材料和试剂

材料

1. 8-12 周龄的 C57BL/6 小鼠

2. 玻璃巴斯德移液器（IWAKI，目录号：IK-PAS-5P，200）

3. 钻石笔（AS ONE，目录号：6-539-05）

4. 橡胶吸管灯泡

5. 7 mL聚苯乙烯Bijou样品容器（Sterilin，目录号：129A）

6. 6孔板（Sanplatec，目录号： 26510)

7. 深培养皿（φ 50 × 20.3 mm）（Sterilin 目录号：124）

8. 25 mL自立管（IWAKI，目录号：2362-025）

9. 消毒空瓶以丢弃洗涤介质

10. 0.45 μm 注射器过滤器（Sartorius，目录号：16533）

11. 载玻片（Matsunami，目录号：MAS-01）

12. 盖玻璃（24×55 mm）（Matsunami，目录号：C024551）

13. Pap pen（Daido Sangyo，目录号：S-PAP）

试剂

1. Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Gibco，目录号：11995065，储存温度：4 °C ）

2. 青霉素和链霉素（PS）溶液（×100）（Wako，目录号：168-23191，储存温度：4 ℃ ）

3. Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Wako，目录号：045-29795，储存温度： 15-25°C ）

4. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，目录号：A9418，储存温度：4 °C ）

5. 山羊血清（Sigma，目录号：G9023，储存温度：4 °C ）

6. 4％-多聚甲醛（PFA）溶液（Nacalai Tesque，目录号：09154-85，储存温度：4 ℃ ）

7. Triton X-100（Sigma，目录号：T8787，储存温度： 15-25°C ）

8. Tween 20（Sigma，目录号：P9416，储存温度： 15-25°C ）

9. 含有封固剂（Nacalai tesque，目录号：12745-74，储存温度：4 °C ）的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）

10. 透明指甲油

11. 小鼠抗PAX7抗体（Santa Cruz，目录号：sc-81648，储存温度：4 °C ）

12. 兔抗MYOD抗体（Thermo Fisher Scientific，目录号：PA5-23078，储存温度：4 °C ）

13. Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG抗体（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-11001，储存温度：4 °C ）

