材料和试剂

标准

1.5 ml塑料反应管（例如，Eppendo rf，目录号：0030125150）
铝箔
细胞罩
大小不同的锥形烧瓶
缓冲瓶
不同尺寸的玻璃烧杯
油浴用耐热玻璃盆
带吸头的不同大小的移液器
大小不同的Schlenk烧瓶
细尖镊金属，例如，＃4，＃7（西格玛，目录号：T6165）
冰
超纯去离子水max。抵抗力18 。2M的Ω·cm的，例如，的MilliQ纯化
惰性气体（氩气）
氮气
Schlenk生产线（Schlenk烧瓶具有大开口，Schlenk烧瓶的盖子，真空和氮气的连接管）
d eionised（DI）水

消耗品

20 x 20 mm盖玻片＃1（Carl Roth，目录号：H873.2）
DWK生命科学DURAN TM 过滤程序（第3号）（费希尔小号系统求解，目录号：09-841-090）
GE Healthcare公司的illustra TM ，NAP-5柱（费舍尔小号系统求解，目录号：10054394）
玻璃盖玻片架（自制）
Kimwipe纸巾（Kimberly-Clark Worldwide，目录号：05517）
分子筛3Å（Carl Roth，目录号：8487）
巴斯德移液器ISO 7712（230 mm）（Karl Hecht，目录号：40567002）
培养皿，PS，35/10 mm，带通风孔（Greiner Bio-One，目录号：627102）
无菌无菌CME旋转式注射器过滤器（Carl Roth，目录号：P818.1）
硅腔（Ibidi GmbH，目录号：80841）
铁氟龙盖玻片架（家用，可商购，例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：C14784）
硅酮胶，Twinsil 22，加成固化的双硅酮（P icodent GmbH，目录号：13001000）
油浴用硅油（Sigma-Aldrich，目录号：85409）

化学制品

金纳米球，9 nm（nanoComposix ，自定义尺寸，9±2 nm，单宁酸中0.05 mg ml -1 ）
（+）-L-抗坏血酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：A7631）
3-（三乙氧基甲硅烷）propylisocyanate （Sigma-Aldrich公司，目录号：413364）
醋酸乙酯（Carl Roth，目录号：6784）
乙腈（用于HPLC的CHROMASOLV）（Honeywell International，目录号：60-002-31）
氨基胍盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：A8835）
ɑ-硅烷-ω-炔PEG，（CH 3 O）3-Si-PEG（3000）-C≡CH（Rapp Polymere ，目录号：133000-70-71）
ɑ-硅烷-ω-叠氮基PEG，（CH 3 O）3-Si-PEG（3000）-N3（Rapp Polymere ，目录号：133000-5-71）
硫酸铜（Sigma-Aldrich，目录号：C1297）
乙醚（Sigma-Aldrich，目录号：309966）
二甲基亚砜（用于光谱）（DMSO）（默克（Merck），目录号：102950）
cRGD-炔烃（Biotrend Chemicals，定制合成：Cyclo （Arg - Gly -Asp-D- Phe - Pra ））
30％过氧化氢（默克（Merck），货号：107209）
LA- PEG（3400）-NH 2 （Biochempeg Scientific，目录号：HE039005-3.4K）
甲醇（卡尔·罗斯，目录号：0082）
N，N-二甲基甲酰胺（无水，99.8％）（DMF）（Sigma-Aldrich，目录号：227056）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
氢氧化钾（用于清洗浴）（Sigma-Aldrich，目录号：P5958）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
QSY21（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：Q20131）
硅烷-PEG- 甲氧基，Sil-PEG（2000）-m（Biochempeg Scientific，目录号：MF001020-2K）
碳酸钠（Na 2 CO 3 ）（卡尔·罗斯，目录号：A135）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：255793）
StarRed-NHS（Abberior）（Abberior，目录号：1-0101-011-3）
硫酸96％（VWR CHEMICALS，目录号：1.08131.1000）
甲苯（Merck，产品目录号：108325）
三乙胺（Sigma-Aldrich，目录号：471283）
醋酸三乙铵（TEAA）（Sigma-Aldrich，目录号：69372）
三（3-羟丙基三唑基甲基）胺（THPTA）（Sigma-Aldrich，目录号：762342）
单击反应混合物（CuAAC）（请参阅食谱）
干甲苯（请参阅食谱）
Sil-PEG（3500）-LA（请参阅食谱）

