材料和试剂
材料

5 - ml Eppendorf 管（Eppendorf，目录号：0030119401 ）
2 -毫升Eppendorf管（的Eppendorf ，目录号：022363352 ）
1.5 -毫升Eppendorf管（的Eppendorf ，目录号：022364111 ）
0.5 -毫升Eppendorf管仪（Eppendorf ，目录号：022363611 ）
玻璃底ed μ 载玻片（Ibidi，目录号：80827 ）
玻璃底ed μ盘（Ibidi ，目录号：81158 ）
氯丁橡胶手套（Ansell，目录号：25-101 ）
聚苯乙烯培养皿（Sigma-Aldrich ，目录号：P5731）

试剂

16% 多聚甲醛（电子显微镜科学，目录编号： 15710-S )
来自猪肠粘膜的肝素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：H3393）
二氯甲烷（Sigma-Aldrich，目录号：270997）
二苄基醚（Sigma-Aldrich，目录号：108014）
二甲基亚砜（Fisher Scientific，目录号：D128-500）
Triton X-100（Sigma-Aldrich ，目录号：T8787）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G7126）
双蒸 H 2 O
Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：58032）
过氧化氢溶液（30％）（Sigma-Aldrich，目录号：216763）
正常驴血清（Jackson ImmunoResearch，目录号：017-000-121）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：322415-2L）
琼脂糖（Invitrogen，目录号：16520-050）
PBS（Fisher Scientific，目录号：BP2944100）
Forane（异氟醚，USP）（Baxter，Deerfield，IL，美国）
4% PFA 缓冲液（见配方）
10% 叠氮化钠 (NaN 3 ) 库存（见配方）
修改后的 PTxwH（见配方）
透化缓冲液（见配方）
阻塞缓冲区（见食谱）

设备
1.细镊子（Dumont tweezers ，WPI ，目录号：14098 [#5]；500234 [#5B]） 2.虹膜剪刀（WPI，目录号：501758） 3.钝镊子（例如，敷料钳12.5厘米；WPI，目录号：501217） 4.单刃剃刀刀片或手术刀（例如，单刃剃刀刀片 #12，Titan，Seattle，WA，USA；一次性手术刀 #20，WPI，目录号：500352） 5.氰基丙烯酸酯胶（例如，大猩猩强力胶、乐泰强力胶、Starbond EM-02、Krazy 万能胶） 6.吸收垫（例如，Medline，目录号：DDPAD1724Z） 7.蠕动泵（Gilson，目录号：F155005） 8.解剖显微镜（United Scope LLC，型号：SM- 2T-6WB-V331） 9.章动摇床（Benchmark Scientific，型号：B3D5000） 10.培养箱（37°C，无需 CO 2 ），内部可放置摇床或旋转混合器，或内置摇床/混合器 11.离心机（无需冷藏）（Labnet公司我国际，型号：C2400） 12.标准家用微波炉（例如，西屋，型号：WCM660W） 13.光片显微镜（Ultramicroscope II, LaVision Biotec, Bielefeld, Germany 或类似仪器） 14.共聚焦显微镜（倒置蔡司 LSM，Carl Zeiss AG，Oberkochen，德国，或配备标准 10 ×物镜、红色和远红色滤光片的类似仪器） 15.