材料和试剂
1 LightCycler ® 8联管，清除（罗氏，目录号：06327672001）
2 LightCycler ® 480多井板96，清除（罗氏，目录号：05102413001）
3 AccuPower PCR预混合物（-dye）试剂盒（Bioneer公司，目录号：K-2016）
4 琼脂糖（Bio Basic，目录号：D0012）
5 50x TAE（Biosesang ，目录号：T2002）
6 MEGAscript TM T7转录试剂盒（Invitrogen，目录号：AM1334）
7 甲醛，37％w / w水溶液索恩（Alfa Aesar ，目录号：A16163）
8 10x MOPS（Bioneer ，目录号：C-9031）
9 SYBR TM Green II RNA凝胶染色剂（Invitrogen，目录号：S7564）
10 RiboRuler低范围RNA梯子（Thermo Scientific，目录号：SM1831）
11 QuantiFluor ® RNA系统（Promega，目录号：E3310）
12 1 M Tris-HCl，pH 7.5（Biosesang ，目录号：T2016-7.5）
13 0.5 M EDTA，pH 8（Biosesang ，目录号：E2002）
14 QIAamp病毒RNA迷你试剂盒（Qiagen，目录号：52906）
15 露娜®通用探针一步反应混合物（NEB，目录号：E3006）
16 经DEPC处理的水（Biosesang ，目录号：W2004）
17 WarmStart®比色LAMP 2 x预混液（NEB，目录号：E1800）
18 SYTO TM 9（Invitrogen，目录号：S34854）
19 Bst 3.0 DNA聚合酶（NEB，目录号：M0374，该产品包括等温扩增缓冲液II和硫酸镁溶液。）
20 dNTP混合物，10毫米ea。（酶学，目录号：N002）
21 SuperScript TM IV逆转录酶（Invitrogen，目录号：18090050）
22 水晶紫（Sigma，目录号：C0775）
23 亚硫酸钠（Sigma，目录号：S0505）
24 β-环糊精（西格玛，目录号：C4767）
25 包含SARS-CoV-2包膜基因的pET21a质粒（仿生学，定制）
26 T7启动子引物（5 ' -AATACGACT CACTATAG-3 ' ）和T7终止子引物（5 ' -GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3 ' ）（Macrogen ）（表1）
27 变性琼脂糖凝胶（1％，100毫升）（请参阅食谱）
28 20 μ中号SYTO 9 （见配方）
29 5x LCV解决方案（请参阅食谱）

表1 。用于RT-qPCR和RT-LAMP的引物序列

底漆套装

底漆

顺序（5' - 3'）

注意

E_Sarbeco

前锋

ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT

（Corman et al。，2020）

逆转

ATATTGCAGCAGTACGCACACA

探测

FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ1

Nsp3_1-61

F3

GGAATTTGGTGCCACTTC

B3

CTATTCACTTCAATAGTCTGAACA

FIP

CTTGTTGACCAACAGTTTGTTGACTTCAACCTGAAGAAGAGCAA

BIP

CGGCAGTGAGGACAATCAGACACTGGTGTAAGTTCCATCTC

如果

ATCATCATCTAACCAATCTTCTTC

磅

TCAAACAATTGTTGAGGTTCAACC

Nsp3_2-24

F3

TGCAACTAATAAAGCCACG

B3

CGTCTTTCTGTATGGTAGGATT

FIP

TCTGACTTCAGTACATCAAACGAATAAATACCTGGTGTATACGTTGTC

BIP

GACGCGCAGGGAATGGATAATTCCACTACTTCTTCAGAGACT

如果

TGTTTCAACTGGTTTTGTGCTCCA

磅

TCTTGCCTGCGAAGATCTAAAAC

设备

1 Mupid -One （ADVANCE，目录号：AD160）
2 ChemiDoc TM触摸成像系统（Bio-Rad，目录号：1708370）
3 Quantus TM荧光计（Promega，目录号：E6150）
4 LightCycler ® 96仪器（罗氏，目录号：05815916001）

