材料和试剂

1. SilicaGel橙色指示器2-4毫米（Bolaseca，目录号：8.1.002）

2. 实验室薄纸，例如。，Wipe Paper Plus（托克，目录号：130050）

3. C57BL / 6J背景小鼠（杰克逊实验室，目录号：000664）

注意：可以使用其他实验室小鼠品系。请参阅P rocedure部分。

4. 乙醇70％，例如。，用于分析的绝对乙醇（PanReac AppliChem，目录号：A1613）

设备

1. 体积描记器，不受约束的全身（直径90毫米），用于鼠标（EMMS，目录号：PLY310）

2. 肺流量传感器（EMMS，目录号：TPF100）

3. 自适应放大器，应变计类型；单通道（EMMS，目录号：AMP110）

4. 大容量干燥柱（0.5 kg表示二氧化硅干燥剂，适合再生），配有管子和配件，包括1ml锁注射器连接到塑料管（EMMS，目录号：ADR101）

5. 2通道偏置流量发生器（EMMS，目录号：AIR140）

6. 采集单元（笔记本电脑）

软件

1。 USB数据采集（eDacq）单对象版本1.9.0（Site）仅具有流派生参数分析器（EMMS，目录号：ESS101A）的版本

注意：英国Bordon的EMMS公司（电子医疗测量系统），www.electromedsys.com（设备和eDacq软件）。

2. Microsoft Office Excel 2016或兼容

3. 统计软件（例如，的GraphPad Prism 6.0）

程序

几个参数可能会严重影响WBP的结果和可重复性。因此，可以在实验设计中考虑它们。这些包括一天中的时间（考虑小鼠昼夜节律周期），记录过程中的小鼠行为以及习惯化时期的标准化（Quindry 等人，2016; Receno 等人，2019）。根据具体的研究问题，可以评估菌株在肺生理方面的特异性差异（Cramer 等人，2015 ；Bates，2017）。重要的是，考虑到每个小鼠品系的基础/对照呼吸活动，可以对以下部分中描述的参数进行调整和验证。

此外，在整个过程中必须保持环境条件恒定。在这里，我们将温度保持在22 °C和55％的相对湿度（按照国家研究委员会，《动物护理和使用指南》的建议，2011年）。

硒拟合了设备
在计算机上安装USB数据采集（eDacq）。
通过USB连接器将自适应放大器连接到采集单元。
将肺流量传感器从自适应放大器连接到传感器入口（图1D）。
将肺流量传感器连接到容积描记仪上（图1A）。
将偏置流量发生器的流量1和流量2级别设置为1cc / min（图1C）。
将Bias Flo w发生器的端口1 与大容量干燥塔的入口1 和端口2连接到容积描记器室的顶部输入。然后，将干燥塔的入口2连接到容积描记器设备的下部输入（图1A和1C）。
注意：硅胶珠必须保持脱水状态，水合时（颜色指示器从橙色变为绿色，图1C），有必要更换或通过在150 °C 下干燥24小时使其重新活化。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902988--1504 Albert Quintana 819865 \ Figs jpg \ Figure1.jpg

图1 。容积描记仪设备。A.容积描记器室。1：Ť 运算输入（进入气流），2：肺流量传感器，3：大号奥尔输入（空气出口），4：甲lternative降低输入）。B.容积描记器通过另一下部输入（4）连接到1 ml Lock注射器。C.偏流发生器和含有硅胶珠的干燥柱。5：端口1（流量1），6：入口1、7：端口2（流量2，进气），8：入口2（抽气）。D.自适应放大器通过换能器入口（9）连接到腔室。新鲜空气通过端口2连续注入腔室，并通过下部入口（3）从腔室释放。然后，空气通过干燥塔，并从偏流发生器中抽出（需要除湿以保持偏流发生器）。

