材料和试剂

1. 6孔板（BD Falcon，目录号：353046）

2. 24孔板（BD Falcon，目录号：353047）

3. Whatman玻璃微纤维过滤器，GF/B级（默克密理博，产品编号：WHA1821025）

4. 电穿孔反应杯（Bio-Rad，目录号：1652086）

5. Sf9细胞，适用于无血清培养基（生命技术，目录号：11496-015）

6. 大肠杆菌DH10Bac细胞（生命科技，目录号：10361-012）

7. pFastBac-HT克隆载体试剂盒，含对照质粒（Life Technologies，目录号：10584-027）或pFastBac1克隆载体试剂盒，含对照质粒（Life Technologies，目录号：10360014）

8. 杆状病毒滴度试剂盒，含抗gp64-PE结合抗体和对照病毒（表达系统，目录号：97-101）

9. Purelink HiPure质粒Miniprep试剂盒（Life Technologies，目录号：K210002）

10. ESF 921昆虫细胞培养基（表达系统，目录号：96-001-01）

11. 格蕾丝昆虫细胞培养基（生命科技，目录号：11595030）

12. 增产添加剂（表达系统，目录号：95-006-100）

13. Cellfectin II（生命技术，目录号：10362100）

14. Alexa Fluor 488山羊抗兔抗体（Life Technologies，目录号：A11008）

15. 抗5-HT2AR兔抗体（神经组学，目录号：RA24288）

16. 抗5-HT2AR兔多克隆抗体（Abcam，目录号：ab66049）

17. 抗标志（R），兔产生的抗体（西格玛·奥尔德里奇，目录号：F7425）

18. HRP结合山羊抗兔抗体（默克密理博，目录号：AP187P）

19. 半琥珀酸胆固醇酯（Avanti极性脂质，目录号：850524）

20. 正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷（DDM）（Anatrace，目录号：D310S）

21. α-碘代乙酰胺（默克密理博，目录号：407710）

22. [3H]-Ketanserin（Perkin Elmer，目录号：NET791250UC）

23. 酒石酸克他赛林（Alfa Aesar，目录号：J62798）

24. 盐酸血清素（Acros Organics，目录号：AC215021000）

25. SIGMAFAST蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（Sigma-Aldrich，目录号：S8830）

26. 聚乙烯亚胺（Sigma-Aldrich，目录号：P31433）

27. Ni-NTA琼脂糖（Qiagen，目录号：30210）

28. 液氮

29. 青霉素链霉素（Invitrogen，目录号：15070063）

30. 硫酸卡那霉素（Calbiochem，目录号：420411）

31. 硫酸庆大霉素（Himedia，目录号：TC026）

32. 四环素（Himedia，目录号：TC036）

33. 牛血清白蛋白（Himedia，目录号：MB083）

34. Bluo Gal（英维特罗根，目录号：15519028）

35. 台盼蓝（生命科技，目录号：15250）

36. 闪烁液鸡尾酒“T”（Spectrochem，目录号：030399）

37. 异丙基β-d-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）（Himedia，目录号：MB072）