软件

1 多核苷酸分子量计算器（由Andrew Staroscik开发，http： //scienceprimer.com/nucleotide-molecular-weight-calculator ）
2 LightCycler ® 96的软件（罗氏）

程序

A. Preparatio n个在体外对SARS-CoV的-2转录的RNA标准Ë基因

1.准备PCR产物为模板体外转录：运行与PCR的AccuPower ® PCR预混合物（-dye）试剂盒如制造商的说明。使用含有SARS-CoV-2 Envelope基因的pET21a质粒作为模板，并使用T7启动子引物和T7终止子引物。

2.使用MEGAscript TM T7转录试剂盒按照制造商的说明进行体外转录。

3.通过对一部分甲醛-MOPS变性琼脂糖凝胶电泳进行分析，确认RNA产物。加入包含在MEGAscript TM T7 Transcription Kit中的相同体积的RNA上样缓冲液II，并在65 °C下加热10分钟以进行采样。用1x TAE中的2x SYBR green II进行后染色凝胶，并使用ChemiDoc TM Touch Imaging System获得图像（图2）。

图2 。体外转录的SARS-CoV-2 E基因RNA的琼脂糖凝胶图像。装入两种10倍系列稀释液。梯大小对应于1 ，000，800，600，400，300，和200从向上基点。

4.用Quantus TM荧光计测量RNA浓度。

5.计算RNA拷贝数。

a 获得转录的RNA的分子量（MW）（对应序列：5 ' -GGGGAAUUGUGAGCGGAUAACAAUUCCCCUCUAGAAAUAAUUUUGUUUAACUUUA AGAAGGAGAUAUACAUAUGUACUCAUUCGUUUCGGAAGAGACAGGUACGUUAAUAGUUAAUAGCGUACUUCUUUUUCUUGCUUUCGUGGUAUUCUUGCUAGUUACACUAGCCAUCCUUACUGCGCUUCGAUUGUGUGCGUACUGCUGCAAUAUUGUUAACGUGAGUCUUGUAAAACCUUCUUUUUACGUUUACUCUCGUGUUAAAAAUCUGAAUUCUUCUAGAGUUCCUGAUCUUCUGGUCUAACUCGAGCACCACCACCACCACCACUGAGAUCCGGCUGCUAACAAAGCCCGAAAGGAAGCUGAGUUGGCUGCUGCCACCGCUGAGCAAUAACUAGC-3 ' ），使用多核苷酸分子量计算器，或使用下面的公式，其中“#N”表示每个核苷酸的数目。

b 使用以下公式计算份数：

6.制作10重S在TE erial稀释缓冲液作为RT-qPCR的标准。

B.使用E基因制备病毒RNA并进行滴定

1.按照制造商的说明，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit从无碎片培养基中提取病毒RNA 。

等分病毒RNA提取物并储存在-80 ℃下直至使用。

2.通过RT-qPCR滴定培养的病毒RNA拷贝数
a 制备引物混合物为：对于100 μ升，混合10 μ升正向和反向引物的5 μ升探针，75 μ升DEPC处理过的水的。每个引物/探针的原液浓度为100μM 。引物的名称和序列在表1中列出。可以分批制备引物混合物，并储存在-20 °C下以备后用。

b 制备主混合物除模板如下：7.5 μ升露娜®通用探针一步反应混合物，0.75 μ升露娜® WARMSTART ® RT酶混合物，0.6 μ升引物混合物，和4.15 μ升DEPC处理过的水的每反应。