设置搜索克向上吨他协议（小号EE V 记意1）
启动eDacq程序。
从左侧面板中选择协议。将会弹出一个新窗口。
单击站点1 选项，然后单击编辑。
添加和编辑所需协议的不同步骤：
在所有站点上记录
等待用户前进
暂停00:03:00（时间离开工作区/房间）
记录控制时间为00:45:00（适应时间）
录制时间为00:15:00（录制时间）
记录所有站点
从左侧面板中选择站点1。添加以下流派生参数（FDP）属性以进行记录：
在“ 常规” 选项卡上：在“ 输入” 组中选择20 ms的平滑时间，在“ 输出” 组中选择5 s的基于时间的时间。
在“ 呼吸分析” 选项卡上：在“ 呼吸检测” 组中，输入0 。行阈值为5 ml / s，呼吸外推开始为20％TV。在“ 呼吸抑制” 组中，不要选择“ 启用呼吸抑制” 。
在“ 过滤”选项卡上：不要选择“ 启用-通过滤波器” 和“ 启用市电滤波器” 。
应用所有更改。
保存配置。
注意：实验参数（从S tep s B 4到B 5）可以根据生物学问题，实验设计和小鼠p型型进行调整。请检查制造商的建议。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902988--1504 Albert Quintana 819865 \ video1.jpg

视频1. 设置协议

室calibrat 离子（小号EE视频2）
开始校准前15 分钟，打开偏置流量发生器和自适应放大器（待机状态下，指示灯会闪烁）。
紧密关闭体积描记器室。
启动eDacq程序。
介绍分配的密码（选择确定）。
介绍研究名称（按关闭）。
关闭出现的配置文件版本窗口。
接受校准选项（始终建议）。
激活DC模式以进行校准（记录期间会自动设置AC模式）。
将高流量值设置为-10 ml / s。
按F8 （零按钮）调整基础参数。
按F9 （低）调整低校准音量。
将1毫升锁定注射器连接到容积描记室的另一下部旋塞输入（图1 AB）。
轻轻注射1 ml的风量中，使用所连接的注射器和腔室1.5 压榨后小号F11 （记录容量）以调节高校准体积。适当的校准范围应介于- 和35 35 毫升/秒（否则重复该过程）。
取下注射器，然后放回盖子。
单击完成按钮，然后继续呼吸离子记录。
自适应放大器机器应准备就绪，白灯闪烁。
ñ Ø TES：

每次打开设备时都必须执行校准。无需在同一天在每只动物/试验之间进行校准。也可以随时通过工具栏的U 选项启动校准。
高流量值必须是注入校准体积（步骤13）的十倍，作为FDP分析的校正因子。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902988--1504 Albert Quintana 819865 \ video2.jpg

视频2. 系统校准

呼吸记录（s 录像3）
录制之前，请权衡一下鼠标。
打开体积描记器，将动物放入其中。
注意：操作腔室设备时，请勿打扰换能器，这一点至关重要。振动会影响校准。如果发生这种情况，请重新校准系统。避免将设备安装在不稳定的表面或靠近人流密集的地方。

密闭室并确保动物自由移动。
选择协议选项，然后选择站点1 （将打开预配置的协议）。
重新启动协议。
介绍鼠标识别，体重和其他任何感兴趣的注释。评估完此步骤后，将开始记录（屏幕上可能会出现绿色的闪烁窗口）。
将协议提前到等待时间（3分钟）。在此期间之后，协议将自动进行以下步骤。
注意：在此间隔内，我们建议用户在不打扰设备的情况下离开工作区/房间，以免干扰分析。但是，在整个会话过程中，必须通过视觉资源或从房间外部监视鼠标，以记录运动时间以及任何其他行为。

记录后，将动物放回笼子。用70％乙醇清洁并擦拭设备。记录将自动保存在分配的项目文件夹中。
通过重新启动按钮记录下一个动物（从开始小号TEP D1 ）或前进到数据分析。
关闭所有的t 他的设备。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902988--1504阿尔伯特·金塔纳819865 \ video3.jpg

视频3. 记录全身体积描记

数据分析

eDacq软件会实时显示来自换能器的波形。最后将数据记录到磁盘文件中，以进行实验后回放和分析。至关重要的是，要避免在录制过程中产生背景噪音，尤其是避免鼠标运动引起的背景噪音，至关重要的是要留出足够的习惯时间。因此，虽然记录了动物的呼吸模式1小时，但仅分析了最后15分钟的数据。重要的是，由于未应用呼吸抑制参数，因此有必要确保数据对应于休息时间（图2）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902988--1504 Albert Quintana 819865 \ Figs jpg \ figure2--word.jpg

