材料和试剂

1. 6厘米碟子（康宁公司，产品编号：430166）

2. 硅烷制备载玻片（Sigma-Aldrich，目录号：S4651)

3. HeLa单元（ATCC，CCL2，目录号：CCL2）

4. 抗BrdU克隆BU1/75（ICR1）（AbdSerotec，目录号：OBT030Cx）

5. Alexa Fluor 488共轭鸡抗鼠（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-21470）

6. 抗磷酸化RPA32 S4/8抗体（Bethyl Laboratories，目录号：A300-245）

7. 罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640 Medium（赛默飞世尔科学公司，目录号：11875093）

8. 10%胎牛血清（FBS），欧盟批准（南美）（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：10270-106）

9. 青霉素链霉素（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：15070-063）

10. 胰蛋白酶EDTA（赛默飞世尔科技公司，目录号：25200056）

注：HeLa细胞培养于添加10%FBS、1μg/ml青霉素和1µg/ml链霉素的RPMI 1640中。

11. 5-碘-2′-脱氧尿苷（IdU）（Sigma-Aldrich，目录号：I7125 4°C下储存）,

12. （S） -（+）-喜树碱（CPT） (Sigma-Aldrich，目录号：C9911，-20°C下储存）

13. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：71725，RT储存）

14. 特里斯(Sigma Aldrich，目录号：17926，RT储存）

15. EDTA 0.5 M pH 8.0（赛默飞世尔科技公司，目录号：AM9262，4°C下储存）

16. 磷酸二钠（Na2HPO4）（Sigma-Aldrich，目录号：255793，室温储存）

17. 磷酸二氢钾（KH2PO4）（Sigma-Aldrich，目录号：P0662，RT储存）

18. 氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541，室温储存）

19. 盐酸39.5%（HCl）（Carlo Erba试剂，目录号：405761，RT储存）

20. 甲醇（Carlo Erba试剂，目录号：528101，RT储存）

21. 冰醋酸（Carlo Erba试剂，目录号：401424，室温储存）

22. 无水乙醇（Carlo Erba试剂，目录号：414607，室温储存）

23. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9418，4°C保存）

24. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888，室温储存）

25. 延长金防褪色试剂（赛默飞世尔科技公司，目录号：P36935，室温储存）

26. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）

27. 铺展缓冲液（见配方）

设备

1. 蔡司Axiovert LSM100M共焦显微镜（德国卡尔蔡司）

2. 二氧化碳培养箱（松下，目录号：MCO-18AC）

3. 离心机

软件

1. Adobe Photoshop CS5

2. GraphPad Prism 8软件

程序

A、智能分析的表示

图1显示了SMART分析的一个代表性方案。

图1。智能分析示意图。首先，用IdU标记HeLa细胞24小时，然后进行CPT处理；在培养结束时，对细胞进行胰蛋白酶处理，并以2.5×105个细胞/ml的浓度稀释。将已标记和未标记的细胞按1:8的比例混合，并将2.5μl的混合液点在载玻片的上部；在用7.5μl扩散缓冲液孵育后，将载玻片从末端倾斜，以允许DNA纤维的伸展。

图2显示了通过共焦显微镜获得的代表性图像。

图2。智能技术的代表性图像。面板A显示用1μM campthotecin处理1小时的HeLawt或siEXOI细胞的两张图像；随后通过Fiji软件分析协议中报告的SMART分析图像。如图B所示，在DNA损伤时参与单链DNA生成的主要外切酶之一，EXOI的沉默使处理后的DNA长度缩短了两倍。图3B报告了每种情况下测量的纤维长度的平均值±标准偏差（μm）。

B、智能分析协议

1. 在RPMI1640培养基中培养HeLa细胞，培养基中添加10%FBS、1μg/ml青霉素和1µg/ml链霉素。

2. 在6 cm培养皿中用10μM的IdU在80%的浓度下处理HeLa细胞（我们在0.2 N NaOH中制备28 mM的IdU储备溶液），并在37°C的标准5%CO2培养箱中培养24小时。