c 等分试样13 μ升主混合物到PCR管或板的每个孔中。

d 添加2 μ升模板的（病毒RNA稀释液，在体外转录的RNA标准或无模板对照）至e ACH良好。关闭PCR管的盖子或板上的覆盖膜。

e 运行PCR反应如下温度和时间设定：10分钟在55 ℃下，在95分钟1 ℃下，在95 45个循环的10秒℃，在60和30秒℃。

f 可以通过将阈值循环值（Ct）替换为以下形式的标准曲线方程来计算病毒RNA的拷贝数：

可以使用每个软件和实时PCR仪器来完成标准曲线的生成和样品拷贝数的计算。

C. RT-LAMP反应

1.模板病毒RNA可以从培养的病毒或COVID-19患者的生物标本中制备。选择合适的RNA提取方法取决于表演者。

2.准备10X LAMP引物混合物为：对于100 μ升，混合16 μ升FIP / BIP的，2 μ升的F3 / B3引物，4 μ升的LF / LB引物和56 μ升DEPC处理过的水的。的每个引物的库存浓度为100 μ中号。引物的序列在表1中列出。LAMP引物混合物可以分批制备，并保存在-20 °C中以备后用。

3.准备RT-LAMP反应混合物。除模板外，母料可以分批制备。

a 对于LCV方法，反应成分，原料浓度和使用体积如表2所示。

b 当使用WARMSTART ®比色法LAMP 2X预混，如下制备反应混合物：2 μ升模板，1.5 μ升的10倍LAMP引物混合物，0.3 μ升20的μ中号SYTO9，7.5 μ升LAMP混合物，和3.7 μ l经DEPC处理的水。

表2 。带有指定LAMP引物组的RT-LAMP的成分和体积（μl ）

零件

Nsp3_1-61

Nsp3_2-24

模板

2

2

10x LAMP底漆混合物

1.5

1.5

10x等温扩增缓冲液II

1.5

1.5

MgSO 4 （100毫米）

0.6

0.9

dNTPs（每个10 mM）

1.5

2.1

5倍LCV解决方案

3

3

SYTO 9（20 μ中号）

0.3

0.3

BST 3.0 （8 U / μ升）

0.75

0.75

的SuperScript IV（200 U / μ升）

0.1

0.1

经DEPC处理的水

3.75

2.85

4. Aliquo吨13 μ升反应混合物和2 μ升模板的向每个孔PCR管或板和关闭盖或覆盖薄膜的。

5.运行等温扩增。下面的示例设置对于的LightCycler ® 96仪器SYTO 9为荧光染料。

a 选择SYBR Green I并将“积分时间”设置为1 s。

b 对于Nsp3_1-61引物组，在65 °C下将循环条件设置为59 s；对于Nsp3_2-24引物组，在69 °C下设置循环条件。使用65 ℃下用反应WARMSTART ®比色法LAMP 2 X主混合物。每个循环设置59 s的保温时间和1 s的数据采集时间，以使每个循环的实际保温时间为1分钟。将循环数设置为所需的孵育时间（以分钟为单位）（图3）。

图3 。使用引物Nsp3_1-61例如设置的LightCycler ® 96的软件

数据分析

1 可以通过LightCycler 96软件或其他qPCR机器附带的程序观察LAMP反应的实时扩增。对于具有阳性结果的样品，显示了S形曲线，而对于阴性样品或阴性结果的样品，没有显示出S曲线。可以观察到非特异性扩增曲线，其中阈值时间和/或熔解温度升高明显延迟（图4）。
2 对于使用WarmStart比色LAMP 2 x预混液的测试，结果为阳性的样品显示为黄色，而结果为阴性的样品显示为粉红色。对于采用LCV方法的测试，结果为阳性的样品从浅蓝色透明色显示为蓝色（图5）。

图4 。使用在LightCycler 96系统上使用Nsp3_1-61引物设置的RT-LAMP的扩增曲线。显示了具有指定RNA拷贝的一个重复样品的代表性扩增曲线。NTC，无模板控件。

图5 。RT-LAMP的LCV方法的颜色变化。RT-LAMP阳性扩增，LCV颜色变为蓝色。RT-LAMP反应在69 °C下进行60分钟，使用主要方案中描述的一半数量的SuperScript IV逆转录酶，因为结果来自反应优化过程中的实验。NTC，无模板控件。