38. YT HiVeg肉汤（Himedia，目录号：MV1251）

39. LB介质（Himedia，目录号：MV1245）

40. 琼脂粉（Himedia，目录号：RM301）

41. Na2HPO4（Himedia，目录号：MB024）

42. KH2PO4（Himedia，目录号：TC011）

43. HEPES（Calbiochem，目录号：5320）

44. 氯化镁（SRL，目录号：69396）

45. KCl（Himedia，目录号：MB043）

46. NaCl（Himedia，目录号：TC046）

47. EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）

48. SDS（SRL，目录号：54468）

49. 甲醇（Finar，目录号：67-56-1）

50. 冰醋酸（SRL，目录号：90868）

51. 甘氨酸（Himedia，目录号：MB013）

52. 吐温20（Himedia，目录号：MB067）

53. 咪唑（Himedia，目录号：MB019）

54. 甘油（Himedia，目录号：MB060）

55. BCA蛋白分析试剂盒（Pierce，目录号：PI23227）

56. 蓝白菌落选择用LB琼脂平板（见配方）

57. Sf9细胞培养基（见配方）

58. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH值7.4（见配方）

59. 低张缓冲液（见配方）

60. 高渗缓冲液（见配方）

61. 再悬浮缓冲液（见配方）

62. 增溶缓冲液（见配方）

63. 平衡缓冲液（见配方）

64. 洗涤缓冲液I（见配方）

65. 洗涤缓冲液II（见配方）

66. 洗脱缓冲液（见配方）

67. 放射配基结合缓冲液（见配方）

68. SDS-PAGE运行缓冲区（见配方）

69. 考马斯亮蓝染色液（见配方）

70. SDS-PAGE去渍液（见配方）

71. 免疫印迹转移缓冲液（见配方）

72. TBST缓冲液（见配方）

73. 阻塞缓冲区（见配方）

设备

1. -80°C冷冻柜（ESCO，型号：UUS-439-A-1）

2. 生物安全柜II类A2型（ESCO，型号：AC2-4S8）

3. 电穿孔器（Bio-Rad，型号：微脉冲电穿孔器，目录号：165-2100）

4. 流式细胞仪（BD Biosciences，BD LSRFortessa，型号：LSR Fortessa）

5. 液体闪烁计数器（Perkin Elmer，型号：Tri-Carb 2810 TR）

6. 超离心机（Thermo，型号：46901-WX90），带T865转子，用于30毫升试管

7. 培养摇床（Sartorius，品牌，型号：Certomat BS-T），用于大容量培养

8. 培养箱摇瓶（捷奥科技，品牌，型号：ISS-4075R），用于维护和小容量培养

9. 细菌培养箱（BIS-1824）

10. 荧光倒置显微镜（徕卡，型号：DMIL LED FluoTrinoculer倒置显微镜，序列号：362094）

11. 冷冻离心机（Hermle，型号：Z446K），用于较大体积（>2mL）或平板离心

12. 冷冻离心机（Eppendorf，型号：5417R），用于较小体积（≤2mL）离心

13. 探头声波仪（Takashi，型号：U150），配备直径为6 mm的探头

14. SDS-PAGE凝胶电泳装置（GE Lifesciences，型号：SE250）

15. 小页面吸墨纸系统（GE Lifesciences，品牌，目录号：SBE2010-PB）

16. 歧管真空过滤（Millipore，目录号：M2536-1EA）

17. 可见荧光免疫印迹成像系统（Azure，型号：Azure Biosystems c400）

软件

1. 流式细胞仪分析用FACSDiva v6.2（BD Biosciences）

2. Prism（GraphPad，5.01版）或免费替代品（例如R生物导体包），用于装配放射性配体结合分析数据

3. 徕卡显微镜成像软件（徕卡），用于估计细胞密度、活性和监测

程序

本方案基于我们先前对rat（Mahesh等人，2018）和人类（Mozumder等人，2020）5-HT2ARs的研究。从早期质粒（Bhattacharyya等人，2006）亚克隆的大鼠受体（匹配Uniprot ID P14842）被N-末端组氨酸标签过度表达。从密码子优化序列中亚克隆人受体（匹配Uniprot ID P28223），具有稳定突变M1823.41W，在N端和C端分别用FLAG和组氨酸标签表达。功能活性5-HT2AR的表达和纯化包括以下步骤：（A）Bacmid制备；（B）制备高效价病毒储备；（C）在Sf9细胞培养中表达5-HT2AR；（D）纯化5-HT2AR；（E）放射配基结合分析。

A、巴塞米制剂

1. 向100µl冰上大肠杆菌DH10Bac细胞中添加2µl质粒（50 ng/µl），所述质粒含有克隆到pFastBac1或pFastHT载体（在受体的5或3′端包含标志或组氨酸标签）。′

2. 轻轻搅拌，在冰上孵育30分钟，然后转移到冷冻电穿孔反应杯中。如果使用2 mm电极间隙的试管，则使用程序“Ec2”进行电穿孔转化。

3. 立即加入1ml冰冷2YT培养基，不含抗生素，移入培养管37℃孵育，225rpm振荡4h。

4. 制备10倍连续稀释的细胞（例如1、10-1、10-2、10-3），并将每种稀释液100µl平板置于LB琼脂平板上，用于蓝白菌落选择（配方1），并在培养皿中培养48小时。