DNA链（由Integrated DNA Technologies，Inc . 定制合成）

注意：š 精灵退火部分下划线，顶链退火点缀，底链退火虚线; 有关文献中使用的发夹及其校准的列表，请参见Zhang等，2014和Liu等。，2016年。

顶部：5 ' -/ 5AmMC6 / CGC ATC TGT GCG GTA TTT CAC -3 '
底部NH 2- 淬火器：
5 ' -/ 5 ThioMC6-D / TTT GCT GGG CTA CGT GGC GCT CTT / 3AmMO / -3 '

发夹4.2 pN ：
5'-/ 5AzideN / GTG AAA TAC CGC ACA GAT GCG TTT- GTA TAA ATG TTT TTT T CA TTT ATA C -TTT AAG AGC GCC ACG TAG CCC AGC AAA / 3ThioMC3-D / -3'

发夹12 pN：
5'- / 5AzideN / GTG AAA TAC CGC ACA GAT GCG TTT- GGG TTA ACA TCT AGA TTC TA T TTT TTT TAG AAT CTA GAT GTT AAC CC -TTT AAG AGC GCC ACG TAG CCC AGC AAA / 3ThioMC3-D / -3 '
发夹19 pN：
5'-/ 5叠氮化物N / GTG AAA TAC CGC ACA GAT GCG TTT- CGC CGC GGG CCG GCG CGC GG T TTT CCG CGC GCC GGC CCG CGG CG -TTT AAG AGC GCC ACG TAG CCC AGC AAA / 3ThioMC3-D / -3 '

标记的DNA链（请参阅食谱）
退火的DNA链（请参阅食谱）

酵素

的StemPro 的Accutase 细胞解离试剂（赛默飞世尔科技，Gibco公司® ，目录号：A1110501）

中

白蛋白组分V（Carl Roth，目录号：8076）
胎牛血清（美国）（Sigma-Aldrich，目录号：F2442）
MEMα（赛默飞世尔科技，Gibco公司® ，目录号：12561）
青霉素-链霉素（10,000单位/毫升）（赛默飞世尔科技，Gibco公司® ，目录号：15140148）
RPMI 1640培养基（赛默飞世尔科技，Gibco公司® ，目录号：11-875）
丙酮酸钠的100mM（100×）（赛默飞世尔科技，Gibco公司® ，目录号：11360070）
显微镜U2OS介质（请参阅食谱）
显微镜下的子孢子滑移介质（见食谱）
PBS缓冲液（请参阅食谱）

细胞系

伯氏疟原虫ANKA菌株（BEI资源（ATCC），目录号：MRA-871）
伯氏疟原虫NK65株，CS-GFP线（可选的使用，S EE 步骤H4）（未商购，从配合的寄生虫机构可请求;进一步的信息可参见纳塔拉詹。等人，2001 ）
U2OS，骨肉瘤细胞（ATCC，目录号：HTB-96）

