材料和试剂

1. VWR微型盖板玻璃（VWR，目录号：48393-081）

2. Microslides （Superfrost Plus，目录号：48311-703，VWR，USA）

3. ImmEdge 笔（矢量，目录号：H-4000）

4. 一抗：

a. CD45（血管蛋白质组学，目录号：mAP-0058；物种：大鼠；目标：小鼠；稀释：1:400）

b. Kim-1（R&D Systems，目录号：AF1817；物种：山羊；目标：小鼠；稀释：1:500）

c. F4/80（Serotec，目录号：MCA497R，物种：大鼠；目标：小鼠；稀释：1:100）

5. 二抗：

a. 抗大鼠，小鼠吸附（载体，目录号：BA-9401；物种：山羊；目标：大鼠；稀释：1:200；共轭：生物素化）

b. 抗山羊（Jackson Labs，目录号：705-095-147；物种：驴；目标：山羊；稀释：1:100；共轭：FITC）

c. 抗大鼠（Jackson Labs，目录号：712-095-150；物种：驴；目标：大鼠；稀释：1:100；共轭：Cy3）

6. 目标检索溶液（10 ×浓缩；Dako，目录号：S1699）

7. 30% H ₂O ₂（Sigma-Aldrich，目录号：216763-500 ml）

8. 亲和素/生物素封闭试剂盒（Vector Laboratories，目录号：SP-2001，ZF0917）

9. Vectastin Elite ABC 试剂盒（过氧化物酶（标准），目录号：PK-6100，ZF1011）

10. DAB底物试剂盒（50×DAB Chromogen；ABCAM，目录号：ab64238）

11. 山羊血清（Jackson ImmunoResearch，目录号：005-000-121）

12. 驴血清（Jackson Immunoresearch，目录号：017000121）

13. 苏木精溶液（Merck，目录号：1.05175.0500）

14. 福尔马林（10% 缓冲福尔马林；Fisher Scientific，目录号：23-427098）

15. 试剂二甲苯（纯化，目录号：UX-78923-75，Cole-Parmer ）

16. VectaMount （永久安装介质；矢量，目录号：H-5000）

17. VECTASHIELD HardSet （带有 DAPI 的防褪色封固剂；Vector Laboratories，目录号：H-1500）

18. 二水柠檬酸三钠（Sigma，目录号：S4641）

19. 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA-Na ₂）（Sigma，目录号：E5134）

20. 氢氧化钠颗粒（EMD，目录号：SX0593）

21. 柠檬酸盐缓冲液（见配方）

22. 14% EDTA（见配方）

23. PBS 中的 0.1% Tween 20（见配方）

24. 2.5% 正常山羊血清（见食谱）

25. 2.5% 正常驴血清（见食谱）

26. PBS-T（见食谱）

设备

1. 显微镜（Nikon、ECLIPSE、E600 和 ZEISS、AXIO、IMAGER.A1 荧光显微镜）

2. 培养箱：StainTray 20 Place with Black Lid, Newcomer Supply Inc. # 6847-20BL ( https://www.newcomersupply.com/product/staintray-20-place/ )

3. 染色罐（Coplin Staining Jar with Cover，Wheaton；VWR，目录号：25460-000 ）

4. 热板（搅拌器和热板搅拌器，Benchmark Scientific，目录号：H-4000-HS）

程序

A. 组织切片

使用的载玻片来自小鼠组织，特别是骨髓、肺、肝和肾。除小鼠胫骨骨髓在福尔马林固定和石蜡包埋之间脱钙外，所有组织均采用标准福尔马林固定、石蜡包埋和组织块切片。为此，胫骨从正常成年 C57/Bl6 小鼠中分离出来，用福尔马林固定 48 小时，在 14% EDTA 溶液中脱钙 72 小时，然后用石蜡包埋。从糖尿病 OVE26 小鼠 [一种具有早期和持续性高血糖的转基因小鼠品系 (Epstein et al ., 1989)，并鉴定为糖尿病肾病的可靠小鼠模型 (Zheng et al ., 2004)] 和单肾切除的 OVE26 小鼠的肾脏（郑等，2011）。非糖尿病对照肾获自年龄匹配的相同品系 FVB 小鼠。这些动物已经过白蛋白尿测试，并且已经用标准苏木精和伊红 (H & E) 和马森三色染色对它们的肾脏进行了组织学评估。具有明显肾小管间质纤维化的肾脏用于证明CD45染色。肾脏、肝脏和肺的组织切片以 4 µm 切割，胫骨切片以 5 µm 切割。切片安装在带正电的载玻片上。染色前，将所有石蜡切片在 70°C 下加热 30 分钟。骨髓组织被认为是阳性对照，省略了 CD45 一抗的切片被用作阴性对照。

