材料和试剂

1. 10厘米细胞培养处理过的培养皿（Corning，Falcon，目录号：353003）

2. 细胞培养处理的白色不透明384孔板小体积（Greiner Bio One，目录号：784080）

3. 未经处理的96孔V型底板360 µl （BrandTech Scientific，目录号：781601）

4. 无菌10-和25-ml的血清移液管（FISHERBRAND ，目录号小号：14955234 [10毫升]，14955235 [25毫升]）

5. 1.5毫升无菌离心机（Fisherbrand ，Basix，目录号：509GRDSERV）

6. 无菌15毫升锥形离心管（Corning，Falcon，目录号：C352096）

7. 无菌的50 ml锥形中心ifuge管（Corning，Falcon，目录号：C352070）

8. 25毫升无菌移液管（Fisherbrand ，目录号：13681509）

9. 带有鲁尔锁的无菌60毫升注射器（Fisherbrand ，目录号：14955461）

10. 无菌Uniflo 注射器式过滤器0.22 PVm PVDF（GE Healthcare ，Whatman，目录号：99132502）

11. HEK293细胞（ATCC，目录号：CRL-1573）

12. DMEM（Wisent生物产品，目录号：319-005-CL）

13. 胎牛血清（FBS，维森特生物产品，目录号：080-150）

14. 1 M HEPES溶液（维森特生物产品，目录号：330-050-EL）

15. 200 mM L-谷氨酰胺溶液（Wisent Bioproducts ，目录号：609-065-EL）

16. 100 x 青霉素-链霉素溶液（Wisent Bioproducts，目录号：450-200-EL）

17. 1 x PBS（维森特生物产品，目录号：311-010-CL）

18. 胰蛋白酶0.25％-EDTA 2.21 mM（维森特生物产品，目录号：325-043-CL）

19. Opti-MEM（Gibco，目录号：31985062）

20. Lipofectamine 3000（Invitrogen，目录号：L3000001）

21. P3000试剂（Invitrogen，包含在Lipofectamine 3000中）

22. 聚L-赖氨酸氢溴酸盐25毫克（Sigma-Aldrich，目录号：P1274-25MG）

23. 末席ž细胞计数盒M型（Orflo ，目录号：MXC001）

24. IP-One - Gq 试剂盒20,000点（PerkinElmer，Cisbio ，目录号：62IPAPEC）

25. 聚-L-赖氨酸0.1 mg / ml溶液（请参阅食谱）

26. 完整的DMEM（HEK293细胞的培养基）（请参阅食谱）

设备

末席ž迷你自动细胞计数器（Orflo ，目录号：MXZ001）
8通道10-100 升多吸管（Eppendorf，Research plus，货号：3125000036）
单通道中继器移液器（Eppendorf，Repeater M4，目录号：4982000322）
HTRF滤波器组（λ EX 。320纳米，λ EM.1 620纳米，λ EM.2 665纳米）
兼容HTRF的多模式读板器（Tecan，GENios Pro ）

软件

XFluor4 Excel Macro （用于控制GENios Pro 读板器的Tecan应用程序Tecan ）
Excel 2016 （Microsoft Office，https://products.office.com）
Prism8（GraphPad，https: //www.graphpad.com ）

程序

384孔板涂层（在生物安全柜下）
将0.1 mg / ml的聚-L-赖氨酸溶液放入25 ml无菌移液池中。
移取25μl的0.1 mg / ml聚-L-赖氨酸溶液（使用标准无菌尖端），并填充加有培养物处理的白色不透明小体积384孔板的每个孔。
用384孔板上的盖子（不感光）在室温下孵育15分钟。
使用设置为50 µl的多通道移液器从细胞培养板中去除聚L-赖氨酸。
通过在每个孔中吸取25毫升无菌水冲洗384孔板两次，并通过倒置除去液体。
在没有盖上盖子的情况下，让板在生物安全柜下干燥至少30分钟，或直至孔完全干燥（最多2小时）。
商店聚-L-赖氨酸涂覆有上盖板，使他们在室温下无菌，直到使用（不对光敏感，见Ñ OTE 1）。