5. 从具有充分分离菌落的任何平板上，分别取白色菌落到含有50μg/ml卡那霉素、10µg/ml四环素、7µg/ml庆大霉素的LB培养基中，在37°C、180 rpm下培养过夜。按照制造商的协议，在6000 x g的温度下在4°C下离心5分钟，以收获细胞并使用“Purelink HiPure质粒MiniprepKit”从颗粒中纯化bacmids。

6. 在-20°C下保存bacmids。

7. 建议步骤：通过使用制造商指定的pUC/M13正向和反向引物，并遵循制造商的协议，验证重组5-HT2AR序列的完整性。这些引物对bacmid序列具有特异性，可与5-HT2AR基因的mini-attTn7位点两侧的上游和下游位点结合。

B、高效价病毒载体的制备

1. 将悬浮培养的健康Sf9细胞（见注2）在27°C的6孔板（每孔8 x 105个细胞）中培养。等待~1小时，使细胞粘附在孔表面。用不含抗生素的2ml格蕾丝昆虫细胞培养基洗涤细胞两次，以去除残留的非粘附细胞，并将电镀细胞调整到无抗生素的条件下。

2. 将1.5µg新制备的bacmid和8µl Cellfectin II试剂分别混合到100µl无抗生素的Grace昆虫细胞培养基中。混合两种溶液，在室温下培养30分钟。然后在200µl转染混合物中加入800µl无抗生素的Grace昆虫细胞培养基，并逐滴均匀地添加到每个孔中。27°C孵育4h，对于未转染（对照）细胞，制备不含任何细菌的Cellfectin II试剂并添加到孔中。

3. 每孔用2ml常规Sf9细胞培养基（配方2）冲洗细胞，培养5-6天，直至感染结束。

4. 比较转染细胞与未转染细胞（见注2），感染结束时，在4°C条件下以500×g的温和离心法收获病毒储备。收集上清液（即培养基）并丢弃颗粒。上清液为P0杆状病毒原液。

5. 在~0.01-0.1的感染倍数（MOI）下将P0培养基稀释到摇瓶中的小体积~10 ml Sf9细胞培养物中，并在27°C、130 rpm下培养48 h。通过在4°C下500 x g离心收集含有培养基的上清液，并将其储存为P1储备。（有关选择MOI和收获时间的详细信息，请参见注释4和5）

6. 重复上述步骤，在MOI约0.01–0.1的条件下，将P1培养基稀释到较大体积（~250 ml）的Sf9培养基中，并通过离心收集含有培养基的上清液，并将其储存为P2培养基。P2原料将用于蛋白质生产。

7. 立即使用0.2µm低蛋白结合注射器过滤器过滤所有收获的杆状病毒。

8. 使用杆状病毒滴度试剂盒，按照制造商的方案使用流式细胞仪（图1）测量P1和P2储备的杆状病毒滴度。简要地，

a、从一批健康悬浮培养物（见注2）中，将约200µl Sf9细胞（2 x 106个细胞/ml）接种到24孔板的每个孔中。

b、以培养基为稀释剂（如1:5、1:50、1:500等），按10倍稀释步骤对杆状病毒原液进行连续稀释。随后，将200µl稀释杆状病毒加入含有200µl电镀细胞的24孔板的每个孔中，导致额外的2倍稀释（以及1:10、1:100、1:1000等净稀释）。

c、在27°c，170 rpm下培养细胞18 h。通过温和离心3分钟收集细胞，以保持细胞适合于细胞术。用冰冷的PBS缓冲液（配方3）洗涤细胞两次，并在4°C黑暗中用抗gp64-PE结合抗体染色20分钟。

d、用冰冷的PBS缓冲液冲洗细胞两次，然后在含有1%BSA的PBS缓冲液中重新悬浮。

e、用流式细胞仪分析细胞计数，并根据制造商的“杆状病毒滴度试剂盒”方案获得病毒滴度（图1A-1D）。

9. 在4°C下储存工作储备（例如，一部分P2储备），最多6个月，其余的，包括所有P0和P1储备，在-80°C。对于冷冻，等分杆状病毒储备，以尽量减少自由解冻循环，添加3%BSA并在-80°C下储存。将所有等分（4°C和-80°C）储存在光保护管中或用铝箔包裹管进行保护从阳光下。

