃的温度，分别
  4. 通过将冷却杆缓慢地插入液氮杜瓦瓶中开始冷却。
2. 示例剪辑并将AutoGrids加载到FIB班次注意：当cryo-stage和抗污染物达到温度低于-160°C。使用手术面罩可以最小化工作区域的水蒸汽污染。
  1. 梭子和夹子支撑基座放置在装载箱（图2）中。
  2. 装载箱充满液氮。
  3. 煮沸完成后，双壁罐装满通过稍微倾斜装载箱（图2）使液氮
  4. 来自存储装置Dewar的样本框被传输到加载盒子和打开那里。传输时间应尽量避免样品污染。
  5. 所有将接触TEM网格的工具在使用前立即在装载箱中用液氮预冷却
  图2.样品剪切和加载 a-c）样品加载框双壁储层（9）。第二储存器填充有液体氮通过填充间隙（2,8）。 AutoGrid凹槽（6）有助于在液氮下快速和容易地处理Autogrids。的（1）和镊子可以在圆孔（7）中冷却。的穿梭（3）（装载位置），样品存储盒（4）和夹具金属载体（5）浸入液氮中。
  1. 的 AutoGrid放置在具有平坦侧面的夹持金属支撑件中面向下。它必须正确居中。从中移除TEM网格样品盒并放入AutoGrid，细胞面朝下。的网格然后被剪辑到带有夹环的AutoGrid中剪切工具（图1b）
  2. 由于梭车有两个AutoGrid的空间，因此对第二个AutoGrid重复步骤B2f）
  3. AutoGrids装载到班车和定向，使切口朝上（图1c）。然后往返翻转进入转移位置。
3. 穿梭运输到FIB低温阶段。
  1. 低温阶段和抗污染物的温度应该是在-194℃和-165℃之间。抗污染物的温度应低于低温阶段的温度
  2. 舞台移动到转换位置。
  3. 装载箱（图3c）被放置在泵站（图3a）上并被覆盖
  4. 传送单元（图3b）放置在盖子上装载箱，并且传送单元的插入杆附接到装载箱穿梭。
  5. 传送单元和装载箱的泵送开始。一分钟后，将梭子从装载箱中提出进入转移单元。传输单元阀关闭，泵送停止并且装载站被排气（图3d）。
  图3.示例传输系统。a）Quorum cryo系统（1）。泵站（2）内有装料箱。 b）具有小传送室（3）和样品传送单元的样品传送单元穿梭（4）连接到传输杆。 c）装载箱（5）内泵站（7）。这里，梭子处于转移位置（6）。 d）转移单元连接到装载箱用于穿梭拾取/放下。小传送室（3）使用关闭/打开转移单元阀（8）
  1. 传送单元连接到FIB的气锁（"准备室"，连接到Quorum系统的涡轮泵）。
  2. 气闸被泵送至所需的真空度，以安全地打开气锁阀和转换单元阀
  3. 穿梭器用插入杆转移到低温阶段。
  4. 然后，插入杆从梭上分离并缩回气闸阀和传送单元阀关闭。气闸并且移除传送单元。
4. 薄片铣削注意：有关铣削步骤的概述，请参阅视频1。求助使用基本FIB操作，在FIB软件中按F1键。
  1. 在开始研磨之前，在冷冻室中的FIB室中的真空条件必须低于2×10 ^-6 mbar，以避免污染水蒸气
  2. FIB显微镜的FIB用户界面已激活。
  3. 打开柱阀，开始离子束发射（按下"Beam on"或"Wake up"按钮）。
  4. 电子和离子束处于操作状态。
    注意：以下参数允许快速铣削块体细胞材料，随后精细研磨和抛光薄片。
  5. 设置电子束的扫描参数到：5.0kV束能量，12pA束电流，1,024x，884或1,536x 1,024扫描分辨率，1μs停留时间。开始扫描。
  6. 两个光束的扫描旋转设置为180度
  7. 设置低倍率（70x），舞台移动到两个AutoGrids之一。
  8. 以增加的变焦扫描网格条以调整电子束的聚焦，散光和其它所需的对准
  9. 舞台与重点工作距离相关（"Link Z to FWD"按钮）。
  10. 载物台移动到的重心高度（重合点）显微镜（离子和电子束显示相同的位置）
  11. 调整平台旋转以使AutoGrid开口与离子束的入射方向。这是通过面对朝向电子图像的底部（图4a）
  12. 有机金属铂沉积使用两个AutoGrids进行原位气体注入系统保护薄片表面和减少视觉效果（由Hayles等人于2007年修订的协议）：
    1. 舞台参数设置为0°倾斜，低于偏心高度3mm。
    2. 调整载物台以使AutoGrid面向气体注入系统（GIS）。为此，180°的相对级旋转使用同心旋转进行。 AutoGrid然后居中在电子图像中的GIS位置（图4b）
    3. GIS温度设置为26°C
    4. GIS针插入并打开4至8秒。
    5. GIS针缩回。
    6. 载物台移回到其在程序之前的初始位置。
  图4.薄板铣削。 a）。扫描电子显微镜（SEM）图像的自动格栅与离子束的入射方向对准。 b）。 AutoGrid以SEM图像中的GIS位置为中心 GIS针插入。 C）。具有衣藻细胞的TEM网格的SEM图像。 d）。 FIB之前的两个靶细胞衣藻细胞的SEM图像铣削。 e）。 FIB诱导的二次电子（FIB SE）图像靶细胞以两个矩形标准铣削图案为起点点用于铣削过程。 F）。 FIB SE图像显示铣削步骤在50pA，其中两侧的图案变得更苗条（但图案宽度保持恒定）并且移动得更靠近薄片边缘。 g，i）。 FIB SE和h）在cryo-FIB研磨后成品薄片的SEM图像。有关cryo-FIB铣削的概述，请参见视频1
  