用于转染的细胞制备（在生物安全柜中）
用10 ml的1 x PBS 冲洗HEK293细胞，方法是轻轻移取培养皿侧面的PBS，以避免细胞脱离。通过抽吸或倒置除去PBS。
在每个培养皿中加入1 ml的0.25％-EDTA 2.21 mM 的胰蛋白酶，并确保胰蛋白酶溶液覆盖培养皿的所有区域。
在37孵育1分钟 ℃。
向每个培养皿中加入10 ml完整的DMEM，并通过10 ml移液器上下移动来分离细胞。
移取75孔细胞悬液，以用于Moxi Z细胞计数器进行计数。
在每个完整的384孔板中，在10 ml完整DMEM中准备两个含有3 x 10 6 细胞的10 cm培养皿，将其转染。
将细胞在5％的CO 2 下于37 °C 的潮湿箱中孵育48小时。

细胞转染并接种到384孔板中（在生物安全柜中）
准备每个转染的转染（32孔的1.5 µg DNA）：
将150 µl Opti-MEM加入无菌的1.5 ml微量离心管中。
加入1.5 µg 编码所需7TMR（野生型或突变型）的质粒DNA。
加入3份P3000试剂。
用手指轻拂试管进行混合，以确保DNA和P3000试剂均匀分布。
加入3份Lipofectamine 3000试剂，并用手指轻拂试管进行混合。
在室温下孵育15至30分钟，以形成转染复合物（对光不敏感）。
制备细胞悬浮液的镀敷用的细胞中制备过程B（参见Ñ OTES 2和3）：
如步骤B 1 所述，用10 ml的1 x PBS 冲洗HEK293细胞。
在每个培养皿中加入1 ml的0.25％-EDTA 2.21 mM的胰蛋白酶，并确保胰蛋白酶溶液覆盖培养皿的所有区域。
在37 °C下孵育1分钟。
向每个培养皿中加入5 ml完整的DMEM，并通过10 ml移液器上下移动来分离细胞。
移取75孔细胞悬液，以用于Moxi Z细胞计数器进行计数。
在每个完整的384孔板中，将完整的DMEM 中的1.5 x 10 6 细胞/ ml的9 ml细胞悬液准备转染到无菌50 ml锥形管中。
轻轻混合细胞悬液以确保细胞的前夕分布。
细胞转染和铺板：
将在步骤C2中制备的700μl细胞悬液转移到在步骤C1中制备的1.5 ml微量离心管中。
用手指轻拂试管进行混合。
将试管中的内容物转移到无菌的25 ml移液管中。
使用10-100 8l 8通道多移液器将20ofl细胞悬液从移液池转移至384孔板。
重复步骤d。直到板的两列都充满单元格。
确保孔的底部没有气泡，以防止细胞粘附。
从步骤a。重复操作。与其他转染。
将细胞在5％的CO 2 下于37 °C 的潮湿箱中孵育48小时。

IP-One检测
试剂准备（如果使用新的IP-One试剂盒）：
用3 ml的ddH 2 O 重构IP1 Tb加密抗体，轻轻涡旋混合，然后将50毫升的等分试样装到1.5 ml的微量离心管中。
用3 ml的ddH 2 O 重构IP1 d2试剂，轻轻涡旋混合，然后将50毫升的等分试样放入1.5 ml的微量离心管中。
重构IP-One-根据试管标签，用ddH 2 O制成Gq 标准液，轻轻涡旋混合，然后将25毫升的等分试样放入1.5 ml微量离心管中。
存储IP1铽穴状化合物抗体，IP1 D2试剂，和IP-之一等分试样- Gq蛋白标准在-20 ℃下直至使用（见Ñ OTE 4）。
激动剂制剂（见Ñ OTE 5）：
通过将1.4 ml 5x刺激缓冲液（随试剂盒提供）与5.6 ml ddH 2 O 稀释到15 ml锥形管中，制备7 ml 1x刺激缓冲液。
使用V型底96孔板的前七行（A至G）在1x刺激缓冲液中制备7TMR激动剂的系列稀释液，范围从10 -5 到10 -11 M（需要在多列中进行稀释以具有足够量）体积以填充整个384孔板）。
用1x刺激缓冲液（非刺激对照）填充最后一行。
细胞刺激：
通过倒置废物容器上的384孔板来移出细胞培养基。
使用10-100 µl 8通道多移液器在每个孔中使用25 ofl室温的1 x PBS 洗涤细胞。
通过在废物容器上方翻转384孔板除去1 x PBS 。
确保所有孔中都没有残留的液体（如果是的话，请再次颠倒并轻轻摇动平板直至所有孔中都没有液体）。
使用10-100 8l 8通道多移液器将14配体稀释液添加到384孔板的每个孔中。
将盖子放在384孔板上，在37 °C 孵育30分钟。
编写IP1标准曲线：
通过将425份1x 刺激缓冲液添加到25个IP-One - Gq 标准的等分试样试管中，制备Std 7溶液，并涡旋混合。
通过将50升的Std 7稀释到150升的1x 刺激缓冲液中并放入1.5 ml微量离心管中来制备Std 6，并涡旋混合。
通过重复b中所述的相同稀释过程，准备Std 5、4、3、2和1。
Std 0是阳性对照，不是Std 1的稀释液，而只是1 x 刺激缓冲液。
在384孔板中一式两份分配14 µl每个Std溶液（从Std 0到Std 7）（图3 ）。