B. CD45染色

免疫组织化学 (IHC)

1. 对组织进行脱蜡和再水化：在二甲苯中对组织切片进行脱蜡，然后用分级乙醇将其再水化为水。（详细说明：在二甲苯中更换 3 次，每次 5 分钟；在 100% ETOH 中更换两次，每次 3 分钟；然后是 95% ETOH、90% ETOH 和 80% ETOH，每次 3 分钟。然后，将载玻片移到水中，每次 3 分钟，有两个变化。）

2. 用 H ₂O ₂阻断内部过氧化物酶活性：在室温 (RT) 下，用 3% H ₂O ₂/PBS浸泡 Coplin 罐中的载玻片，20 分钟。

3. 用 PBS 清洗载玻片：将载玻片在 PBS 中浸泡 5 分钟，三个变化。

4. 在选择的缓冲液中提取抗原。对于该协议，抗原修复在 pH 6、95-100°C、20 分钟的柠檬酸盐缓冲液中进行。[详细说明：将 50 ml 1×柠檬酸缓冲液加入玻璃科普林罐中，并将此罐置于加热板上的水浴烧杯中。一旦水浴沸腾，插入所述组织滑入科普林罐（最大幻灯片编号：10）。20 分钟后，将烧杯从加热板上取下，停止加热。在室温下将 Coplin 罐冷却 30 分钟。]

5. 用 PBS 清洗幻灯片 5 分钟 3 次。

6. 在载玻片上的组织切片周围画一个疏水圆圈：使用 ImmEdge ^®疏水屏障 PAP 笔在组织切片周围画圈，形成耐热、防水的屏障，使试剂保持在组织标本上，并防止切片之间的试剂混合。

7. 在室温下用正常血清封闭组织切片 30 到 60 分钟（在此步骤和步骤 10 中添加了亲和素/生物素封闭程序）。

a. 在 PBS 中制备 2.5% 的正常山羊血清。

b. 将来自亲和素/生物素封闭试剂盒的亲和素溶液添加到 2.5% 的正常山羊血清中（每 1 毫升 4 滴），混合均匀。

c. 将载玻片放入孵化箱中。

d. 将 50-100 µl 封闭血清（含抗生物素蛋白溶液）涂抹在每个组织切片上。

e. 在 RT 中孵育切片 30 到 60 分钟。

8. 用 PBS-T 清洗载玻片，每次 5 分钟 3 次。

9. 应用一抗**：

a. 制备抗体稀释剂：将生物素封闭液加入 2.5% 山羊血清/PBS（每 1 毫升 4 滴）中。

b. 用准备好的稀释剂稀释 CD45 抗体 1:400。

c. 将稀释的抗体涂抹在组织切片上。

d. 在 4°C 下将孵育箱中的载玻片孵育过夜。

用 PBS-T 清洗幻灯片 5 分钟 3 次。
应用二抗：

a. 通过在 PBS 中以 1:200-1:400 稀释生物素化山羊抗大鼠（小鼠吸收）IgG 来制备抗体。

b. 适用于组织切片，并在室温下将湿盒中的载玻片孵育 60 分钟。

用 PBS-T 5 分钟洗涤五次。
应用 ABC 解决方案***：

a. 从 VECTASTAIN Elite ABC 试剂盒中制备 ABC 试剂：将两滴（100 μl）试剂 A 加入 5 ml PBS 中并混合；然后在上述试管中加入两滴（100 μl）试剂 B 并立即混合。