  视频1. Cryo-FIB研磨玻璃体衣藻细胞
  1. 用离子束将载物台倾斜到铣削位置平行（通常为6至12°）。对于穿梭是预倾斜7°，并且相对于TEM具有10°的期望铣削角网格表面，舞台倾斜到17°
  2. 离子束参数设置为：30.0kV束能量，10pA束电流，1,024x 884或1,536 x 1,024扫描分辨率，1μs停留时间
  3. 在以增大的变焦扫描网格条时，调整离子束的焦点和像散。
  4. 靶细胞定位在电子和离子束图像中（图4c-e）。
    注意：最靠近TEM网格边缘的三个网格经常在TEM显微镜中不可接近。通常，中心网格是首选。
  5. 使用平台移动来调整偏心高度在z方向上，使得离子束和电子束显示相同的样品表面。
    注意：必须为每个铣削位置单独调整中心高度。
  6. 绘制两个平行的矩形标准铣削图案（图 4e）。禁用预倾斜校正时，图案的大小为大约10×6μm，并且图案之间的距离更大大于5μm。对于一种模式，铣削方向设置为从上到下并从底部到顶部为另一个，使铣削方向图案总是朝向薄片边缘。铣削参数设置为：冰材料（或Si），1μs停留时间，60％重叠
  7. 离子束电流改变为0.3nA，并且快速单次扫描采取（50 ns停留时间）以验证正确的铣削位置
  8. 开始铣削过程。一旦停止，铣削就停止材料被完全去除，如通过实时成像所观察到的扫描区域
  9. 迭代地，束电流减小，图案两侧的高度变得更细（同时保持图案宽度恒定），并且图案更靠近薄片边缘移动（图4f 和视频1）。束流的典型步骤为0.1 nA，50 pA和然后30 pA。
  10. 在约500nm的样品厚度下，使用30pA并任选地进行研磨清洁横截面图案。目标薄片厚度在之间 300和100nm（图4g）。在该步骤期间，估计厚度使用电子图像（图4h-i）
  11. 可以准备在一个FIB期间多个薄片（〜10）。对于每个新的薄片，扫描区域
  12. 迭代地，束电流减小，图案两侧的高度变得更细（同时保持图案宽度恒定），并且图案更靠近薄片边缘移动（图4f 和视频1）。束流的典型步骤为0.1 nA，50 pA和然后30 pA。
  13. 在约500nm的样品厚度下，使用30pA并任选地进行研磨清洁横截面图案。目标薄片厚度在之间 300和100nm（图4g）。在该步骤期间，估计厚度使用电子图像（图4h-i）
  14. 可以准备在一个FIB期间多个薄片（〜10）。对于每个新的薄片，... The loading box is filled with liquid nitrogen and then placed onto the pumping station.
  15. The transfer unit is docked to the airlock of the FIB.
  16. The airlock is pumped to the vacuum level required to safely open the airlock valves. The airlock valves and the transfer unit valve are then opened.
  17. The shuttle is retrieved from the cryo-stage with the insertion rod and retracted out of the FIB chamber into the transfer unit.
  18. The airlock valves and the transfer unit valve are closed.
  19. 气闸排气。
  20. 传送单元连接到装载箱。
  21. 装载站被泵送50秒。然后转移单元阀打开，梭子插入装载箱中液氮。泵送停止，装载站为通风。
  22. 插入杆与梭子分离，并且移除传送单元。
  23. 将AutoGrids从穿梭器中移出并在液氮下储存在适合于AutoGrids的储存箱中。
5. 加热FIB系统
  1. 冷却杆从液氮杜瓦瓶中取出。
  2. 当低温阶段和抗污染物已经达到约20℃的温度时，气体流量降低至0.5L/min。
Cryo-ET
1. 将AutoGrid样品加载到cryo下的cryo-TEM显微镜中条件使用标准程序（见FEI用户手册）。什么时候加载AutoGrid，AutoGrid剪切（从而铣削方向）必须垂直于倾斜定向轴的位置。
2. 使用低放大率成像定位薄片位置
3. 倾斜系列采集使用SerialEM软件进行低剂量条件（<100e /次^{2累积剂量）。 K2图像是以2°倾斜增量记录，通常具有-4μm至-8μm散焦像素尺寸为3至5。}
1. 1. YPD液体介质
  1％酵母提取物
  2％蛋白胨
  2％D-葡萄糖通过高压灭菌消毒

