材料和试剂

乳胶手套
2 ml微量离心管（Dominique DUTSCHER，目录号：033297）
1升塑料锅
50 ml猎鹰管（Sigma，目录号：CLS430828）
500毫升洗瓶
板96孔（VWR，目录号：735-0083）
10，20，200，和1000 微升提示仪（Eppendorf，目录号：2231300008）
纸巾
培养皿
接种环
记号笔
P arafilm
肥料（尿素和NPK 15-15-15制成珠状和颗粒状）
端头（无针）注射器
消毒田土壤
品牌® UV比色皿的宏，室体积2.5-4.5毫升（西格玛，目录号：Z637157）
冰箱
植物材料：水稻种子，包括对照种质（敏感性，部分抗性和高度抗性）
泛菌属菌株
盐酸（HCl）
醇
消毒超纯水
蛋白ept （EuroMedex ，目录号：P3300）
牛肉提取物（默克公司（CAS ）68990-09-0）
蔗糖（Merck，CAS号：57-50-1）
葡萄糖（Sigma，CAS号50-99-7）
酵母提取物（默克，CAS号8013-01-2）
胰蛋白（（Merck，CAS号91079-40-2）
谷氨酸（Merck，CAS号56-86-0）
蛋白ept蔗糖琼脂（PSA板）（请参阅食谱）
10 N HCl （请参阅食谱）
70％乙醇（请参阅食谱）
接种物（请参阅食谱）

设备

镊子
高压灭菌机
Nethouse ，Greenho 使用/筛选室/生长室
研钵和杵
MilliQ 无菌超纯水系统
层流柜
10、20、200 和1,000μl 移液器
-20 °C 或深冰柜
28°C培养箱
分光光度计
涡旋机
pH计
微量离心机
精密天平

程序

水稻植物生长条件
在以下条件下，在半控制环境的温室/屏蔽室/生长室中种植水稻：光照约12小时，25±5°C（白天）和20±5°C（夜晚）以及相对湿度75％。
注意：使用以下推荐的水稻品种作为检查对象：C101A51，Azucena，Sahel 108，Moroberekan 。

在装有高压灭菌（121°C，20分钟）的田间土壤或经过预处理的盆栽堆肥的20厘米直径的盆中打3个孔。
每孔播种3个表面消毒过的种子，每盆使用3个孔，每盆3盆（大米27个种子/品种/重复）。
播种后约30-35天，如下所述接种植物。
接种后应施用尿素（推荐的水稻品种推荐量）以达到最佳植物生长。

接种物制备和植物inoculat 离子（见V IDEO 1 ）
将细菌菌株在新鲜制备的PSA琼脂平板上保存在-20 °C 或-80 °C冰箱中，然后在28°C下孵育1-3天。使用被诊断为泛菌属的菌株。作为控制。
然后，从板上刮下细胞并将其悬浮在MilliQ 无菌超纯水中。
使用分光光度计将该悬浮液的浓度调整为10 8个细胞/ ml（OD = 600 nm）。
然后，当植物处于4-5周龄时，使用无针注射器将接种物泵入，并使用无针注射器将1至2 ml的细菌悬浮液接种物浸入3-6片最年轻的完全展开的叶子中。在叶尖下方约3-5 cm处渗入叶片（图2）。
按下叶表面上的注射器嘴，在叶的下面进行渗透。
注意：戴手套的手指应轻轻阻挡并支撑叶子的另一侧，并轻轻按下柱塞。注意不要压碎叶子。另外，请确保不要重叠中肋，因为这会升高注射器并破坏必要的密封。

然后，用消毒的纸巾轻轻擦拭叶片表面，以除去叶片表面上多余的液体。
最后，短暂地将叶子放在光线下以确认渗透成功，因为这些渗透的斑点将显示出浸水的特征。使用无菌蒸馏水作为阴性对照。

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视频1. 蛋白ept蔗糖琼脂（PSA平板）的制备，细菌的平板接种和接种，接种物的制备以及水稻的接种

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图2 。播种后4-5周龄的水稻植株刚刚接种（注意接种的叶片弯曲）

症状进展
接种后，每天监测症状发展。

注意：在易感反应中，接种（DAI ）后4-5 天，叶片的过滤点会出现明显的水浸现象，而抗性反应则弱得多。大约8 DAI时，在接种部位产生的坏死性病变将沿着主静脉向叶的尖端纵向增加。这些病变随后扩展并从稻草黄色变成浅棕色，并最终在15至21 DAI时发展为典型的枯萎病症状（图3 ）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1903036--1490 Drissa Silue 848974 \ Figs jpg \图3.jpg

图3. 使用我们开发的标度，在播种后第35天接种的水稻植株上的泛病疫病症状进展评分。A = 2-4 DAI ：在接种点浸泡水。B = 5-7 DAI：接种点处的黄色坏死病灶在两个方向（长度在宽度上）扩散。C = 10-12 DAI ：接种点处的黄色坏死性病变沿主静脉向叶尖逐渐增加。D = 14-17 DAI ：在0.5至1 cm处，叶尖上升不对称黄色坏死。E = 21-23 DAI ：三个叶子区域出现症状，i ）灰色坏死区域（在叶子尖端）；ii ）绿色区域，iii ）淡黄色区域（将区域i 与区域ii 分开）。区域ii可以发展，区域i 和ii可以部分合并。F = 28-30 DAI ：从叶尖到接种点扩散的总灰色坏死叶面积。