设备

300°C烤箱
冷冻室（-20°C和-80°C）
冰箱（4°C）
通风柜
离心机（Thermo Fisher Scientific ，型号：Heraeus Biofuge Pico）
离心机（Thermo Fisher Scientific ，型号：Heraeus Multifuge 1S-R;目录号：75004331）
热板配件（IKA ，型号：ETS-D5 ，目录号：0003378000）
HPLC（GE医疗保健小样大号IFE š ciences ，型号：ÄKTA P URE Ç hromatography 小号ystem）
HPLC色谱柱（Phenomenex ，型号：Luna 5u C18（2）-RP-HPLC ，目录号：00G -4252-N0）
Lyophilisator （LABCONCO ，型号：自由区加2.5升级联台式冷冻干燥系统，目录号：7670020）
电磁搅拌器（IKA ，型号：C-MAG HS 7 ，目录号：0003581200）
宽视场，倒置荧光显微镜（应用精密，型号：DeltaVision TM 精英中号icroscope 小号ystem，基于在Olympus IX71体）与自制环境室（购孵化例如，在OKOLAB）
显微镜滤光片组（适用精度，型号：DeltaVision TM Elite滤光片组）
显微镜物镜（奥林巴斯，型号：物镜60x / 1.4 NA PlanApo IX70）
Sonicator（EMAG Technologies ，型号：Emmi-H22 ，目录号：98217-DE）
分光光度计（NanoDrop Technologies ，型号：PEQLAB Nano Drop ND-1000）
热循环仪（Bio-Rad Laboratories ，型号：Bio-Rad T100 ，目录号：1861096）

软件

斐济只是使用ImageJ（版本1.52E; https://fiji.sc/）（Schindelin 。等人，2012）
堆对比度调整，插件斐济（Michálek 等人，200 7 ）
程序

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003095--1477蒂娜·韦根861625 \ Figs jpg \ Fig2.jpg

图2 。实验程序概述。用镊子夹住玻璃盖玻片，将其插入特氟龙固定器（白色）中，然后将其移入装有食人鱼溶液的烧杯中进行清洁（步骤A）。为了使盖玻片钝化，将它们转移到玻璃固定器中，并与Schilk烧瓶中的Sil-PEG钝化溶液在油浴中于80°C孵育。可以将Schlenk烧瓶通过其阀门连接到真空和氮气管线上，以提供惰性反应容器（未显示，过程B）。清洁并干燥盖玻片后，通过在两张盖玻片之间孵育一滴相应溶液来固定特定的配体和金纳米颗粒（红色溶液）。为了再次去除彼此的盖玻片，请用移液器注入另外的水或PBS，并用镊子将上盖玻片提起（步骤s CE）。为了在倒置显微镜下观察表面，将它们用两种成分的硅胶（黄色和蓝色凝胶）粘合到培养皿中，培养皿的中心有一个定制孔（比盖玻片小2毫米）（步骤F）。Ť 他最终器件被示出在最后一个数字，其中介质和细胞可转移到显微镜之前加入。图片下方指示的步骤提供了更多信息。

清洁玻璃表面
在约100毫升新鲜制备的“ Piranha溶液” [ 3：1（v / v ）硫酸：过氧化氢]中，在Teflon固定器中清洁并活化盖玻片1小时。确保盖玻片完全被溶液覆盖（图2，清洁）。搅拌食人鱼溶液，例如，用耐酸的巴斯德吸管。
注意：食人鱼溶液腐蚀性极强，并且会放热反应。不得与有机溶剂接触。在通风良好的通风橱中执行包含食人鱼溶液的每个工作步骤。

注意：从此处开始，仅用镊子处理盖玻片（图2）。

根据您所在机构的安全规定，小心地将其倒入适当的废物容器中，以除去盖玻片上的“食人鱼溶液”，例如，用水稀释10-20倍后将其丢弃。
用去离子水冲洗盖玻片3次，用超纯水冲洗两次。
在〜60瓦（标准超声处理功率）下，在超纯水中超声处理盖玻片一次，持续5分钟。
用镊子小心地保持氮气流中的表面干燥。
检查点：用眼观察，没有条纹或水珠保持否则重复小号TEP 小号A3- 一个4或放弃盖玻片。

玻璃表面钝化
将干燥的盖玻片转移到带有镊子的玻璃支架上，并避免在中心触摸它们。
在Schlenk烧瓶中，在连续的保护性氮气气氛下，按照表1所示制备钝化溶液（取决于所需的表面选项I - III，请参见图1A）（图2，钝化）。涉及有机溶剂的所有步骤（步骤B 2-B7）均应按照贵机构的安全规定在通风橱中进行，并保持通风。通过将Schlenk烧瓶连接到真空管线和氮气源来营造保护气氛。首先抽空烧瓶，然后用氮气冲洗并在随后减少氮气流，以添加粉末状PEG，干燥的甲苯和三乙胺。