笔记

1.在这里，我们靶向E基因进行RT-qPCR滴定，而LAMP引物靶向Nps3 。因此，滴定的RNA拷贝数与LAMP目标拷贝数不完全匹配。

2.应在通风橱中制备用于RNA电泳的变性琼脂糖凝胶，因为带有甲醛的蒸气有毒。同样最好在通风橱中进行电泳。

3.体外转录通常可产生微克RNA产物。

4.对于RT-qPCR标准品，通常建议使用连续稀释5至10倍的7个以上点。我们每个反应使用10 8至10 0份，没有模板对照（NTC）用于标准曲线生成。每次稀释一式三份就足够了。

5.虽然我们大约10获得7个拷贝/ μ升从培养的病毒浓度，该数目可以通过潜伏期和病毒种不同。未感染的细胞可作为病毒感染的阴性对照，但衍生的RNA不一定包含在RT-qPCR中，因为没有模板对照可作为RT-qPCR的阴性对照。

6.当为一批实验批量准备用于RT-qPCR和LAMP / RT-LAMP的预混液时，请增加额外的体积以防止由于移液管错误或其他原因而导致预混液不足。15 μ升反应在这个协议中所描述的，0.5到1个额外量为<用于多个反应20个反应或约10％的额外量通常是足够的。

7.用于RT-qPCR的和实时RT-LAMP法，其他qPCR仪器比的LightCycler ® 96软件可以被使用。对于实时RT-LAMP，应考虑测量荧光所需的时间，以设置孵育时间和循环方案以及Ct和阈值时间之间的计算。例如，Bio-Rad CFX系统需要相当不可预测的数据采集时间，因为系统的检测单元逐一扫描每个孔。

8.由于非特异性扩增可与它们的解链曲线区分开，因此可在RT-LAMP反应中添加一个解链步骤。对于聚合酶灭活，建议在扩增和融解步骤之间在95 °C的温度下再加5分钟。

9.使用LCV方法进行比色检测时，颜色会随温度而变化。在高温下，没有核酸扩增，反应混合物的颜色可能会变成蓝色。（18混合物的颜色将恢复正常室温- 25 ℃下5分钟内）。

10. LAMP的敏感性由于“哑铃中间体”的形成而成为瓶颈，通常低于PCR的敏感性。但是，由于LAMP的产量高且没有应用瓶颈，因此LAMP极易受到交叉污染的影响。因此，我们强烈不建议在LAMP反应后打开反应管。否则，使用分开的反应产物的分析空间（例如，琼脂糖凝胶电泳）的建议。

11.典型的LAMP优化包括改变dNTPs或Mg 2+的浓度。我们建议组合测试每种浓度，因为dNTP可以螯合Mg 2+ 。

12.由于TE缓冲液中的EDTA螯合Mg 2+离子，因此在测试更大体积的模板时，使用DEPC处理的水进行RNA洗脱和稀释可能是有益的。

菜谱

1 变性琼脂糖凝胶（1％，100毫升）
1克琼脂糖

10毫升10倍MOPS

18毫升37％甲醛

72毫升DEPC处理过的水

2 20 μ中号SYTO 9
将5 mM SYTO 9原始原液溶于经1/250稀释的DEPC处理过的水中。等分试样的体积小（约100 μ升），并储存在-20 ℃下

3 5倍LCV解决方案
10.20 mg结晶紫

378.12毫克亚硫酸钠

283.75毫克β-环糊精

溶于50毫升DEPC处理过的水中

致谢

作者感谢韩国疾病预防控制中心（KCDC）善意并迅速分享了SARS-CoV-2分离株。这项工作得到了科学与信息通信技术部（National Science Council of Science and Technology）授予的国家科学技术委员会（NST）的资助（批准号CRC-16-01-KRICT）。提供的协议来自我们先前发表的原始文章（Park等，2020）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献
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