b. 在每个组织切片上加入 50-100 µl ABC 试剂，室温孵育 30 分钟。

用 PBS-T 5 分钟洗涤 3 次。
应用 DAB：

a. 通过将 200 µl 50 × DAB Chromogen 与 10 ml DAB 底物缓冲液混合来制备 DAB 试剂。

b. 将 DAB 应用于组织切片最多 10 分钟。

在水中清洗幻灯片 5 分钟 3 次。
如果需要，用苏木精复染细胞核。
用水 5 分钟清洗载玻片 3 次。
用乙醇脱水，然后用二甲苯脱水。（详细说明：在 90% ETOH 中孵育一次，在 100% 乙醇中孵育两次，每次 1 分钟，然后在二甲苯中孵育三次，每次 3 分钟。）
将永久性安装介质涂在载玻片上并盖上盖玻片。
在显微镜下观察载玻片，检查 DAB 的棕色是否在阳性对照中形成，以及阴性对照部分（省略一抗）是否没有颜色。
如果染色良好，请检查目标切片：

a. 存在阳性染色。

b. 阳性染色的位置（实质或间质组织）。

c. 记录在选定放大倍数下成像的组织切片的病理变化。如有必要，进行定量分析。让观察者对组标识视而不见。

笔记：

a. **对于 CD45 与 F4/80 的共定位染色，选择具有三个相同对齐的连续切片的组织载玻片。CD45 和 F4/80 抗体分别应用于相邻部分。第三部分没有任何一抗。所有其他步骤都相同。

b. *** 使用前让 ABC 试剂静置 15-30 分钟。

免疫荧光 (IF)：CD45 和 KIM-1 双染色

1. 组织脱蜡和再水化：组织载玻片在二甲苯中脱蜡，然后用分级乙醇再水化成水。

2. 在选择的缓冲液中提取抗原。对于该协议，抗原修复在 pH 6、95-100°C、20 分钟的柠檬酸盐缓冲液中进行。（详细说明：将 50 ml 1×柠檬酸缓冲液加入玻璃 Coplin 罐中，并将此罐置于加热板上的水浴烧杯中。水浴沸腾后，将组织玻片插入 Coplin罐（最大载玻片数量：10）。20 分钟后，从加热板上取下烧杯，停止加热。在室温下冷却 Coplin 罐 30 分钟。）

3. 用 PBS 清洗幻灯片 5 分钟。

4. 在载玻片上的组织切片周围画一个疏水圆圈：用 ImmEdge ^®疏水屏障 PAP 笔在组织切片周围画圈，以形成耐热、防水的屏障，以保持试剂位于组织标本上，并防止切片之间的试剂混合。

5. 血清阻断：

a. 在 PBS 中制备 2.5% 的正常驴血清。

b. 应用 50-100 µl 封闭血清覆盖组织切片。

c. 在 RT 中孵育幻灯片 60 分钟。

6. 用 PBS-T 短暂冲洗载玻片 3 分钟 3 次。

7. 应用一抗：

a. 制备混合抗体溶液：将 5 µl CD45 抗体（1:400）和 4 µl KIM-1 抗体（1:500）加入 2 ml 2.5% 驴血清/PBS。

b. 将此混合抗体溶液应用于指定的组织切片。

c. 仅将免疫前血清应用于将用作阴性对照的部分。

d. 在 4°C 下过夜孵育载玻片。

8. 用 PBS-T 5 分钟清洗幻灯片 3 次。

9. 应用二抗：

a. 通过将 Cy3 偶联的抗大鼠 IgG 和 FITC 偶联的抗山羊 IgG（均以 1:100 稀释）添加到 PBS 中并混合均匀，制备抗体混合物。

b. 将此混合抗体应用于组织切片。

c. 在 RT 的黑暗中孵育幻灯片 60 分钟。

用 PBS-T 在黑暗中清洗幻灯片 5 分钟五次。
使用带有 DAPI 的安装介质安装组织切片，覆盖玻璃盖，并将载玻片存放在 4°C 的黑暗中。
使用荧光显微镜检查载玻片以验证阳性和阴性染色。在本研究中，DAPI/FITC/TRITC 过滤器用于显示细胞核 (DAPI)、KIM-1 (FITC) 和 CD45 (Cy3) 染色。
验证 IF 方法后，检查目标部分的阳性染色和位置。在选定的放大倍数下，通过具有多通道采集设置的 DAPI、FITC 和 TRITC 过滤器依次捕获样品图像，并使用软件合并免疫荧光图像。保持背景和曝光相等以进行图像比较。如有必要，进行定量分析。让观察者对组标识视而不见。