表1. 三种不同类型表面的钝化成分（选项I -III）。当要测试细胞对特定配体的粘附力时，应选择选项I；选择II来获取此类特定配体的作用力；应选择配体对表面的特异性粘附力时，应选择选项III配体。

试剂

选择。我–

配体表面（请参阅步骤C）[绝对值。（摩尔比）]

选择。II –

发夹式力传感器（请参阅步骤D）[绝对值。（摩尔比）]

选择。III –

配体表面上的发夹力传感器（请参见步骤E）[abs。（摩尔比）]

Sil-PEG（2000）-米

6毫克（95％）

Sil-PEG（3000）-叠氮化物

6毫克（100％）

6毫克（95％）

Sil-PEG（3000）-炔

或6毫克（100％）

或6毫克（95％）

Sil-PEG（3500）-LA

0.35毫克（5％）

0.35毫克（5％）

干甲苯

20毫升

20毫升

20毫升

三乙胺

一滴（〜100 微升）

一滴（〜100 微升）

一滴（〜100 微升）

在保护气氛下，将盖玻片加入溶液中的Schlenk烧瓶中，然后关闭盖和气体供应。现在将反应保持在保护气氛下。
在78热管过夜- 80℃的油浴中。可以结合在磁力搅拌器上注满油的耐热玻璃桶来设置油浴。附加的恒温器可保持温度恒定。
在玻璃固定器中用乙酸乙酯超声处理5分钟，以钝化盖玻片。
在玻璃固定器中，用甲醇超声清洗钝化的盖玻片，再清洗5分钟。
暂停点：如果钝化玻璃表面不立即使用，则最多可以在甲醇中保存5天。

用镊子小心地保持氮气流中的表面干燥。氮气流可以用压缩空气枪小心地添加。确保在整个过程中不要划伤钝化的表面。
检查点：甲S代表适当钝化控制添加染料（例如，100 nM的加星号的在PBS中）或在相对于钝化的非钝化盖玻片并在显微镜下观察其附接至表面种子粘着细胞。

要重新使用，请在氢氧化钾浴中将用过的Schlenk烧瓶和玻璃样品架从PEG残留物中清洗过夜，然后用去离子水洗涤。

选项I – 固定特定细胞配体
准备100 µl 反应混合物，以进行含有所需细胞配体的铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应（CuAAC，请参见配方7）。
注意：分别为叠氮化物或炔配体选择合适的炔或叠氮化物官能化PEG。

准备一个带有底膜的湿气室，在一个培养皿中放置一块盖玻片的湿纸巾内，放置一个湿纸巾（图2，固定）。Parafilm用于将盖玻片固定在其位置，并在以后简化“夹心”玻璃的分离。
将一滴100 µl滴答混合物放在钝化并干燥的盖玻片上。
将第二张相同的盖玻片放在第一个盖玻片上。
在室温（RT）下将“三明治”孵育2小时。

方案二– 固定DNA发夹力传感器
放置250的下降- 将300μl上的钝化和干燥盖玻片顶部的金纳米颗粒的溶液。
在室温下孵育盖玻片30分钟。
同时，使用“顶部”，“底部”和“发夹” ssDNA杂交发夹力传感器。按照指示使用DNA混合物和退火程序（请参见第8条）。如果购买的DNA链未经标记，则应在上一步中将DNA和荧光团偶联（有关下面标记DNA链的信息，请参见第4条）。
通过在玻璃杯之间小心吸取300 µl超纯水来分离表面，并用镊子将它们捡起（图2，固定）。通过用〜10 ml超纯水彻底冲洗，将其从上清液中的金纳米颗粒溶液中清除。
检查要点：通过盖玻片的粉红色光泽确认金纳米颗粒已成功固定。