图像分析电脑（建议规格：主板：技嘉X299 Designare EX；CPU：Intel Core i7 7800X 3.5GHz 六核8.25MB 140W；RAM：32GB；显卡：Nvidia Quadro P4000 8GB；硬盘：512GB SSD加1TB SSD ；电源：850W；散热：Noctua NH-U12DX i4 CPU 散热和Arctic MX-2 导热膏；操作系统：Windows 10 64 位）软件用于 3D 分割的图像分析软件（例如，Imaris、Bitplane、Zürich、Switzerland）电子表格软件（例如，Excel、Microsoft、Redmond、WA、USA）数据分析软件（例如，GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA）程序样品采集和制备小鼠组织所有动物实验都必须根据批准的机构动物协议进行。注意：多聚甲醛 (PFA) 及其烟雾有毒。操作之前，请务必参阅安全数据表，并使用了推荐的个人防护设备（包括手套，实验室外套，和面部防护）。在通风橱内处理 PFA, 并根据机构要求收集所有废物进行适当处置。在灌注过程中，可将高吸收性一次性垫放置在罩内以收集血液和 PFA。用异氟醚麻醉小鼠 (3-5% 用于诱导, 1-2% 用于维护)。当鼠标完全麻醉时继续，如脚趾捏合没有反应所示。使用蠕动泵（流速约 6 毫升/分钟），用约 20 毫升冷肝素化磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（10-20 单位/毫升）进行经心灌注（Wu等人，2021 年），直到从组织中取出血液，从右心房流出的液体是清澈的。继续用约 20 毫升冰-冷的 4% PFA灌注，直到身体僵硬。注：良好的灌注是至关重要的，以实验的质量。为了确保良好的灌注，必须尽可能多地去除血液。在 PBS 中加入肝素对于防止血凝块形成很重要。当用肝素 PBS 灌注时，观察肝脏的颜色，并在肝脏变白后继续用肝素 PBS 灌注 2-3 分钟，然后再切换到 PFA，以确保血液已从胰腺中去除。立即解剖胰腺，注意不要损坏胃和肠（图2 ）。放置解剖胰腺成P ETRI菜含有冷PBS解剖显微镜下和移除脂肪和肠系膜组织。注意：肠系膜脂肪组织在解剖显微镜下看起来苍白和闪闪发光，可以很容易地用钝镊子从胰腺组织中拉出。也可以用小剪刀小心地剪掉。为了更容易地进行解剖评估，在进行清除协议之前，可以将胰腺分为解剖亚区域（十二指肠、脾脏或胃）（图2 ）。或者，对于抗体评估，可以将组织切成小块（2-3 毫米3 ）。 Postfix pancreata 在 4% PFA 中于 4°C 振荡过夜（在章动振荡器上约 25 RPM）。注意：在 Eppendorf 管中使用 5:1 的 PFA 与组织体积的比率（关于大小，请参见表1 ）。长时间固定会增加组织自发荧光。在 PBS 中洗涤样品 3 次，每次 30 分钟。放置在样品P用PBS ETRI盘，和使用细镊子从样品解剖显微镜下去掉毛发和棉绒。立即进行样品脱脂（B 部分）。注意：如有必要，样品可以在 4°C 下在含有 0.02% 叠氮化钠 (NaN 3 ) 的PBS 中保存数周，但这可能会影响实验质量。 Fig1_NEW 图2 。带有周围器官和解剖亚区域的小鼠胰腺人体组织采集后立即用 4% PFA 固定样品。在 4°C 下在 4% PFA 中摇动（~25 RPM）过夜。继续执行从S t ep A 7 ( PBS × 3)开始的小鼠组织协议。注意：由于人体组织不会被灌注，其质量可能比啮齿动物组织的质量变化更大。样品预处理（脱脂，漂白，和透）注意：所有摇动步骤都应在章动摇床上以 25 RPM 的速度进行。将样品转移到足够大小的管中（表1 ），样品最好不超过管体积的 25%，并使用手术刀或刀片仔细标记每个管。彩色聚丙烯管可用于分离样品。注意：永久性标记很容易被甲醇去除。表1 。