C、 5-HT2AR在Sf9细胞培养中的表达

1. 在27°C，130 rpm下，以2-3 x 106个细胞/ml的密度在摇瓶中培养20-50 ml健康Sf9细胞，并放大到所需体积，以保持快速生长阶段的细胞活力（见注释2）。

2. 在0.1的MOI下感染细胞，并在27°C和130 rpm下培养30小时。向细胞培养液中加入1%（v/v）的促生产添加剂（PBA），培养66 h。在没有PBA的情况下，在5的MOI处感染细胞并培养48 h（影响蛋白质表达的因素见注2）。

3. 在3000 x g下，在4°C下离心10分钟，收获细胞。

4. 在液氮中闪速冷冻后，用冰冷的PBS缓冲液清洗颗粒，并在-80°C下储存。

5. 对于低糖基化或高糖基化形式的受体的表达，分别在加入PBA后48h或120h后收获培养物。对细胞裂解物进行Western blot分析（图1E），并选择最合适的收获时间以获得最佳的糖基化程度（见注释6）。

图1。用流式细胞术估计杆状病毒滴度。（A）未感染的Sf9细胞（红点）和（B）感染P2杆状病毒（绿色）的Sf9细胞的流式细胞术数据的典型点图分析，并用抗gp64 PE结合抗体染色。细胞计数的直方图图作为PE信号的函数，显示了（C）未感染Sf9细胞的不同群体，（a）门控（黑色椭圆形），以及（D）PE阳性感染的Sf9细胞，门控（黑色椭圆形）（B），提供了由于Sf9细胞中gp64表达引起的杆状病毒感染的估计。如步骤B8b所述，在连续稀释的杆状病毒储备中，P2象限的信号随着病毒载量的增加（或降低）成比例地增加（或减少）。（E）在没有PBA（车道1，从左）和存在PBA（车道2-8）的情况下，糖基化和非糖基化5-HT2AR的变化的Western blot分析，感染后收获各车道上方显示的时间。阴性对照对应于未被bacmid转染的细胞。5-ht2aly+和5-HT2Agly-分别表示有糖基化和不糖基化的5-HT2AR。

D、 5-HT2AR的提纯

1. 将约1L培养物中的细胞颗粒重新悬浮于30mL冰镇低张缓冲液中（配方4），然后在冰上进行轻微超声（脉冲开启10秒，关闭30秒，10%功率，3个周期）。在这个和所有后续的纯化步骤中，细胞颗粒通过移液管重新悬浮。

2. 在150000 x g，4°C下将细胞悬浮液超速离心30分钟。丢弃上清液并用低渗缓冲液重复洗涤步骤两次。

3. 用30 ml冰冷的高渗缓冲液（配方5）洗涤残余颗粒，在150000 x g，4°C下超速离心30分钟，并丢弃上清液。

4. 用冰冷的PBS（配方3）清洗颗粒，去除残余介质，并将颗粒储存在-80°C，直到进一步使用。

5. 在4 ml再悬浮缓冲液（配方6）中再悬浮膜颗粒，并在室温下培养1 h。

6. 添加α-碘代乙酰胺至2 mg/ml的最终浓度，并在4°C下进一步培养30分钟（见注释7）。

7. 将经α-碘代乙酰胺处理后的~4 ml溶液溶解在4 ml溶解缓冲液（配方7）中，以达到1:1的稀释度，并通过温和翻滚在4℃下培养2 h。

8. 在150000 x g，4°C下将溶解膜超速离心30分钟，收集上清液并丢弃颗粒。

9. 向上清液中的溶解蛋白质添加缓冲NaCl和咪唑的浓缩溶液，以匹配平衡缓冲液（配方8）。

10. 将溶解的蛋白质溶液添加到（大约）2ml预平衡的Ni-NTA树脂中，并通过轻轻翻滚在4℃下培养过夜。

11. 通过在4°C下500 x g离心10分钟收集树脂。用3个柱体积（CVs）的洗涤缓冲液I（配方9）洗涤树脂四次，然后用2 CV洗涤缓冲液II（配方10）洗涤四次。