14. Alexa Fluor 546山羊抗兔IgG抗体（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-11035，储存温度：4 °C ）

15. I型胶原酶（Worthington，目录号：CLS1，储存温度：4 °C ）

16. 培养和洗涤培养基（见食谱）

17. 消化培养基（见食谱）

18. 5% BSA 溶液（见配方）

19. 2% PFA（见食谱）

20. 免疫染色洗涤液（见配方）

21. 渗透溶液（见配方）

22. 阻塞解决方案（见配方）

设备

1. 显微镜（蔡司，型号： Stemi 2000-C）

2. 荧光显微镜（Olympus，型号：IX83 两层系统）

3. 荧光显微镜数码相机（奥林巴斯，型号：DP80）

4. 水浴（一体机，型号：TR-1A）

5. CO ₂培养箱（Eppendorf，型号：Galaxy 170 S）

6. 组织培养罩

软件

1. cellSens 成像软件（奥林巴斯）

2. Photoshop 软件 (Adobe)

程序

A. 解剖前的准备

1. 准备解剖所需的材料

a. 使用金刚石笔在玻璃巴斯德移液器上刻上圆圈。

b. 准备直径为 1 mm（小）或5 mm（大）的移液器开口。要制作大型移液器，请在圆圈处折断移液器（图 1 ）。

c. 用燃烧器对巴斯德移液器（无论大小）的切割端进行热抛光，以防止损伤肌纤维（图 1 ）。

d. 使用大型移液器将EDL 肌肉束分解为单个肌纤维。

e. 然后，使用小吸管拾取并收集单个肌纤维。

f. 安装带橡胶球的热抛光移液器

图 1. 制作热抛光移液器的工作流程（用于大型移液器）。

2. 准备分解介质

a. 在解剖前，将 1 mL 的 0.2% I 型胶原酶溶液在 DMEM 中含有 1% PS 每 EDL 肌肉放入7 mL Bijou 样品容器中。

b. 使用 0.45 μm 注射器过滤器对胶原酶溶液进行消毒。

c. 将胶原酶溶液置于37 °C的 CO _{2培养箱中}。

3. 准备5% BSA 溶液

a. 使用0. 45 μm 注射器过滤器将 BSA 溶液消毒到 25 mL 自立管中。

b. 在水浴中将 BSA 溶液在 60 °C 下灭活 30 分钟。

c. 冲洗所有材料的表面，包括管子、移液器和盘子，以防止分离的单个肌纤维粘附。

4. 准备含有 1% PS 的 DMEM，用于肌纤维的培养和洗涤。

5. 在每个深培养皿中加入 6-8 mL含有 1% PS 的 DMEM，并在使用前置于37 °C的 CO _{2培养箱中}。

6. 准备用纸笔封闭在表面上的载玻片进行免疫染色。

B. 将 EDL 肌束消化为单个肌纤维（图 2 ）

1. 使用颈椎脱位牺牲 8 周大的 C57BL/6 小鼠。

2. 用 70% 乙醇喷洒后肢并去除后肢的皮肤。

3. 使用针头，将前肢手掌固定在解剖板上，并切割 EDL 和胫骨前 (TA) 肌肉的远端肌腱。

4. 用镊子向近端方向轻轻拉动 EDL 和 TA 肌肉的远端肌腱。

5. 去除 TA 肌肉。

6. 通过去除 EDL 肌肉近端肌腱上的结缔组织来暴露 EDL 肌肉。

7. 当肌腱充分暴露时，使用手术刀小心地切割 EDL 肌肉的近端肌腱。

8. 将分离的 EDL 肌肉放入含有预热消化介质的 7 mL Bijou 样品容器中，在 37 °C下在 5% CO _2下孵育 1.5 小时，每 15 分钟轻轻摇动试管。

注意：适当的消化时间取决于肌肉的大小和胶原酶的酶活性。当肌肉变得轻微肿胀，几根单独的肌纤维从肌肉边缘分离出来时，消化就应该完成了。

9. 如有必要，对另一个后肢重复相同的程序。

注意：应从同一只鼠标使用控制完整和受损的肌纤维。

图 2. 解剖小鼠以分离肌纤维的工作流程。

C. 清洗和收集单个肌纤维

所有程序都应在组织培养罩中使用立体显微镜进行。

1. 将消化的 EDL 肌肉放入装有洗涤介质的培养皿中。

2. 将肌肉分离成单个肌纤维，以多次研磨肌肉，直到它分解。

3. 为了进一步将肌纤维束分离成单个肌纤维，使用小型巴斯德吸管（用 5% BSA 预冲洗）将束研磨 2-3 次。

4. 通过用洗涤介质洗涤去除过度收缩的肌纤维、肌腱、血管、神经和其他碎片。洗涤次数取决于碎屑的数量。

5. 放置单个肌纤维在 37 ° C 、5% CO _2下，在 DMEM中3 小时，以消除垂死的超收缩肌纤维（第 2 次^孵育）。

注意：第 2 次^孵化对于获得健康未受损的肌纤维很重要。在孵化过程中，受损的肌纤维变得过度收缩。

D. 完整肌纤维与受损肌纤维的共培养（图 3-4 ）

所有程序都应在组织培养罩中使用立体显微镜进行。

1. 将 DMEM 添加到预涂有 5% BSA 的 6 孔板的每个孔中。

2. 使用小型巴斯德移液器每孔转移150 根完整的单个肌纤维。

3. 要去除因受损肌纤维而产生的因素，请使用小型巴斯德吸管吸出 DMEM ，然后添加新鲜的 DMEM 。重复此过程几次。不要完全吸出 DMEM，以免干燥肌纤维。 DMEM 的体积确定为每毫升 50 个肌纤维的比率。

4. 巴斯德吸管在井的右侧收集 75 条肌纤维（图 3A ）。

5. 通过在孔中滚动新的巴斯德移液器（涂有 5% BSA 且非热抛光）的边缘至少 3 次，直接对收集的肌纤维施加机械损伤（图 3B-3D ）。

6. 对肌纤维施加机械损伤后，受损肌纤维应立即收缩，呈现超收缩形态（图 3E ）。

注意：巴斯德移液器在对肌纤维增加机械损伤后立即与受损肌纤维分离，因为过度收缩的受损肌纤维变得粘稠并容易缠绕在移液器周围。

7. 使用立体显微镜确认完整（未损坏）肌纤维与受损肌纤维的比例为 1:1 。用作对照条件（非共培养受损）的完整肌纤维总数必须与受损条件下的相同。

注意：在损伤过程中，肌纤维往往会扩散到其他地方（图 3B-3D ）。在这种情况下，散布的肌纤维被重新收集并再次损坏。

8. 要在完整的肌纤维之间重新定位受损的肌纤维，请用小巴斯德吸管冲洗培养基（图 3F ）。如果在控制条件下发现超收缩肌纤维，请尽快将其移除，以尽量减少 DMDF 对完整健康肌纤维的影响。