代表数据

图5显示了最终cryo-FIB制备的衣藻和酵母细胞的片层的实例。这种质量的样品通过所述技术（Rigort等人，2012）可再现地产生，并且已经用于其他地方公开的数据收集（Engel等人，2014; Villa 等人，2013）。

图5.最终薄片的TEM图像。 a）衣藻厚度为100nm的衣藻细胞的横截面。 b）通过几个酵母细胞的横截面，片层厚度为250nm。

食谱

YPD液体介质
1％酵母提取物
2％蛋白胨
2％D-葡萄糖通过高压灭菌消毒

致谢

我们感谢Alexander Rigort和FelixBäuerlein对开发cryo-FIB技术（Rigort等人，2012年）的贡献，以及Elizabeth Villa的富有成效的科学讨论。这项工作得到了欧盟委员会第七框架计划赠款协议ERC-2012-SyG_318987-ToPAG和HEALTH-F4-2008-201648/PROSPECTS，德意志交易所卓越集群CIPSM和SFB 1035，联邦教育和研究部（BMBF）），马克斯普朗克学会的机构间研究计划，亚历山大·冯·洪堡基金会（BDE）的博士后研究奖学金以及EMBO和HFSP博士后研究奖学金。

参考文献

Engel，B.D.，Schaffer，M.，Kuhn Cuellar，L.，Villa，E.，Plitzko，J.M.and Baumeister，W。（2015）。原位构建的衣藻叶绿体由原位/em> cryo-electron tomography。 4：e04889。
Harris，E.H.，Stern，D.B.and Witman，G.B。（2009）。衣原体。 Academic Press，Elsevier，2000。
Hayles，M.F.，Stokes，D.J.，Phifer，D。和Findlay，K.C。（2007）。一种用于改进冷冻制备的生命科学标本的聚焦离子束铣削的技术。 em> J Microsc 226（Pt 3）：263-269。
Iancu，CV，Tivol，WF，Schooler，JB，Dias，DP，Henderson，GP，Murphy，GE，Wright，ER，Li，Z.，Yu，Z.，Briegel， Y.和Jensen，GJ（2006）。使用Vitrobot的电子cryotomography样品制备。 Nat Protoc 1（6）：2813-2819。
Mastronarde，D.N。（2005）。使用样本运动的鲁棒预测的自动电子显微镜层析成像。结构生物 152（1）：36-51。
Rigort，A.，Villa，E.，Bauerlein，F.J.，Engel，B.D.and Plitzko，J.M。（2012）。细胞低温电子层析成像的整合方法：相关成像和聚焦离子束微加工。 Methods Cell Biol 111：259-281。
Umen，J.G。和Goodenough，U.W。（2001）。通过白喉衣原体中的视网膜母细胞瘤蛋白同源物控制细胞分裂。< a> Genes Dev 15（13）：1652-1661。
Villa，E.，Schaffer，M.，Plitzko J.M.and Baumeister，W。（2013）。打开窗口进入细胞：聚焦离子束铣削用于冷冻电子层析成像。 Curr Opin Struc Biol 23（5），771-777。