数据分析

A. 验证小鼠组织中的 CD45 抗体。

成功的 IHC 染色需要足够的抗体敏感性和特异性。CD45 是一种跨膜细胞表面糖蛋白，由绝大多数血淋巴谱系细胞表达。因此，骨髓似乎是一个很好的阳性对照组织。骨髓切片需要脱钙过程。在本研究中，小鼠胫骨骨髓用 14% EDTA 脱钙 72 小时。结果（图 1）表明 CD45 抗原性在脱钙后得以保留。如图 1A 所示，骨髓中的许多有核细胞对 CD45 染色呈阳性。当有核细胞位于红细胞 (RBC) 岛内时，CD45 ⁺细胞（实线箭头）尤为明显（图 1C）。阳性染色与阴性染色的细胞形成对比，例如巨核细胞（血小板的前体）、脂肪细胞和周围的骨组织。当省略 CD45 抗体时，染色呈阴性（图 1B）。这些结果表明，优化的方案使用这种 CD45 抗体产生了灵敏和特异的染色。

图 1. 来自骨髓、肺和肝脏的正常成年小鼠组织切片的代表性 CD45 染色。

正常骨髓含有许多 CD45 ⁺细胞 (A)，如果省略 CD45 抗体，这些细胞就不存在 (B)。在更高的放大倍数 (C) 下，CD45 阳性骨髓细胞群（实线箭头）似乎不包括红细胞、巨核细胞（空心箭头）、脂肪细胞或周围的骨组织。在正常肺 (D) 和肝 (E) 中，CD45 在少量广泛分布的细胞中表达，可能是肺泡间隔中的巨噬细胞和肝窦中的库普弗细胞。染色是在福尔马林固定的石蜡包埋组织切片中进行的，骨骼的厚度为 5 µm，肺和肝脏的厚度为 4 µm。图像是在 20 倍或 40 倍放大率下拍摄的。

当来自正常小鼠肝脏或肺的组织切片被染色时，我们观察到阳性细胞单独分散在组织中。除了血管中的白细胞外，独特的 CD45 ⁺细胞还存在于肺的肺泡隔或肝脏的血窦中。这些阳性细胞很可能是肺中的肺泡巨噬细胞或肝脏中的库普弗细胞。小鼠抗人 CD45 抗体已经很好地说明了人肺和肝脏中类似的 CD45 染色。https://www.novusbio.com/PDFs3/NBP2-52868.pdf。

总体而言，该抗体方案经验证可检测正常小鼠骨髓、肺和肝脏中的CD45 ⁺细胞。基于这些结果，我们继续在正常和糖尿病小鼠肾脏中进行 CD45 染色。

B. 正常和糖尿病小鼠肾脏中的 CD45 染色

将相同的 CD45 染色方案应用于正常和 OVE 糖尿病小鼠的肾脏。如图 2 所示，在低背景下显示细胞中明显的阳性染色。如同在骨髓中一样，如果省略 CD45 抗体，则在肾脏切片中没有看到染色（图像未显示）。在正常肾脏中，CD45 ⁺细胞均匀分布在整个肾皮质 (A)，主要分布在肾小管间质空间 (C)。CD45 ⁺细胞在正常肾脏中不形成簇。OVE 糖尿病会产生严重的蛋白尿（Zheng等人，2004 年和 2016 年），这与 CD45 染色的流行和模式的急剧变化相吻合。糖尿病肾中 CD45 阳性细胞的数量明显增加（B）。它们的分布也发生了显着变化：CD45 ⁺细胞倾向于围绕扩张或塌陷的小管（B 和 D），在那里它们形成大而紧密的簇，似乎扩大了间质空间（E 和 F）。这些结果清楚地表明，这种 CD45 染色方案在小鼠肾脏中运作良好，可用于分析糖尿病引起的主要变化。

图 2.正常和糖尿病肾中 CD45 ⁺细胞的代表性图像。

在正常肾脏中，CD45 ⁺细胞分布于整个肾皮质（A）。正常肾脏的更高放大倍数显示 CD45 ⁺细胞主要位于 1 或 2 个阳性细胞组中的肾小管间质空间 (C)。在糖尿病肾中，CD45 ⁺阳性细胞的数量大大增加，并且分布不均匀（B）。糖尿病肾中的大多数 CD45 ⁺细胞位于扩张或塌陷的小管周围的小管间质空间中（B 和 D）。CD45 ⁺细胞紧密堆积成大簇，似乎扩大了间隙空间（E 和 F）。石蜡包埋的福尔马林固定组织切片来自具有明显蛋白尿的正常 FVB 或 OVE 糖尿病小鼠。CD45 染色按照方法部分中的描述进行，并通过 DAB 颜色产生进行可视化。A 和 B 中的图像使用 20 倍物镜拍摄，C、D、E 和 F 中的图像使用 100 倍物镜拍摄。