除去盖玻片边缘上有薄纸的多余液体，不要让它们完全干燥或接触它们。
将一滴100 µl DNA混合物滴在镀金的盖玻片上。
放置第二张相同的盖玻片，金纳米颗粒涂层的一面朝下放在第一张盖玻片上。
在排除光线的情况下，将“三明治”在4°C下孵育过夜。
准备含有三肽/配体的100 µl 用于CuAAC 的反应混合物（请参见第7条）。
通过用PBS洗涤，仔细地从DNA混合物中分离并清洁表面（类似于步骤D4）。
除去盖玻片边缘上有薄纸的多余液体，不要让它们完全干燥或接触它们。
将一滴10 0 µl单击混合物放在DNA包被的盖玻片上。
放置第二张相同的盖玻片，将DNA涂层的一面朝下放在第一张盖玻片上。
在避光条件下，在湿度室中于室温下将“三明治”孵育2小时，以避免荧光团漂白。

选项III – 特定细胞配体和DNA发夹力传感器的组合
准备100 µl 含1st 配体的CuAAC的1st 反应混合物（请参见第7条）。
准备一个在培养皿内有湿纸巾的湿气室，并在其底部放上盖玻片的底部放平膜。
将一滴100 µl滴答混合物放在钝化并干燥的盖玻片上。
将第二张相同的盖玻片放在第一个盖玻片上。
在室温下将“三明治”孵育2小时。
通过用PBS洗涤（与步骤D4相似），仔细地从点击混合物中分离并清洁表面。
进一步的步骤是等于“d）的DNA发夹力传感器固定化固定化” 小号TEP 小号使用2 D1-D14 第二配体在小号TEP D9。

显微镜样品制备
通过用PBS洗涤（与步骤D4相似），仔细地从点击混合物中分离并清洁表面。
除去盖玻片边缘上有薄纸的多余液体，不要让它们完全干燥或接触它们。
将盖玻片涂胶，使功能化表面朝上进入培养皿，底部带有定制孔（比盖玻片小2 mm）。因此，将约200 µl的Twinsil 22硅1：1（例如）与移液器吸头混合，然后将胶水涂在孔的边缘，例如盖玻片完全覆盖孔并被胶水包围。
等待胶水的固化时间（〜5分钟，检查剩余的胶水）。如有必要，通过用PBS清洗表面以清除胶水污染。通过分别比较仅钝化盖玻片与固定化配体（步骤C）或力传感器（步骤D）的细胞附着（程序G）和均质背景荧光，
检查细胞配体和力传感器是否成功固定。

细胞分析（U2OS）
将用于观察细胞的腔室置于37°C和5％CO 2 气氛中。
在步骤F中制备的覆盖功能化盖玻片的陪替氏培养皿中填充2-3 ml细胞培养基（0.5％FBS）（请参阅配方5）。使用低FBS含量的培养基以防止非特异性配体相互作用并改善显微镜。使用细胞培养通风橱以防止培养基或细胞培养物污染。
按照标准规程（例如，基本细胞培养规程（Helgason和Miller ，2004）），用PBS洗涤从培养瓶中收获贴壁细胞，并用Accutase分离。
注意：Accutase可以使细胞轻柔地分离出来，从而获得更快的铺展效果。

稀释浓度的种子细胞可以不受干扰地扩散。在U2OS 10的情况下，5个细胞达到足够的密度（从T-25和35 mm的培养皿表面以大约1:10的稀释度计算）。
等到细胞沉淀下来并开始在表面上高效繁殖（10-30分钟）。
注意：力传递最好在接种细胞后30分钟观察到，并显示为打开的DNA发夹传感器的亮点和放射状条纹（图3）。

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003095--1477蒂娜·韦根861625 \ Figs jpg \ Fig3.jpg

图3. U2OS 细胞在特定配体呈现表面上的粘附力和施加力。用（A）选项I：cRGD功能化和（B）选项II：cRGD连接的DNA播种在表面后15-20分钟内的U2OS细胞的代表性明场，干涉反射显微镜（IRM）和荧光宽视场图像发夹传感器（4.2 pN打开力；StarRed荧光团）。比例尺= 10 µm。