D：\重新格式化\ 2020-7-1 \ 2003133--1482 Elie Besserer-Offroy 846336 \无花果jpg \ Fig3.jpg

图3.检测板的典型布置。野生型受体表达细胞（wt ）位于第1和2列，而突变受体表达细胞（M1，M2，…，M10）分布在随后的各对列中，除了用于IP-One标准曲线的第23和24列。

细胞裂解和检测反应：
通过将1 ml裂解液和检测缓冲液6（试剂盒中提供）添加到在步骤D1中制备的50毫升等分试样中，制备稀释的IP1 Tb加密抗体和稀释的IP1 d2试剂（对于整个384-样品，每份稀释的试剂需要1.3 ml）孔板）。
使用装有新的100- comb combitip的单通道中继器移液器，将3份稀释的IP1 d2试剂分配到384孔板的每个孔中（包括标准曲线孔）。
使用装有新的100- comb combitip的单通道中继器移液器，将3份稀释的IP1 Tb加密抗体分配到384孔板的每个孔中（包括标准曲线孔）。
将培养板在室温激烈进行温度章动混合器进行1〜18小时（参见Ñ OTE 6）。
HTRF读数：
使用兼容HTRF的多模式读板器读取来自供体的荧光发射并将能量转移至受体。
使用Cisbio 的设置来设置读取器，以进行HTRF b加密供体/红色受体读出。对于Tecan公司设置GENios 临板机和检索HTRF兼容的读卡器安装说明的链接都在说明部分找到（见ñ OTE 7）。

数据分析

通过将信号计算HTRF比每个条件（野生型和突变体）在665 纳米在620nm（供体）到Microsoft Excel由信号（受体）。
使用Y 将计算出的HTRF比值复制到新的XY数据表中：在Prism8 的并排子列中输入4个复制值（图4 ）。

D：\重新格式化\ 2020-7-1 \ 2003133--1482 Elie Besserer-Offroy 846336 \无花果jpg \ Fig4.jpg

图4. 人类CysLT1受体的野生型和突变型IP1产生的原始数据的截图示例

使用Prism 8 的归一化功能对所有数据集进行归一化，输入以最高激动剂浓度刺激的野生型受体的平均HTRF比值，以定义100％的激活率和对应于非激动剂的野生型受体的平均HTRF比值。 -stimulated（仅刺激缓冲区）定义激活的0％。
通过拟合非线性回归分析归一化的响应：在“剂量响应- 刺激”菜单中，选择对数（激动剂）vs。响应（三个参数）拟合（图5 ）。
D：\重新格式化\ 2020-7-1 \ 2003133--1482 Elie Besserer-Offroy 846336 \无花果jpg \ Fig5.jpg