管子尺寸和用途列表管径用法 5 -毫升后固定，洗涤，重新/脱水，和大的样品的清除（例如，完整的胰腺或大半胰腺） 2 -毫升后固定，瓦特灰化，再/脱水，以及小的或中间样本的清除（例如。，小半胰腺）大样本的抗体温育（例如。，完整的胰腺或大半胰腺） 1.5 -毫升后固定，瓦特灰化，再/脱水，和小样本的清除（例如。，胰腺切片几个毫米直径）中间样本的抗体温育（例如。，小半胰腺） 0.5 -毫升小样品的抗体孵育（例如。，胰腺切片几个毫米直径）在 H 2 O (20、40、60、80 和 100%) 中的甲醇梯度中脱水样品。以每个浓度在 RT 中摇动孵育 1小时。始终完全填充管以避免样品氧化。注意：甲醇有毒、易燃、易挥发。始终在通风橱内处理甲醇，并根据机构要求收集所有废物以进行适当处置。用 100% 甲醇在室温下摇动洗涤样品 1小时。在 RT 中用100% 二氯甲烷 (DCM) 清洗样品 1小时，摇动以去除疏水性脂质。注意：在通风橱内处理 DCM 并仅使用兼容材料（例如聚丙烯）。使用双层丁腈手套或与 DCM 兼容的手套（例如氯丁橡胶）。根据机构要求收集所有废物以进行适当处置。在 100% 甲醇中洗涤样品 3 次 × 30 分钟在室温下摇动。在 4°C 下在 5% H 2 O 2甲醇中漂白样品过夜，无需摇晃以减少组织自发荧光。保持样品避光。注：H 2 ö 2可以与摇动，光降解，和热暴露。在甲醇的反向梯度（80、60、40 和 20%）中对样品进行再水化。以每个浓度在室温下摇动孵育 30 分钟。在 RT 中摇动在透化缓冲液中清洗样品 1小时。在室温下摇动过夜，在通透缓冲液中孵育样品。在 PTxwH 中洗涤样品 3 × 30 分钟，在室温下摇晃。立即进行免疫标记。注意：如有必要，脱脂样品可以在 PTxwH 中与 0.02% NaN 3 一起在 4°C 下保存数周。长期储存可能会影响染色效率。免疫标记表2中列出了经验证可用于该协议的胰腺组织的一级和二级抗体。表2 。在胰腺中针对 iDISCO+ 验证的抗体。改编自 Alvarsson等人。（2020 年）。内分泌标志物的主要抗体目标稀释寄主种类制造商产品编号注册号码胰高血糖素 1:200 兔子细胞信号技术 2760 AB_659831 胰高血糖素 1:2000 - 1:5000 鼠西格玛奥德里奇 G2654 AB_259852 胰岛素 1:1000 豚鼠达科/安捷伦 A0564 AB_10013624 胰岛素 1:500 鼠研发系统 MAB1417 AB_2126533 生长抑素 1:1000 山羊圣诞老人 SC7819 AB_2302603 神经元标记物的主要抗体神经丝 200 kDA 1:500 兔子西格玛奥德里奇 N4142 AB_477272 突触素 1:500 兔子细胞信号技术 5297 AB_2616578 TRPV1 1:500 兔子芦荟实验室 ACC-030 AB_2313819 酪氨酸羟化酶 1:500 兔子密理博 AB152 AB_390204 囊泡乙酰胆碱转运蛋白 1:500 兔子突触系统 139 103 AB_887864 其他主要抗体粘蛋白1 1:200 亚美尼亚仓鼠赛默飞世尔科技 MA5-11202 AB_11000874 绿色荧光蛋白 1:2000 鸡艾维斯 GFP-1010 AB_2307313 红色荧光蛋白 1:2000 兔子罗克兰 600-401-379 AB_2209751 HA标签 1:500 兔子细胞信号 3724 AB_1549585 二级抗体目标共轭稀释寄主种类制造商产品编号注册号码亚美尼亚仓鼠 Alexa Fluor® 594 1:500 山羊杰克逊免疫研究 127-585-099 AB_2338998 山羊 Alexa Fluor® 546 1:500 驴赛默飞世尔科技 A-11056 AB_2534103 豚鼠 Alexa Fluor® 647 1:500 驴杰克逊免疫研究 706-605-148 AB_2340476 鼠 Alexa Fluor® Plus 647 1:500 驴英杰 A32787 