子孢子测定
尝试使盖子的边缘尽可能干燥，而功能化表面的中心应保持潮湿。这简化了硅腔室的建立。
按压硅胶腔室，使其粘性侧在功能化盖玻片的边缘，以最大程度地减少细胞分布区域（注意：硅胶棒最好放在干玻璃上）。购买的多孔室可以切成合适的尺寸。可以跳过此步骤，但是易于生成足够的寄生虫密度。
将15 µl子孢子培养基（6％BSA）（参见配方6）填充到硅腔中。
加入15 µl冰冷的PBS，其中含有来自6-8对感染良好的蚊子唾液腺的新鲜分离的子孢子（有关蚊子感染和子孢子的详细收集方法，请参见Prinz 等人，2017），得到3％-BSA-培养基。
笔记：

也可以使用减少FBS的细胞培养基（0.5％FBS）。
不要将唾液腺长时间放置在冰上，因为这可能会损害子孢子的活力。
GFP标记的子孢子的使用简化了感染良好的唾液腺的选择及其分离。它们可以在配体呈递的表面可以采用（选项I，参见图ü 重新4 甲），但必须小心以力传感器（图一起使用它们时选择合适的滤光器组URE 4 乙）吨o避免荧光漂白剂通过。
在2,000 xg 的离心机中离心3分钟将细胞旋转至表面。有充分根据的硅室可以承受此程序。
附着在表面约30分钟后即可直接观察到运动性（图4）。
D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003095--1477蒂娜·韦根861625 \ Figs jpg \ Fig4.jpg

图4。子孢子（伯氏疟原虫）在特定配体存在的表面上滑动。（A）表达GFP的子孢子播种在表面上5分钟后的代表性明场，干涉反射显微镜（IRM）和荧光广域时移图像，在选项I播种后的5分钟后是cRGD-功能化和（B）WT子孢子在选项I上用选项II播种在表面：cRGD连锁的DNA发夹传感器（4.2 pN打开力； StarRed-荧光团）。对于选项II骨肉瘤细胞（空心箭头）与子孢子作为用于基于DNA的力传感器的阳性对照一起接种（见图URE 3）。子孢子粘附并在两个表面上滑动，但是，DNA发夹传感器未检测到张力信号。这可能是由于亚阈值力，很少的表面相互作用或太短的粘附时间（子孢子以〜2 µm / s的速度移动）而导致张力探针无法检测到展开，而粘附在同一基质上的骨肉瘤细胞发出荧光信号（空心箭头）。明亮的荧光点（全箭头）是从蚊子唾液腺中纯化子孢子后产生的自身荧光残留物。比例尺= 10 µm。

显微镜设置
在配备有针对细胞条件（37°C； 5％CO 2 ）的定制环境室的荧光广角显微镜（Olympus）上进行成像。子孢子通常在不提供CO 2的情况下在室温下成像，但我们也成功地在细胞条件下进行了滑行运动分析。
用偏光滤光片组拍摄明场图像。
用激发带通滤光片632/22 nm和发射滤光片679/34 nm拍摄荧光显微镜图像。
使用激发带通滤光片542/27 nm以IRM模式（设置发射带通滤光片525/48 nm）以最小的曝光时间和强度拍摄干涉反射显微镜（IRM）图像。因此，IRM观察可用作成像过程中细胞粘附于表面的低漂白控制。

数据分析

不含力传感器的受体表面（选项I）可用于对在非粘附性PEG化的表面上已定义的配体的细胞粘附特性进行定性测试。明场成像或IRM可以验证细胞是否紧密粘附在表面上，例如这种方法不需要荧光显微镜检查。

此外，可以对细胞在表面上的沉降和扩散时间进行定量分析（数据分析请参见Schaufler 等人，2016），对于活动子孢子则可以使用滑移运动的定量分析（数据分析请参见Prinz 等人，2017）。用于不同细胞/寄生虫系或不同配体之间的可比数据分析。