图5 。LTD 4 对野生型和人类CysLT1受体的5个突变体产生IP1的影响。刺激hCysLT1受体的wt 和5个突变体后产生IP1，该hCysLT1受体使用本手稿中详述的方法转染并发表在Luginina （2019）中。如上所述，将结果相对于wt 受体归一化，代表三个独立实验的IP％产量平均值±SEM，一式四份。

在结果- 非线性拟合选项卡中检索每种条件下激动剂的效价值（EC 50 ）。
通过使用SD或SEM 的Row手段分析归一化值表，并使用SEM选项选择Row手段，计算每种条件下激动剂的最大功效值（E max ）。
可以将每个独立实验的EC 50 和E max 值（及其对应的SEM）合并到一个新的Prism8 XY表中，该表中的Y：输入并绘制误差值已在其他位置计算出来（Enter：均值使用SEM）。通过使用描述性统计数据并仅在均值，SD，SEM上打钩来分析此表。

笔记

可以弃用聚-L-赖氨酸溶液或将其重复使用以涂覆另一块板（我们不建议使用相同的聚-L-赖氨酸溶液涂覆超过4块板）。聚-L-赖氨酸包被的板可以在室温下保存最多2个月，或在4 °C下保存最多6个月。
我们建议细胞处于指数生长期以获得最佳转染效果。通过Moxi Z自动细胞计数器测定，当细胞直径为14 µm或更高时，我们观察到了很高的转染效率。
用于转染和铺板的细胞的制备（步骤C2）可以在形成转染复合物的孵育时间（步骤C1f）中完成。
根据制造商的说法，IP1 Tb加密抗体，IP1 d2试剂和IP-One - Gq 标准在-20 °C下可以稳定保存3个月，但是，等份样品最多可以保存1年，因此我们获得了类似的结果。
对于刺激，如果不适合使用1 x 刺激缓冲液，则可以用不含FBS或抗生素的细胞培养基或Hank的平衡盐溶液代替。但是，为了抑制IP1的降解，必须添加最终浓度为50 mM的氯化锂。
孵育1小时后即可读取HTRF，但是当培养板置于室温下时，信号在18 h内稳定。如果多模式读取器在第一次读取后出现故障或故障，可以再次读取板，而不会损失HTRF强度。万一出现HTRF读取器破裂或无法操作的情况，可以用塑料密封垫密封板，并在-20 °C下冷冻长达2个月（解冻后可能会出现轻微的信号损失）。
使用Tecan GENios Pro多模式读板器进行HTRF读出的设置：
第一次测量：
激发光：320±25 nm

发射：620±10 nm

二次测量：
激发光：320±25 nm

发射：665±10 nm

收益：最佳

读取模式：顶部

过滤器开关模式：每板

后视镜选择：二向色3（例如，FI）

积分：

滞后时间：150 µs

积分时间：500 µs

读：

读取次数：10

移动和读取之间的时间：0 ms

可在http://www.cisbio.com/compatible-readers上找到与HTRF兼容的酶标仪和读出设置说明的列表。

菜谱

聚-L-赖氨酸0.1 mg / ml溶液
将5 mg聚-L-赖氨酸氢溴酸盐溶解到50 ml的ddH 2 O中并涡旋
在生物安全柜下使用60 ml无菌注射器和0.22 µm无菌过滤器将溶液过滤到50 ml锥形管中。
完整的DMEM（用于HEK293细胞的培养基）
DMEM补充了10 ％的胎牛血清，2 mM L-谷氨酰胺，100 U / ml 青霉素-链霉素和20 mM HEPES

致谢

这项工作由加拿大卫生研究院（CIHR，FDN-148413）资助。EBO是魁北克-桑特研究基金（FRQ-S，授权255989）和CIHR（授权MFE-164740）的研究奖学金的获得者。RLB是博士学位的获得者。FRQ-S和舍布鲁克大学医学与健康科学学院的奖学金。PS是加拿大慢性疼痛神经生理药物一级研究主席的获得者，也是FRQ-S资助的魁北克疼痛研究网络（QPRN）的成员。图1和2是使用BioRender.com创建的。该协议是该协议的详细版本，已在以下原始文章中成功应用：Luginina 等。（2019）和Gusach 等。（2019）。

利益争夺

作者声明，他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，已经或可能被认为影响了本文报道的工作。

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