症状评分
致病性评估如下：根据以下症状严重程度等级，在14和21 DAI记录疾病严重程度（图4）：

水-S oaking在接种点。
接种点的黄色坏死病灶沿两个方向（长和宽）扩散。
接种点的黄色坏死病灶沿主静脉向叶的尖端逐渐增加。
叶尖上升0.5 至1厘米的不对称黄色坏死。
在三个叶片区域上出现症状，即：i ）灰色坏死区域（叶片末端）；ii ）绿色区域，iii ）黄色区域（将区域i 与区域ii 分开）。绿地可以发展并与坏死区域部分融合。
从叶尖到接种点看到的总灰色坏死叶面积。
总坏死灰白色/棕色叶片卷曲。
然后将种质的抗性分类如下：

耐（R）
中等耐性（MR）
中度易感（MS）
易感（S）
来自纯品系的植物的抗性/敏感性表型与混合种子的抗性/敏感性表型大致相同。在所有情况下，为每个登录选择最具代表性的响应。

分离株的致病性分为非致病性，中度致病性和完全致病性。至于它们的毒力，当它们仅诱导R和MR致病性表型时被分类为无毒力，而当它们诱导MS和S 时则被分类为有毒力。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1903036--1490 Drissa Silue 848974 \ Figs jpg \图4.jpg

图4.开发的量表，用于对症状严重程度进行评分

细菌种群评估
在第7、14和21天DAI时，细菌种群可根据从接种叶片中回收的菌落形成单位（cfu ）进行评估。在实践中，在接种点上下2 cm处切成1 cm 2的叶片，并制作两个相应的样品。地在蒸馏水中的无菌水（1米这些条升使用无菌研钵和杵或自动球磨机每叶片）。作10倍所得到的叶液汁及板一式三份对PSA或稀释泛菌属属特异性琼脂（PGSA）所描述基尼等。（2019）。计数每个稀释液在三个平板上的菌落，并将数据转换为每片叶子的cfu 。最后，对收集的数据执行方差分析（ANOVA）并计算相关函数。

笔记

其他培养基也适合于培养泛菌属。包括营养肉汤或NB（每升：牛肉提取物3克；蛋白ept 5克；蔗糖10克），葡萄糖酵母提取物或GYE（每升：葡萄糖20克；酵母提取物10克）和胰蛋白tone蔗糖或TS（每升：胰蛋白，10克；蔗糖10克；谷氨酸1克）。每种培养基的固化通过补充15 g琼脂/ L来实现。
为了避免污染并确保细菌菌株的纯度，可以使用PGSA培养基选择和纯化细菌菌株。
属泛由约27种。接种前，请确保所用菌株的种类已知。为此，多重PCR（基尼等人，2018）方案，因此可以使用d 。
某些泛菌属。是一些国家的检疫性有害生物（Health 等，2018）。因此，此类物种的操作可能会受到生物安全措施的限制。始终按照您所在国家/地区的法规操作细菌。
抗性或敏感性取决于水稻植物与泛菌属之间的特异性相互作用。抗性或易感控制品的选择也可能取决于泛菌的种类和种族。以及要执行的实验目标。
不同阶段的植物可以用于不同的目的，例如测量受发育调节的植物抗病性。
为了使注射器中的接种物最容易渗透到叶片中，请将水稻植株保持在高湿度下，并在光照周期开始时进行接种，因为这样可以保持气孔开放。

菜谱

蛋白胨琼脂蔗糖（PSA板S）（见V IDEO 1 ）
在1升MilliQ 水中，加入10克蛋白ept，10克蔗糖，16克琼脂和1克谷氨酸
使用1 M KOH和NaOH缓冲液将pH调节至7.1±0.2
在121°C下高压灭菌20分钟
让培养基冷却但不固化，然后将其倒入培养皿中
10 ÑHC 升
为了制备1 ，000毫升-10 M HC的升，进行如下：

差83毫升d”的HCl 在试管
注入1000毫升水
70％乙醇
使用实验室提供的Gay-Lussac稀释表和96°etha nol：

差40.85毫升此乙醇中倒入一个试管
用蒸馏水消毒至100 ml
接种物
在50毫升收集细菌菌落˚F 一升含有45毫升CON管的MilliQ 水
然后，混合和取2毫升的接种物在品牌® UV比色皿的宏，腔室容积2.5-4.5毫升并在分光光度计中引入它在OD，并采取读数600
然后，通过在MilliQ 无菌水中稀释来调整接种物
对于每种稀释液，确保浓度为10 8 CFU / ml
致谢

该协议是根据以前在不同实验室（Yang和Bogdanove ，2013）中用于水稻白叶枯病和细菌叶片条纹的接种和毒力测定的程序开发的。博士科西· 基尼来自法国的研究可持续发展研究所（IRD）在程序中受益的博士奖学金“分配德RECHERCHE倒UNE 这些AU南基”（ARTS），由国际科学基金会（IFS）和财政支持的赠款由日本外务省和全球稻米科学合作伙伴（GRiSP ）通过AfricaRice获得。所有这些机构都深表感谢。

利益争夺

作者没有竞争利益。

参考文献

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