DNA力传感器表面（选项II 和III）以特定的阈值力提供数字ON-OFF信号。传感器表面的荧光显微镜图像可提供有关所施加力的空间，时间和半定量信息，这些信息由荧光信号的瞬时出现（发夹）指示。因此，首先使用Fiji软件调整荧光显微镜图像的亮度和对比度，以更好地观察信号。对于延时成像，使用“堆栈对比度调整”插件来校正光漂白。可以从反映dsDNA打开的相对量的局部亮度中生成半定量力读数，并通过颜色编码的LUT（例如“光谱”）进行显示（有关更多详细信息，请参见Zhang 等人，2014年，补充图7）。但是，这种定量分析受到光学分辨率的限制，因为通常每个衍射限制点将包含多个传感器。

为了缩小绝对牵引力值，可以通过改变DNA序列，使用具有不同刚度的DNA传感器重复该实验。可以将多个与不同荧光团偶联的传感器组合在一个表面上，以获得多重结果（参见Zhang 等人，2014）。

笔记

准备适当体积的等分试样用于冷冻培养基或溶液，以避免重复的冻融循环并延长其保质期。
用移液管小心地在三明治内添加300 µl PBS，从反应混合物中分离并清洁表面。随后提起顶部盖玻片，并用PBS洗涤。确保在整个过程中不要刮擦表面。
避免在任何时候使表面变干，因为回缩的液体会由于表面上的表面张力而产生伪影。
具有NHS功能的其他荧光染料和猝灭剂可用于标记DNA，具体取决于显微镜中滤光片的可用性。考虑具有高量子产率和接近金纳米颗粒的粒子共振峰的发射波长的染料，以实现更强的猝灭（Kang 等，2011）。请注意，细胞的自发荧光，尤其是来自细胞核的自发荧光，可以与来自细胞下方的传感器信号重叠。对于具有高核体比的较小细胞（例如，疟原虫子孢子），像StarRed这样的远红色染料可以使这种信号自发荧光干扰最小化。

菜谱

PBS缓冲液
按照指示制备PBS：
氯化钠8.006克（终浓度：137毫米）

KH 2 PO 4 1.375 g（最终浓度：10.1 mM）

氯化钾201.3毫克（终浓度：2.7毫米）

Na 2 HPO 4 255.5 mg（最终浓度：1.8 mM）

添加0.8升的超纯净水
通过加入几毫升HCl（1 M）将pH值调节至7.4
加超纯净水至总体积为1 L
将缓冲区存储在RT
Sil-PEG（3500）-LA
在一个小的Schlenk 烧瓶中，在氮气大气压下用磁力搅拌棒将145 µmol NH 2 - PEG（3400）-LA溶于3 ml DMF中
加入159.5 µmol 3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基异氰酸酯（1.1 分子倍数PEG）
STI - [R在室温下过夜
将溶液冷却至4°C
甲DD冷却乙醚1个小时
用冷却的乙醚在玻璃粉（3号）上洗涤反应物
在真空下将所得的Sil-PEG-LA干燥至干燥
将粉末在惰性气体下储存在-20°C
干甲苯
在烤箱中充分干燥分子筛
用真空吸尘器倒空锥形瓶，并添加氮气气氛
在保护气氛下添加甲苯，并正确关闭烧瓶
等待数小时以清除甲苯中过多的水
在氮气氛下室温保存
大号阿贝尔荷兰国际集团的DNA链的
将超纯水中的DNA 溶解至1 mM的浓度
将染料-NHS分别浸入干燥的DMSO中至10 mM
将105.99 mg Na 2 CO 3 溶解在1 ml超纯水中
在150 µl PBS中混合60 µl溶解的DNA上链（c final ：0.2 mM），60 µl 溶解的染料-NHS（c final ：2 mM）和30 µl Na 2 CO 3 溶液（c final ：0.1 mM）。用DNA bot tom链和淬灭剂-NHS进行相同的处理
调节pH至8.5
排除光线，在室温下搅拌过夜
按照制造商用户手册中的说明在NAP-5柱中纯化混合物
用HPLC（梯度高压液相色谱）纯化混合物。使用Luna 5u C18（2）-RP-HPLC色谱柱，流动相为醋酸三乙铵（TEAA）（0.1 M）和乙腈，其90分钟内的浓度为10％至50 ％，20分钟内的浓度为50％至90％
收集同时显示DNA（260 nm）和染料在相同时间的两个最大吸收峰的馏分
将产品冷冻至-80°C，然后冻干以除去溶剂
在超纯水中重悬纯净产品
确定的与使用NanoDrop分光光度计测定浓度的吸光度甲DNA; 1mm 的DNA在260 nm 和吸光度A 染料; 在各染料/猝灭剂的激发波长下为1mm
通过以下三种方式测量浓度：