AB_2762830 兔子 Alexa Fluor® 647 1:500 驴杰克逊免疫研究 711-605-152 AB_2492288 兔子 Alexa Fluor® 594 1:500 驴英杰 A-21207 AB_141637 兔子 Alexa Fluor® 546 1:500 驴赛默飞世尔科技 A10040 AB_2534016 鼠 DyLight® 550 1:500 驴赛默飞世尔科技 SA5-10027 AB_2556607 鼠 Alexa Fluor® 488 1:500 驴赛默飞世尔科技 A-21208 AB_25357794 在 37°C 振荡下在封闭缓冲液中封闭样品过夜。通过在 PTxwH 中稀释一抗，在振荡器上混合 10 分钟，然后以 16,000 × g离心10 分钟来制备一抗。准备的体积取决于管和样品大小（表1 ）。传送纺出-在抗体管以除去沉淀物的底部向下抗体溶液的样品管中，留下〜10微升。在样品中加入 3% NDS。如有必要，向样品中添加额外的 PTxwH 以完全填充管子。将样品与一抗孵育 3-6 天，具体取决于样品大小，在 37°C 下振荡。保护样品免受光照。注意：添加 0.01% NaN 3以防止微生物生长并保护抗体在延长孵育时间期间不会降解。建议的6天的温育时间对于全鼠胰腺组织和大hemipancreata以确保完全和甚至抗体扩散（见“故障排除Ñ OTES ”一节）。在 RT 中用 PTxwH 在 1 天内洗涤样品 5 次，最后一次洗涤过夜。通过在 PTxwH 中稀释二抗，在振荡器上混合 10 分钟，然后以 16,000 × g离心10 分钟来制备二抗。准备的体积取决于管和样品大小（表1 ）。传送纺出-在抗体管以除去沉淀物的底部向下抗体溶液的样品管中，留下〜10微升。在样品中加入 3% NDS。如有必要，向样品中添加额外的 PTxwH 以完全填充管子。注意：建议使用红色或远红色二抗。由于组织自发荧光，GFP标记的二抗只能用于表达非常高的标记物，不建议使用波长较短的二抗。近红外二抗也可用于高度表达的标记物，但在成像过程中可能需要延长曝光时间。将样品与二抗孵育 3-6 天，具体取决于样品大小，在 37°C 下振荡。保护样品免受光照。注意：添加 0.01% NaN 3以防止微生物生长并保护抗体在延长的孵育时间内不会降解。在 RT 中用 PTxwH 在 1 天内洗涤样品 5 次，最后一次洗涤过夜。用 PBS 在 1 天内在 RT 中洗涤样品 5 次，最后一次洗涤过夜。将胰腺样品嵌入 PBS 中的 1% 低熔点琼脂糖中。加热琼脂糖/ PBS在微波直到熔融，然后倒入一个P ETRI盘冷却。当琼脂糖的温度低于 37°C 时（可以用温度计或手动测量），用镊子小心地将胰腺放入液体琼脂糖中，注意将其正确放置并用无气泡的琼脂糖覆盖. 低熔点琼脂糖开始固化在25℃下，但这个过程可以通过将被加速P ETRI菜在冰箱。凝固后用刀片或手术刀将琼脂糖切成合适的大小。注意：嵌入是必要的光片成像，但可能不是必需的用于在Ibidiμ-滑动或玻璃底的小胰腺切片共焦成像版P ETRI菜。组织清除注意：在所有步骤中保护样品免受光照。在甲醇/H 2 O (20、40、60、80 和 100%)梯度中对样品进行脱水；每个步骤为1个小时，在室温下振荡。样品可以任选地在室温下在甲醇中放置过夜。注意：甲醇有毒、易燃、易挥发。始终在通风橱内处理并收集所有废物以进行适当处置。在室温下用 100% 甲醇洗涤样品 3 次，每次至少 30 分钟，同时摇动。在 100% DCM 中洗涤样品 3 次，每次 30 分钟，在室温下摇动。注意：在通风橱内把手DCM并小心仅与相容的材料（例如用它，聚丙烯）。使用与DCM（如兼容双丁腈手套或手套，氯丁橡胶）。收集所有废物以进行适当处置。转移样品放入二苄基醚（DBE）为清楚ING （图3 ）。填充管与DBE顶端，以避免任何空气的存在留在管，这可能会导致样品氧化。将样品储存在 DBE 中，避光。