12. 通过五次冲洗1CV洗脱缓冲液（配方11）洗脱蛋白质，并分别收集每次洗涤的上清液，因为第一次洗涤含有最大的蛋白质，在随后的洗涤液中浓度降低，并且在电泳过程中更容易检测（图2A）。将纯化后的组分集中起来，交换到适当的无咪唑缓冲液中（例如，不含咪唑的洗脱缓冲液）并通过超滤浓缩。

E、放射配基结合分析

1. 将约50毫升Sf9细胞培养物中的膜颗粒重新悬浮于约5毫升的放射配基结合缓冲液中（配方12）。调整膜颗粒或再悬浮缓冲液的体积，以使500µl反应体积中的总蛋白质约为50µg（见注释8），每次反应分三次进行。用BCA法测定膜蛋白浓度。

2. 竞争结合试验（图2B）：

在室温下，在黑暗中用3 nM[3H]-酮安色林（热配体）和增加浓度的血清素（冷配体）将再悬浮的膜颗粒分三次培养1小时（约相当于解离常数Kd的10-3至105倍）。

3. 对于饱和结合分析（图2C）：

a、在室温下，在黑暗条件下，用浓度在0.25 nM到10 nM（约相当于解离常数Kd的0.25到10倍）的[3H]-酮安色林（热配体）浓度增加，将再悬浮的膜颗粒分三次培养1h。

b、为测定非特异性结合，用10µM血清素（冷配体）培养反应。

4. 在反应结束时，使用12孔细胞收获机通过25 mm GF/B过滤器过滤每个反应，预浸在0.3%聚乙烯亚胺中。

5. 用2ml冰镇50 mM Tris缓冲液（pH 7.4）清洗每个过滤器三次，并在空气中干燥一夜。

6. 向每个装有干燥过滤器的小瓶中加入5ml闪烁液，然后在闪烁计数器中进行测量（图2B和2C）。

图2。5-HT2AR的纯化及放射配基结合分析结果。（A）考马斯染色后，对纯化步骤的各个部分进行10%的SDS-PAGE分析。车道1-4表示，分子量标记物（Ln1），粗细胞裂解物（LN2），在将可溶性蛋白质装载到树脂（LN3）后流动，在无咪唑缓冲液中透析后洗脱蛋白质，并浓缩（LN4）。糖基化和非糖基化的5-HT2AR分别以红色和绿色矩形显示。（B）在5-羟色胺浓度增加的情况下，用3nM[3H]-氯胺酮进行5-HT2AR的竞争结合分析，发现膜结合受体的Ki为39nm（logKi=-7.41±0.29）。（C） [3H]-ketanserin与5-HT2AR特异性结合的饱和结合分析图显示，解离常数（Kd）为1.47±0.39 nM，最大结合位点数（Bmax）为567±57 fmol/mg蛋白质。对于（B）和（C），所示曲线来自三次进行的代表性实验，Kd、logKi和Bmax的值代表从三组测量中获得的平均值（±SEM）。

数据分析

1. 使用抗His和/或抗标志抗体的Western blotting法验证所有期望组分中是否存在5-HT2AR（有关适当的缓冲液，参见配方13-18）。

2. 洗脱部分的纯度应通过SDS-PAGE进行验证，如果需要，可浓缩必要的部分，并用考马斯染料或银染色法染色（图2A）。

3. 利用已知滴度的对照病毒和未知滴度的病毒储备，从标准曲线获得的方程中确定杆状病毒滴度。杆状病毒滴度试剂盒（Expression Systems Inc）的制造商提供对照病毒以及用于计算滴度的excel表格。

4. 对于放射配基结合分析，应分别使用GraphPad Prism v5.01将标准化数据点拟合到一个位点特定的结合模型或一个位点-适合于饱和结合或竞争结合分析的Ki。