注意：考虑染料在260 nm波长处的消光系数和校正因子CF 260 nm 。

将所得的链条在避光条件下储存在4 °C
显微镜U2OS介质
按照指示准备细胞培养基（0.5％FBS）：
MEM 48.75毫升

丙酮酸0.5毫升

青霉素/ 链霉亲和素100x 0.5毫升

FBS 0.25毫升

在无菌条件下（通风橱）混合并过滤培养基
将介质储存在4°C
显微镜下子孢子滑移介质
按照指示始终新鲜准备子孢子培养基（RPMI + 6％BSA）：
RPMI 44.5毫升

青霉素链霉素2.5毫升

白蛋白级分V 3 g

彻底溶解白蛋白
在Heraeus Biofuge中以13k rpm f 或5分钟旋转不可溶解的颗粒
点击反应混合物（CuAAC）（改编自Hong 等，2009）
制备点击反应缓冲所示：
氯化钠87.7毫克（C 最终：150毫摩尔）的Na 2 HPO 4 114.7毫克（C 最终：80.8毫摩尔）KH 2 PO 4 25.9毫克（C 最终：19毫摩尔）甲DD8毫升超纯水

通过添加一些微升HCl（1 M）将缓冲液的pH值调节至7.4
加入超纯净水至总体积为10毫升
在超纯水中溶解氨基胍至100 mM的浓度
将硫酸铜在超纯水中溶解至20 mM的浓度
溶解在超纯WA的cRGD炔吨ER至10mM的浓度
注意：可以等效地使用其他具有炔烃功能的三肽和配体。对于叠氮化物官能化的分子，炔烃反应伙伴在该配方中被取代并均等处理。

溶解钠ascorb 在超纯笏IC酸ER至100mM的浓度
将THPTA在超纯水中溶解至50 mM的浓度
预混物3微升THPTA用1.5微升共PPER溶液thoroughl ÿ
将87.5 µl点击反应缓冲液与1 µl cRGD-炔烃（最终浓度：0.1 µM），1.5 µl THPTA /铜预混液（最终浓度：0.5 µM / 0.1 µM），5 µl氨基胍（最终浓度：5 µM）和5 µl混合抗坏血酸（最终浓度：5 µM）
将缓冲区存储在RT。将氨基胍和铜溶液储存在4°C，将肽炔和THPTA溶液储存在-20°C。使用前总是直接准备抗坏血酸溶液
DNA退火
将DNA链溶于超纯水中，浓度为10 µM。如果标记了顶部DNA链，请在重悬后使用分光光度计测量值计算得出的值。将DNA链存储在4°C，将发夹链存储在-20°C
对于发夹型传感器，将3 µl顶部DNA（c final ：0.3 µM），3 µl底部DNA（c final ：0.3 µM）和3.3 µl发夹DNA（c final ：0.33 µM）混合到70 .3 µl NaCl缓冲液（1 M ）
在热循环仪中对绞线进行退火。对热循环仪进行编程：在95°C加热10分钟（变性），在95°C保持4秒钟（退火），重复最后一步399x，同时每步冷却0.2°C ，最后保持在12°C
向退火的DNA中添加20.4 µl额外的底部DNA（最终浓度：2.04 µM）
致谢

感谢AG Frischknecht 和AG Cavalcanti-Adam的所有同事，丰富了辩论和建议。

这项工作是由来自德意志奖学金资助的研究联合会- （DFG，德国研究基金会）Projektnummer 240245660-SFB 1129，P1和P15，以及马普学会。

利益争夺

作者宣称不存在任何竞争性的经济利益。

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