注意：在未损坏的控制条件下，当损坏的肌纤维被冲洗掉时，应尽量减少培养基的吸入。

图 3. 完整肌纤维与受损肌纤维在漂浮状态下共培养的工作流程。

图 4. 未损坏（左）和损坏（右）条件的代表性图像。

E. 免疫染色（图5-6 ）

在肌纤维的操作过程中应使用立体显微镜。

1. 用 5% BSA涂抹1.5 mL 管和小巴斯德吸管的内部，以防止肌纤维粘附。

2. 使用小型巴斯德移液器将肌纤维转移到 1.5 mL 管中，并去除多余的介质。

注意：转移的肌纤维在 5 分钟内落到管底。

3. 要修复肌纤维，请将 PBS 中的 2% PFA 添加到含有肌纤维的1.5 mL 管中。 PFA 的最终浓度将低于 2%。

4. 清洗肌纤维三次。在肌纤维全部聚集到底部后，用小巴斯德吸管小心地更换洗涤液。

5. 在室温 (15-25°C) 下用透水溶液（0.3% Triton X100的 PBS 溶液）透化20 分钟。

6. 用洗涤液洗涤一次。

7. 在室温（15-25°C）下用封闭溶液（ PBS-T 中的 5% 山羊血清）封闭 20 分钟。

8. 用洗涤液洗涤三遍。

9. 与在 PBS-T 中稀释的适当一抗在 4°C 下孵育过夜。

10. 用洗涤液洗涤三遍。

11. 在室温 (15-25°C) 下，与适当的物种特异性 Alexa Fluor 488 和/或 546 荧光二抗在 PBS-T 中孵育 60 分钟。

12. 清洗细胞两次，然后用 PBS 清洗一次，以促进肌纤维附着在载玻片上。

13. 用纸笔将表面封闭在边缘，以防止肌纤维从载玻片中泄漏出来，并将肌纤维转移到载玻片上。

14. 从载玻片表面去除多余的 PBS。

15. 将盖玻片安装到载玻片上，滴一滴（±50 μL）含有 DAPI 的山地介质。

16. 将盖玻片和载玻片用透明指甲油在四个角粘在一起。

17. 在荧光显微镜下对样品进行成像并使用 cellSens 软件进行分析

与受损肌纤维共培养 48 小时的完整健康肌纤维相关的活化卫星细胞 (PAX7 ⁺/MYOD ^{+ ) 的代表性免疫荧光图像。}比例尺，50 µm。

未纯化条件下与完整健康肌纤维相关的间质细胞（CD31 ⁺或 CD45 ^{+ ）污染的代表性免疫荧光图像}。比例尺，50 µm。

数据分析

通过对 PAX7 和 MYOD 蛋白的免疫染色来观察与肌纤维相关的卫星细胞。 PAX7 ⁺/MYOD ^–、PAX7 ⁺/MYOD ⁺和 PAX7 ^–/MYOD ⁺细胞群分别表示静止、活化和分化细胞。每只小鼠计数20根肌纤维，平均20根肌纤维作为一个样本。在比较对照（未损坏的完整肌纤维）和与受损肌纤维条件的共培养时，我们使用了配对的学生t检验（Tsuchiya等人，2020）。

食谱

1. 培养和洗涤介质

DMEM 补充有 1% PS。

储存于4°C。

2. 消解培养基

补充有 1% PS 和 0.2% 1 型胶原酶的D MEM。

使用无菌注射器过滤器（0.45 μm 孔径）进行消毒。

3. 5% BSA 溶液

PBS 补充有 5% BSA。

通过水浴在 60 °C下灭活 BSA 溶液 30 分钟。

使用注射器过滤器（0.45 μm 孔径）进行消毒。

4. 2% PFA

用等效体积的 PBS 稀释 PBS 中的 4% PFA，以获得 PBS 中 2% PFA 的最终浓度。

5. 固定ed肌纤维s (PBS-T) 的洗涤溶液。

添加 0.025% Tween 20 的 PBS。

在室温下储存。

6. 通透液

PBS 添加 0.3% Triton X100。

在室温下储存。

7. 阻塞解决方案

PBS-T 补充有 5% 山羊血清。

致谢

这项工作得到了日本医学研究与发展署 (AMED, JP19bm0704036)、JST 森林计划 (JPMJFR205C) 和科学研究 KAKENHI 补助金 (17K13138 和 18K19749) 的支持。该协议改编自先前的研究（土屋等人，2020）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

该动物护理和使用协议经长崎大学和熊本大学 (A30-098) 伦理委员会 (第 1703161367 号) 批准。

参考

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5. 李永平 (2003)。 TNF-α 是骨骼肌中的有丝分裂原。 Am J Physiol Cell Physiol 285（2）：C370-376。

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