图2 。从eDacq导出到E xcel的原始数据的示例。实验组（雄性，33天，13.5 g）静息小鼠的潮气量和呼吸频率值以蓝色显示。根据深蓝色显示的周期值，通过动物体重和呼吸频率校正潮气量。

将数据导出到E xcel文件
1. 用空白工作簿启动Excel。

2. 在“ 数据” 选项卡上的“ 获取外部数据” 组中，单击“ 来自文本” 。

3. 浏览您的* .csv文件（eDacq生成两个文件，选择不带句点的文件），然后单击导入。

4. 将会出现文本导入向导。

选择分隔选项。
选择逗号作为定界符。
我n中的列数据格式部分，选择常规，然后单击完成。
5. 数据将出现在工作簿中，在第一行中具有列标题。

6. 通过鼠标的重量（g）校正潮气量值（ml）。

7. 平均休止呼吸数据（最终15分钟值，在导出的Excel文件中命名为Period），以计算潮气量（μl/ g）和呼吸频率（呼吸/分钟）（图2）。

8. 根据您的实验条件进行适当的统计检验。

9. 一次导出在由eDacq软件获得的值ê Xcel公司文件报告我Ñ Ť 能够1 ：

表1. eDacq软件获得的呼吸值

名称

单位

描述

t

时间

当前系统时间

记录

时间

记录时间（用于重播数据）

相对

时间

从实验开始的相对时间

释放我们

我们（micro-s）

相对输出精度更高

小号

s

从实验开始算起的秒数

ñ

计数

输出中包含的呼吸次数

nRej

计数

呼吸次数被拒绝

期

本期名称

用户

当前用户名

电视

毫升

潮气量，一口气吸气的量

I

s

启发时间

E

s

到期时间

聚酰亚胺

毫升/秒

吸气峰流量

聚乙二醇

毫升/秒

呼气峰流量

F

呼吸/分钟

呼吸频率

MV

毫升

分钟音量，一分钟内获得灵感

R

s

休息时间，

影音

毫升

累计量

企业信息平台

s

结束吸气暂停

脑电图

s

结束呼气暂停

h

（没有）

暂停增强

沃尔

％

吸气量/呼气量之间的差异

（可选）代表呼吸记录
启动eDacq程序。
从工具栏中选择实验选项。
按数据源。
从可用选项中选择“ 记录的数据文件”选项。
选择感兴趣的文件。
使用工具栏播放录音（“ 播放” 按钮）。
在要表示的帧时暂停（“ 暂停” 按钮）。
用鼠标右键单击站点1 窗口记录。
选择属性并自由更改它们。
将文件另存为.jpg，从鼠标右键菜单中选择Save Chart （图3）。
注意：当您准备开始新的动物记录时，请记住设置实时数据源。记录的数据文件源仅用于分析以前的实验。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902988--1504 Albert Quintana 819865 \ Figs jpg \ Figure3.jpg

图3. 健康的休息动物（上图：雄性，62天，27 g）和表现出呼吸变化的静止实验小鼠中的代表性呼吸波形（下图：雄性，63天，12 g）。这些波形未按重量归一化。

致谢

这项工作得到了多个博士前研究金（BES-2015-073041; PPD，2018FI_B 00452; AU，PRE2018-083179; LSB）和Ramóny Cajal研究金（RyC-2012-11873; AQ）的支持。AQ。收到了西雅图儿童研究所和西北线粒体协会的资金，并获得了欧洲研究委员会的资助（启动资金NEUROMITO，ERC-2014-StG-638106），MINECO Proyectos I + D de Excelencia（SAF2014-57981P），MINECO Proyectos I + D“ RetosInvestigación”（SAF2017-88108-R）和AGAUR（2017SGR-323）。该协议最初由Bolea 等人在我们先前的研究中使用。，2019。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

伦理

原始实验数据（Bolea et al。，2019）是根据《实验动物的护理和使用指南》中的建议收集的，并得到西雅图儿童研究所的动物护理和使用委员会和UniversitatAutònomade巴塞罗那（协议P10127 / CEEAH UAB 4155，有效期至10-2023年）。

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