注意：在DBE样品可以储存在室温下，但储存在4℃下可以保存荧光为更长的时间。DBE 的熔点为 1.5-3.5°C ，因此储存在冰箱中的样品可能会冻结。在通风橱中处理 DBE 并根据机构要求收集任何废物以进行适当处置。图3 。光学清除。琼脂糖-嵌入小鼠胰腺之前（左）和之后（右）接受光学清除协议。成像建议对整个组织和半胰腺使用光片显微镜（LaVision Ultramicroscope II 或类似产品）。阿1.3 ×或2 ×物镜是适用于全-组织支架，而4 ×或12 ×物镜被推荐用于精细支配。配备了10倒置共聚焦显微镜（Zeiss LSM或类似）×客观建议用于成像小胰腺切片，特别是当需要更高的分辨率，诸如用于ANALY小号神经触点或胰腺神经节的ES。图4显示了系统和物镜之间放大倍数的差异。放大图4 。系统比较。用装有1.3的光片显微镜（LaVision Ultramacroscope II）捕获的单个Z堆叠图像×物镜，4 ×物镜，和一个12 ×物镜（hemipancreata），和反相的共聚焦显微镜配备了10 ×物镜（小胰腺部分）。光片成像注意：有关操作的详细信息，请务必查阅显微镜核心设施和/或特定的显微镜用户手册。在通风橱中，用钝镊子将样品从其储存瓶中取出，并将其连接到尺寸正确的样品架上（图5A ）。大型琼脂糖嵌入样品可能需要用氰基丙烯酸酯胶固定到平面样品架上（图5 B）。组装样本保持器到样品支架，然后将其浸没在DBE在光片显微镜（的反应杯如图5 ℃）。注意不要将 DBE 溅到仪器上，并立即用甲醇清洁任何溢出物。[R E放置手套处理任何仪器或设备，以避免损坏之前沾染DBE。将样品安装在比色皿中以确保样品垂直于光片。使用操纵杆移动样品，直到光片照亮样品，然后降低物镜以聚焦样品。如果使用浸渍物镜，移动它直到它接触到 DBE 的表面，然后慢慢降低它以防止意外碰到样品或支架。调整显示设置以在对焦时正确查看样本。在光片显微镜软件（ImSpectorPro）中，选择光片（一个或多个）来使用（这将取决于特定的仪器;与所述成像芯协商），调整光片的宽度，以便它均匀地照亮整个样品. 如果使用多个波长，则选择激光器并单独调整每个通道的焦点。调整激光功率和曝光时间以确保信号不饱和。保存您的用户设置以确保成像会话之间的一致性。注意：对于将进行统计比较的样本，始终使用相同的成像设置。对于全-安装成像，获取在1.3 Z-层叠光学切片×或2 ×放大率具有最低变焦设定和3-5微米的步长大小。该决议足以形象胰岛素+小岛和大丝状结构，如神经干，管，和血管。采集在4 Z-层叠光学切片×或12 ×放大倍数下通过动态水平聚焦和2-5微米的步长，以产生适用于评估精细的结构的图像，诸如个人α细胞，β细胞，细丝状神经支配，细管，毛细血管，和胰腺内神经节。对于可以由少至两个神经元组成的神经节分析，重要的是使用足够的放大倍数来自信地识别单个细胞体（图4 ）。可以使用插件 TeraStitcher（Bria 和 Iannello，2012）以 4 ×和 12 ×获得 20% 重叠和拼接的拼接马赛克图像。但是，生成马赛克图像可能很耗时，并且会生成非常大的文件，需要更多的处理能力进行分析。马赛克图像的替代方法是从每个样本中以 4倍或 12倍放大率获取 1-3 个单独的 z 堆栈，分别对它们进行分割和分析，然后合并结果。注意：影响光片采集时间的因素是曝光时间、动态水平焦点（每幅图像的步数）和步长。步长也会影响最终文件的大小。增加激光功率可缩短曝光时间；ħ H但是，增加的激光功率增加了样品的漂白的风险，因此，只有增加激光功率立即成像之前。图片包含建筑，自行车描述已自动生成图5 。用于光片显微镜的样品安装。对于较小的琼脂糖样品架-包埋的样品，其中所述样品被用螺钉固定（A）。对于大的琼脂糖样品架-包埋的样品，其中所述样品是用胶水固定（B）。然后将样品架连接到样品架上并用螺钉固定以浸入 DBE (C)。共聚焦成像注意：如果对同一样品进行光片和共焦成像，由于样品漂白的风险增加，最后进行共焦成像。