图 3. OVE 糖尿病肾的典型图像，用 CD45 和 KIM-1 (A、B、C) 双染色或在连续切片上染色，用于 CD45 和巨噬细胞标记 F4/80 (D、E、F) 的共定位。

CD45 和 KIM-1 使用方法中描述的免疫荧光方案进行双染色。一抗用 CD45 的 Cy3（红色）和 KIM-1 的 FITC（绿色）可视化。肾损伤分子 KIM-1 主要出现在扩张的肾小管上皮细胞的顶端表面（A，原始放大倍数 20 倍，B 和 C，原始放大倍数 40 倍）。CD45 ⁺浸润细胞存在于 KIM-1 染色小管附近的小管间质中。通过将抗体分别应用于 IHC 中一张载玻片上的三个连续组织切片，将 CD45 的染色模式与单肾切除糖尿病小鼠肾脏切片中的 F4/80 进行比较；CD45 (D)、F4/80 (E) 和无一抗对照 (F)。CD45 和 F4/80 染色肾皮质的相同区域。D、E 和 F 的原始放大倍数为 20 倍。

C. CD45 染色与 KIM-1 或 F4/80 染色在糖尿病肾中的比较

为了扩大我们对 CD45 染色增加的病理意义的理解，我们将其与 KIM-1 和 F4/80 染色进行了比较（图 3）。肾损伤分子-1 (KIM-1) 是一种在急性或慢性纤维化肾病中表达的上皮磷脂酰丝氨酸受体（Humphreys等，2013；Mori等，2021）。KIM-1 和 CD45 通过方法中描述的免疫荧光方案在同一切片上进行双染色。一抗用 FITC（绿色）显示 KIM-1，Cy3（红色）显示 CD45。KIM-1 在扩张的肾小管上皮细胞的顶端表面表达 (图 3A-C)。CD45 ⁺浸润细胞簇存在于靠近许多被 KIM-1 染色的小管的小管间质中。KIM-1 和 CD45 染色之间的关联表明白细胞被受损的近端上皮吸引，进一步说明了糖尿病肾小管细胞损伤与肾脏炎症之间的相关性。

F4/80 是一种广泛使用的巨噬细胞标记物。由于CD45和F4/80抗体均来自大鼠，在同一切片中无法区分。因此，通过分别应用抗体来封闭连续组织切片来比较它们的染色模式。如图 3D 和 E 所示，它们的染色模式非常相似，这意味着许多 CD45 ⁺细胞是巨噬细胞。该策略可与其他感兴趣的抗体一起使用。

在本协议中，我们专注于描述 CD45 染色的程序，直到定量分析的可选程序。虽然我们之前在此 CD45 染色方案（Zheng等，2016）之后成功地进行了定量分析，但不同组中的染色经常如此明显，以至于无需定量即可得出结论。

概括

总之，我们优化了小鼠肾脏 CD45 染色的 IHC 方案。

由于一抗来自大鼠，因此选择生物素化的山羊抗大鼠（小鼠吸附）二抗进行染色。为了减少非特异性结合，使用了“小鼠吸附”抗大鼠 IgG (H+L) 产品，因为小鼠组织可能含有内源性小鼠免疫球蛋白。“生物素化”抗体可以确保最大程度的标记，而不会影响抗体的特异性或亲和力。

一些组织在切片中有内源性生物素或生物素结合蛋白、凝集素或非特异性结合物质，可能与亲和素、生物素化辣根过氧化物酶或其他亲和素/生物素系统成分结合，导致使用ABC试剂时产生高背景。因此，我们应用了亲和素-生物素封闭来减少背景染色。我们在本协议中采用了另一种方法来进行抗生物素蛋白/生物素阻断。将抗生物素蛋白和生物素封闭纳入血清封闭和一抗孵育步骤。该程序在 ABC 检测系统中保持低背景方面运行良好。