笔记

1. 建议使用表达不同蛋白但使用相同杆状病毒载体表达系统的对照质粒作为阳性对照，以检测目标蛋白的表达。无感染细胞作为阴性对照。表达蛋白GUS和CAT的质粒分别与pFastBac1和pFastBac-HT克隆载体试剂盒一起提供，并且可以与含有5-HT2AR的质粒完全相同的方式使用。

2. 使用健康的Sf9细胞对这项工作的产量和重复性至关重要。通常，快速生长的Sf9细胞密度为2-3x106个细胞/ml，倍增时间~24h，存活率>95%，严格维持在27±0.5℃和130 rpm下振荡。除非另有说明，所有培养物均使用ESF921培养基中50 U/ml青霉素和50µg/ml链霉素。对于悬浮培养，可以通过在倒置显微镜下定期观察血细胞仪上的细胞来证实感染。细胞在最初的24小时内表现出增大，随后生长降低（即倍增时间增加），在24-72小时内粒度增加，随后进入细胞裂解，72小时后细胞活力降低。可通过台盼蓝法测定细胞活力。对于平板培养，24-72h内细胞从板表面脱落的现象越来越多。

3. 尽管PBA添加剂需要更小体积的杆状病毒，但建议在没有PBA的情况下使用高滴度（>1 x 108 pfu/ml）。通过改变转染率，可以优化转染效率细胞因子，以获得较高的初始种群滴度，这可能使后续传代的滴度浓度增加。

4. 制备高滴度病毒储备通常是一个反复的过程，可能需要在不同的感染多样性（MOI）下传递P0和P1储备，从0.01到0.1，以提高病毒滴度，以及选择最佳收获时间。MOI是病毒颗粒的斑块形成单位（pfu）与培养细胞数量的比率。通常，P2储备将为蛋白质生产提供足够的容量；然而，如果必要，可以通过另一个通道获得P3储备。不建议使用较高的通道。较长的收获时间可能导致病毒滴度降低，这可能是由于细胞裂解；尽管如此，收获时间可优化以选择最高杆状病毒滴度。

5. 对于杆状病毒滴度估计，必须首先使用杆状病毒滴度试剂盒中提供的已知滴度的对照病毒校准该过程。P0储备液的体积可能不足以进行效价估计，因此应测量P1和P2的滴度，尽管开始该过程需要估计P0储备液的效价（可取106 pfu/ml）。除了使用杆状病毒滴度试剂盒和流式细胞仪方法进行滴度估计外，还可以使用菌斑分析、定量实时PCR和观察感染的活细胞大小来获得病毒滴度（Janakiraman等人，2006年）。

6. 5-HT2AR的产量取决于PBA的体积（最多可达10%）、PBA的添加时间（18-30小时）、病毒添加的MOI（0.001-20）和感染后收获时间（最长2周），此外还有其他各种因素，如Sf9细胞的培养体积和质量。因此，优化这些因素可能是谨慎的，特别是如果扩大杆状病毒储备和节省PBA更经济，反之亦然。此外，如前所述（Mozumder等人，2020年），用PBA培养的培养物中的糖基化程度可以通过改变感染后收获时间来调节。因此，收获时间也可以通过对在感染后收获时间范围内生长的培养物的细胞裂解物进行Western blot分析来优化以选择所需的糖基化量（参见配方13-18，以获得适合的蛋白质印迹缓冲液）。

7. 添加α-碘代乙酰胺以阻断任何游离巯基，目的是防止蛋白质通过非特异性二硫键聚集（Milic和Veprintsev，2015）。α-碘代乙酰胺处理的效果可以通过改变处理量和持续时间来优化，并且如果需要，可以避免（或用合适的替代还原剂替代），尤其是对于其他蛋白质。

8. 饱和结合分析所需的膜蛋白量的选择应避免配体耗尽效应，即结合后配体浓度的下降应最小（小于总配体浓度的~10%）。Bmax的理论估计值提供了每毫克总蛋白的最大结合位点数（fmol）（通过BCA分析获得），可用于估计每个反应的结合配体，从而减少配体。如果观察到配体耗尽，增加反应体积或减少每次反应所用的蛋白质。