有关操作的详细信息，请务必查阅显微镜核心设施和/或显微镜用户手册。除去的从样品的储存小瓶使用玻璃底细钝镊子和地方它ED μ-幻灯片或μ-菜，避免了样品与玻璃之间的空气泡。在成像之前和之后检查腔室/幻灯片的完整性，以确保 DBE 没有泄漏，这会损坏显微镜。使用标准 10 ×物镜和 5-10 μm 步长获取 z 堆叠光学部分，用于胰岛和神经节等较大结构，或步长 <5 μm 以获取更精细的细节，如神经接触。注意：由于工作距离较短，标准 20 ×物镜只能用于靠近样品表面的成像结构。对于更高的放大倍率，建议使用长工作距离的物镜。大TA分析我法师的处理和分析注意：使用的3D图像处理软件，以生成从获取的Z-堆叠的3D图像，并执行体积和距离ANALY小号ES。下面的协议适用于 Imaris 中的图像分析，但请注意，还有其他商业和开源图像分析程序可用于类似的目的。有关使用 Imaris 软件的其他在线视频教程和网络研讨会，请访问https://imaris.oxinst.com/tutorials和https://imaris.oxinst.com/homeschool。将所取得的Z堆叠图像的图像分析电脑，并确保始终保持日Ë小号Ë数据备份。光片显微镜生成的文件很大（每个图像 10-200 GB），因此请制定长期数据存储计划。通过将图像文件夹添加为“观察文件夹” ，将 z-stack 导入 Imaris ，然后双击 z-stack 以自动生成压缩的 3D 图像。使用创建向导创建覆盖每个通道中感兴趣的信号的数字表面（详细概述如下）。这些表面将用于提取每个通道的特定测量值，例如音量和信号强度。小号egmentation 胰岛素+胰岛的分割：通过单击左上角菜单中的蓝色“表面”按钮创建数字表面。在创建向导，CHO ö本身来分析整个图像或感兴趣区域（ROI）的区域。在接下来的步骤中，选择正确的信道，平滑因子，和“背景扣除”（图6的A）。默认平滑因子通常可用于胰岛分析。注意：的阈值可以具有取决于样品质量和计算能力要被修改，但最好应保持ANALY之间的相同小号ES。较小的平滑因子将提供更精细的细节，但与较大的平滑因子相比需要更多的内存来处理。对于“背景扣除，”阈值因子应当对应于每个样品中的最大的胰岛的直径。该值可以通过切换到“视图”菜单下的“切片”视图来获得（图6 B）。滚动整个 z 堆栈以识别最大的胰岛，并使用右上角的“测量”工具获取直径（图6 C、5D）。在下一步骤中，设置检测阈值，š UCH它充分地覆盖胰岛素+胰岛和β细胞不覆盖任何不需要的荧光（图6 E）。打开和关闭表面以将体积覆盖与胰岛通道进行比较，确保没有渲染的体积看起来太大或不足以覆盖较暗的结构。注意：由于大型数据集的胰岛素强度可能会有所不同，同样在同一样本中，可能必须针对每个样本调整检测阈值，以实现最佳胰岛检测。因此，保持样本之间的显示调整相似非常重要。显示调整不改变强度的输出值，但改变了强度是如何显示在屏幕上，而这又将使胰岛看调光器/较小/较大和第erefore手动设置时，它可能会影响阈值。如果由于胰岛素强度的高度可变性而有必要，可以创建多个 ROI 来覆盖不同强度的胰岛，作为单独胰岛表面的一部分，然后可以在完成后使用“编辑”工具将其合并为一个胰岛表面。抗体沉淀是常见的人工制品，表现为微小、明亮、有时呈细长的点或星状，通常位于样品表面。要从胰岛表面去除抗体沉淀物，可以使用创建向导中的“过滤器”功能从最终表面排除低于 120 μm 3 （一个 β 细胞的近似大小）的体积。在“过滤器类型”下，选择“体积”（图6 F）并排除体积低于 120 μm 3 的对象（图6 G）。此功能还可用于从最终分析中去除特定大小以下的胰岛，例如仅由少数 β 细胞组成的原始胰岛。理想情况下，此类排除标准应在分析之前建立，并在所有样本中平等应用。注意：Art i事实只能通过删除涵盖 art i事实的卷来从分析中删除。剪裁平面和切片工具只会从视野中移除体积，而不会从分析中移除。 