需要抗原揭露程序来实现 CD45 的最佳 IHC 染色，因为这种抗原可能会被长时间的福尔马林固定和石蜡包埋过程掩盖。在该协议中，使用了柠檬酸缓冲液 (pH 6.0) 的热诱导表位检索 (HIER) 。在柠檬酸盐缓冲液中在 95-100 °C 下处理 20 分钟的载玻片产生了足够的结果。来自商业来源或实验室制造的抗原修复解决方案都很好（配方如下）。

CD45 是一种泛白细胞蛋白，可用于识别造血谱系的细胞，如粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞/单核细胞。许多这些细胞通常分布在血流和一些组织中，如肺或肝脏，但特别富含淋巴结或脾脏。这些是方便的阳性对照组织。当小鼠胫骨用 14% EDTA 脱钙 72 小时时，骨髓组织也可以给出可靠的阳性染色。当省略一抗时不存在阳性染色。通过该协议，我们证明了糖尿病小鼠肾脏中 CD45 ⁺细胞的浸润显着增加。用其他抗体对相邻切片进行双重染色或染色可以扩大我们进一步将炎症细胞浸润与肾脏疾病进展中的其他有害因素联系起来的能力。

食谱

1. 柠檬酸盐缓冲液（10 mM 柠檬酸，pH 6.0）

将 2.94 g 二水柠檬酸钠溶解在 800 ml Milli-Q 水中，调节至 pH 6.0，最后用 Milli-Q 水定容至 1,000 ml。

2. 14% 乙二胺四乙酸

要制备 2,000 毫升 14% EDTA，将 250 克 EDTA-2Na 加入 1,750 毫升 Milli-Q 水中，然后加入 25 克氢氧化钠颗粒。继续搅拌并稍微加热，直到 EDTA 溶解。将 pH 值调至 7.0，然后用水将体积调至 2,000 毫升。

3. 2.5% 正常山羊血清

将 250 µl 正常山羊血清添加到 10 ml PBS 中。

4. 0.1% 吐温 20 的 PBS

将 0.1 ml 的 Tween 20 添加到 100 ml 的 PBS。

5. 2.5% 正常驴血清

将 250 µl 正常驴血清添加到 10 ml PBS 中。

6. PBS-T

0.1% 吐温 20 的 PBS

致谢

该协议是从以前的出版物（Zheng等，2016）改编和扩展的。我们感谢 JDRF 和 NIH 的赠款支持。JDRF 3-2005-932 到 SZ、JDRF 1-2005-88 和 NIDDK DK072032 到 PE。

利益争夺

作者没有要披露的利益冲突或竞争利益。

伦理

所有动物程序均遵循 NIH 实验动物护理和使用指南，并获得路易斯维尔大学机构动物护理和使用委员会的批准。

参考

1. Epstein, PN, Overbeek, PA 和 Means, AR (1989)。钙调蛋白诱导的转基因小鼠早发性糖尿病。 单元格58(6)：1067-1073。

2. Humphreys, BD, Xu, F., Sabbisetti, V., Grgic, I., Movahedi Naini, S., Wang, N., Chen, G., Xiao, S., Patel, D., Henderson, JM, et艾尔。(2013)。慢性上皮肾损伤分子 1 表达导致鼠肾纤维化。 J Clin Invest 123(9): 4023-4035。

3. Mori, Y., Ajay, AK, Chang, JH, Mou, S., Zhao, H., Kishi, S., Li, J., Brooks, CR, Xiao, S., Woo, H.等。(2021)。KIM-1 介导肾小管细胞摄取脂肪酸以促进进行性糖尿病肾病。细胞代谢表 33(5)：1042-1061 e1047。

4. Zheng, S.、Coventry, S.、Cai, L.、Powell、DW、Jala、VR、Haribabu, B. 和 Epstein, PN (2016)。通过遗传缺失糖尿病 OVE 小鼠的非典型趋化因子受体 ACKR2 来保护肾脏。J 糖尿病研究2016：5362506。

5. Zheng, S., Noonan, WT, Metreveli, NS, Coventry, S., Kralik, PM, Carlson, EC 和 Epstein, PN (2004)。OVE26 糖尿病小鼠晚期糖尿病肾病的发展。糖尿病53(12)：3248-3257。

6. Zheng, S.、Huang, Y.、Yang, L.、Chen, T.、Xu, J. 和 Epstein, PN (2011)。糖尿病 OVE26 小鼠的单肾切除术大大加速了蛋白尿、纤维化、炎症细胞浸润和基因表达的变化。 Nephron Exp Nephrol 119(1): e21-32。