食谱

1. LB琼脂平板（用于蓝白菌落选择）

25 g/L鲁里亚贝塔尼肉汤粉

15 g/L琼脂

卡那霉素50µg/ml

10微克/毫升四环素

7微克/毫升庆大霉素

100µg/ml Bluo gal

40µg/ml IPTG

2. Sf9细胞培养基

ESF921培养基

50 U/ml青霉素

50微克/毫升链霉素

3. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH值7.4

10毫米Na2HPO4

1.8毫米KH2PO4

137毫米氯化钠

2.7毫米氯化钾

4. 低张缓冲液

10毫米HEPES（pH值7.5）

10毫米氯化镁

20毫米氯化钾

SIGMAFAST蛋白酶抑制剂鸡尾酒片-使用前立即添加

5. 高渗缓冲液

10毫米HEPES（pH值7.5）

10毫米氯化镁

20毫米氯化钾

1M氯化钠

SIGMAFAST蛋白酶抑制剂鸡尾酒片-使用前立即添加

6. 再悬浮缓冲器

10毫米HEPES（pH值7.5）

10毫米氯化镁

20毫米氯化钾

150毫米氯化钠

SIGMAFAST蛋白酶抑制剂鸡尾酒片-使用前立即添加

7. 增溶缓冲液（用于1:1稀释）

注：对于其他稀释液，调整正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷和胆固醇半琥珀酸的浓度，以分别达到0.5%（w/v）和0.2%（w/v）的最终浓度。

50毫米HEPES（pH值7.5）

150毫米氯化钠

1%（w/v）正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷

0.4%（w/v）半琥珀酸胆固醇酯

SIGMAFAST蛋白酶抑制剂鸡尾酒片

8. 平衡缓冲液（或结合缓冲液，与树脂中蛋白质的装载量相匹配）

30毫米HEPES（pH值7.5）

10毫米氯化镁

20毫米氯化钾

400毫米氯化钠

0.5%（w/v）正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷

0.2%（w/v）半琥珀酸胆固醇酯

9. 冲洗缓冲液I

50毫米HEPES（pH值7.5）

800毫米氯化钠

0.1%（w/v）正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷

0.02%（w/v）胆固醇半琥珀酸酯

20毫米咪唑

10%（v/v）甘油

10. 冲洗缓冲液II

50毫米HEPES（pH值7.5）

150毫米氯化钠

0.05%（w/v）正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷

0.01%（w/v）半琥珀酸胆固醇酯

50毫米咪唑

10%（v/v）甘油

11. 洗脱液

50毫米HEPES（pH值7.5）

150毫米氯化钠

0.05%（w/v）正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷

0.01%（w/v）半琥珀酸胆固醇酯

250毫米咪唑

10%（v/v）甘油

12. 放射性配体结合缓冲液

50毫米Tris HCl（pH值7.4）

10毫米氯化镁

0.1毫米EDTA

13. SDS-PAGE运行缓冲区

25毫米Tris

192毫米甘氨酸

0.1%十二烷基硫酸钠

14. 考马斯亮蓝染色液

40%（v/v）甲醇

10%（v/v）冰醋酸

1克科马斯亮蓝

15. SDS-PAGE脱渍液

40%（v/v）甲醇

10%（v/v）冰醋酸

16. 免疫印迹转移缓冲液

25毫米Tris

192毫米甘氨酸

20%甲醇

17. TBST缓冲液（Tris缓冲盐水和吐温20）

20毫米Tris，pH值7.5

150毫米氯化钠

0.1%吐温20

18. 阻塞缓冲器

TBST缓冲液中5%（w/v）脱脂奶粉

致谢

作者感谢Amitabha Chattopadhyay教授及其团队成员对该项目的讨论，感谢Mita Chatterjee Debnath博士访问放射性设施，感谢Tanmoy Dalui先生进行流式细胞仪数据采集和分析。我们感谢CSIR印度化学生物研究所中心仪器设备（CIF）的支持。研究经费来自DST（向S.Mukherjee提供Ramanujan奖学金，并向S.Mozumder、G.Mahesh和K.Srinivasan提供SPM奖学金）和CSIR（研究拨款编号BSC0113）。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

工具书类

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