C:\Users\alvara16\AppData\Local\Microsoft\Windows\INetCache\Content.Word\islets3 copy.jpg 图6 。朗格汉斯岛的分割。从了Imaris截图示出了用于分析胰岛素+胰岛中的关键步骤，这包括建立与标识的最大直径的（C，d），叔平滑（A），背景减除（B）ħ resholding（E），并且基于滤波体积（F，G）。神经分割：通常建议使用对应于最宽神经干宽度的阈值因子（例如，12 μm）。然而，对于丝状结构，较低的阈值可能会提供更好的数字表面覆盖率，具体取决于所用神经元标记的具体特征，包括最细神经纤维的直径。同样，平滑因子需要根据特定的神经元标记（例如，3.5-1 μm）进行优化。注意：较小的平滑因子将提供更精细的细节，但与较大的平滑因子相比，需要更多的内存来处理。当对酪氨酸羟化酶 (TH) 染色时，TH+ β 细胞的存在可能会混淆 TH+ 胰腺神经支配的测量值（Iturriza 和 Thibault，1993 年；Persson-Sjögren等，2002 年）。为了优化检测 TH+ 神经，必须从最终的 TH+ 神经表面手动去除 TH+ β 细胞。这可以通过排除低于 120 μm 3 的体积位于胰岛素 + 胰岛内并与胰岛素染色重叠来完成。创建 TH+ 神经表面后，突出显示它并单击屏幕左下角的铅笔图标（“编辑”）。选择“圆形”并使用鼠标滚轮选择鼠标指针的大小。放大胰岛并使用指针选择与 β 细胞对应的体积。按“删除”键从最终表面删除这些体积。注意：使用此方法只能去除不接触神经的 TH+ β 细胞。内分泌神经支配的分割：这是通过屏蔽神经支配通道以去除背景，然后使用胰岛体积再次屏蔽它以去除胰岛外的神经支配，从而生成一个新的通道，其中剩余的信号来自胰岛内的神经支配。选择神经支配表面（图7 A）并单击铅笔（“编辑”）图标（图7 B）。单击“编辑”下的“全部屏蔽”（图7 C）。在弹出框中，选择神经支配通道（图7 D）和“将体素外表面设置为：0.000”（图7 E），然后单击“确定（图 7 F）”。Imaris 现在将创建一个新通道“Masked [innervation channel name] ，”包含没有背景的神经支配。选择胰岛表面（图7 G），单击“编辑，”然后“掩模所有”。在弹出的框中，选择新创建的蒙版神经支配通道和“将体素外表面设置为：0.000”，然后单击“确定” 。Imaris 现在将创建一个新通道，其中信号代表没有背景的胰岛内的神经支配（图7 H）。使用与在步骤 2 中分割神经时相同的设置，基于这个新通道创建一个新表面。 C:\Users\alvara16\AppData\Local\Microsoft\Windows\INetCache\Content.Word\nerves2 copy.jpg 图7 。Imaris 内分泌神经支配的分割。Imaris 的屏幕截图显示了分析内分泌细胞内部神经支配的关键步骤。这是通过两次屏蔽神经通道来完成的；一旦使用“神经”表面，以去除从神经通道（AF），并使用“胰岛”表面（绿色轮廓），以除去所有的神经信号的第二时间的所有背景小号外胰岛（G），从而产生一个新的信道，其中信号仅对应于胰岛 (H) 内的神经支配。神经节的分割：使用足够放大的图像来自信地识别细胞体。使用“切片”视图识别神经节（图8 A），并使用“编辑”下的“注释”工具标记它们（图8 B - D）。切换到 3D 视图（图8 E）并使用创建向导在每个单独的神经节周围手动创建一个 ROI（图8 F - I）。这将生成专门覆盖神经节细胞体而不是神经纤维的数字表面。设置阈值以完全覆盖神经节的细胞体，然后进行上述分割（图8 J）。电脑萤幕画面描述已自动生成图8 。Imaris 中胰内神经节的分割。Imaris 的屏幕截图显示了分割胰腺神经节的关键步骤。“切片”视图 (A) 可与“注释”工具 (B、C) 一起使用，以识别 2D (D) 中的神经节。在 3D 视图中，创建一个新表面 (F, G)，其中一个 ROI 覆盖每个单独的神经节 (H, I)。设置阈值以完全覆盖神经节 (J) 的细胞体。总样本量的分割：对于进行体积分析的每个样品，使用具有最高背景信号的通道创建一个覆盖样品总体积的表面。需要此值来调整总样本量的变化。 d istance计算距离计算的目的是识别密切相关的表面，暗示生理相互作用。非突触自主神经传递发生在长达 2 μm 的距离内，而激素和细胞因子可以在更远的距离内起作用（Burnstock ，2008）。 1.在 Imaris 9.5 和更新版本中，可以在创建表面时使用创建向导中的“最短距离计算”功能获得距离测量值（图9 A和 B）。这将在导出数据时生成一个名为“到表面的最短距离=[名称]”的新参数。 2.如果使用 Imaris 9.3 或更早版本，可以使用 Imaris “Distance Transformation” XTension 函数来计算每个胰岛表面与神经支配表面的距离。要使用此功能，请选择最终的神经支配表面（图9 A），然后在“图像处理”（图9 C）→ “表面函数”（图9 D ）下选择“距离变换” 。运行插件并选择“外部表面对象”选项。这将生成一个新通道，其中强度基于与所选表面的距离。从胰岛到神经的距离应报告为每个胰岛表面到神经表面的距离转换通道的强度最小值（强度 0 = 胰岛接触神经），由距离转换操作计算得出。 3.为了在视觉上显示的距离从一个表面到另一个表面，选择的表面，然后点击“颜色”（图9 ë ）。将颜色类型设置为“Statistics Coded”（图9 F ），然后在“Statistics Type”下选择“Shortest Distance to Surface[name]”（图9 G - H ）。如果距离测量是使用“距离变换” XTension 完成的，则表面应为距离变换通道的最小强度进行统计编码。 4.在具有足够放大倍数的图像中，可以创建数字表面以覆盖神经和单个 α 或 β 细胞，并且可以使用步骤 1-3 中概述的原理计算神经和单个细胞之间的距离。神经/细胞距离为 0 表示神经接触。注意：此方法不允许孔定量牛逼的通货膨胀的每内分泌细胞接触的数量。电脑游戏的截图描述已自动生成图9 。Imaris 中的距离计算。可以在 Imaris 中使用“最短距离计算”（A 、B）或使用“距离变换”XTension 函数（C、D）获得选定表面与任何其他表面之间的最短距离。要制作说明到神经距离的颜色叠加，突出显示“胰岛”表面并单击“颜色”（E），选择“统计编码”（F），然后在“统计类型”下选择“到表面的最短距离，表面” =神经”（G）。H 显示没有表面（上图）和“胰岛”表面颜色的胰岛和神经支配-编码为与“神经”表面的距离（下图）。数据导出和处理通过突出显示每个分段表面并单击导出按钮，将数据导出为 Excel 电子表格。创建总结ê Xcel公司文件，以保持组织导出的数据。在 Excel 中：将表面体积计算为总样本体积的百分比，以调整样本大小的差异。计算内分泌神经体积占每个样本中总胰岛体积的百分比。使用平均或中值强度值来计算胰岛素强度。对于由多个卷（的表面例如，胰岛素），了Imaris将生成用于每个卷的唯一ID号，这将在“ID”中导出的Excel片被显示。这个ID号可以用于关联不同的参数，如音量，亮度，和距离。食谱肝素化的PBS（500米升，每米20个单位升） 500 毫升升dH 2 O PBS片 10,000 单位肝素钠盐（例如，添加 55.6 mg ≥180 USP 单位/mg 肝素） 4% PFA 缓冲液（100 毫升） 75 毫升 H 2 O 25 毫升 16% PFA 0.5 PBS 片注意：在灌注过程中准备新鲜并保持在冰上。PFA 及其烟雾有毒。操作之前，请务必参阅安全数据表，并使用了推荐的个人防护设备（包括手套，实验室外套，和面部防护）。在通风橱内处理PFA 并根据机构要求收集所有废物以进行适当处置。 10％小号裂果叠氮化物（的NaN 3 ）的库存（100毫升）中 100 毫升 H 2 O 10 克 NaN 3