注：与BrdU或其类似物（如IdU）的孵育时间必须根据细胞周期的长短来确定。脉冲标记时间需要允许BrdU在一个完整的细胞周期内结合。

3. 准备一个6厘米的HeLa细胞培养皿，在80%的汇合处作为非IdU标记。

注：用非标记细胞稀释IdU标记细胞对于减少玻片上有标记纤维的存在至关重要，有利于正确的免疫荧光分析。

4. 用1μM喜树碱在RPMI 1640培养基中处理HeLa细胞，RPMI 1640培养基中添加10%FBS、1μg/ml青霉素和1µg/ml链霉素，并在37℃下在5%CO2培养箱中培养2 h。

注：DNA损伤剂的孵育时间和药物浓度随细胞类型的不同而变化。作为对照，使用抗磷酸化RPA32 S4/8抗体（Bethyl Laboratories）在不同条件下进行DNA损伤反应分析，评估DNA损伤和切除。

5. 将HeLa细胞从培养皿中分离出来，用1ml胰蛋白酶EDTA溶液在37℃的标准5%二氧化碳培养箱中培养5分钟。

6. 用3 ml RPMI 1640培养基灭活胰蛋白酶EDTA溶液，添加10%FBS、1μg/ml青霉素和1µg/ml链霉素。

7. 以800 x g（rcf）离心分离HeLa细胞5分钟。

8. 用5 ml冰冷PBS洗涤细胞颗粒，然后以800 x g（rcf）离心5分钟。重复步骤B8两次。

9. 用2.5×105个细胞/毫升的冰冷PBS使HeLa标记的细胞复苏。准备另一个相同浓度（2.5×105个细胞/ml）的未标记细胞混合物。

10. 将标记细胞与未标记细胞按1:8的比例混合稀释。

11. 将2.5μl细胞与7.5μl扩散缓冲液直接混合在载玻片的上部。

12. 在室温（RT）下培养10分钟。

13. 将滑块从两端倾斜15°。

14. DNA涂片风干，大约10分钟。

15. 将DNA纤维固定在-20°C的3:1甲醇/乙酸中15分钟。

16. 在PBS中清洗载玻片两次。

注：PBS的体积取决于用于浸泡载玻片的容器

17. 将DNA纤维在70%乙醇和30%水中于4℃下孵育过夜。

18. 用PBS清洗载玻片两次。

注意：这一步对于在阻断DNA纤维之前清除所有乙醇残留物是至关重要的。PBS的体积取决于用于浸泡载玻片的容器。

19. 用PBS+5%BSA在RT条件下30分钟阻断DNA纤维。

注：PBS的体积取决于用于浸泡载玻片的容器

20. 用1:300抗BrdU克隆BU1/75（ICR1）在37℃下培养载玻片1小时。

21. 用PBS清洗载玻片两次。

注：PBS的体积取决于用于浸泡载玻片的容器。

22. 用1:400 Alexa Fluor 488结合鸡抗鼠培养载玻片。

23. 用PBS清洗载玻片两次。

注：PBS的体积取决于用于浸泡载玻片的容器。

24. 在载玻片上涂上长效金防腐蚀剂。

25. 通过共焦显微镜（我们使用蔡司LSM100）和至少63倍油浸物镜分析载玻片。

数据分析

分析每种情况下大约150根光纤，并通过斐济图像软件分析以像素为单位测量光纤长度。

要获得以μm为单位的纤维长度：

1. 首先从插件窗口下载LSM工具箱。

注意：这是一个重要的步骤，直接打开的共焦图像在.lsm格式没有jpg转换。

2. 打开.lsm文件，如下图3所示，有图片的分辨率和以μm为单位的转换。

图3。使用斐济软件打开的代表性图像在左上角显示像素分辨率和μm转换；在图形的下角显示μm尺寸。 A、千分尺转换成千碱基取决于DNA类型、核小体和染色质纤维装配；对于HeLa细胞和结合分析，在S期，1μm的DNA纤维长度应大约对应于2.59 kb，如Jackson和Pombo（Jackson和Pombo，1998）和其他人（Bianco等人，2012）最初报告的那样；Jamroskovic等人，2020年；Petermann等人，2008年）。B、 DNA纤维的放大图像，以红色（开始）和蓝色（结束）显示分析的DNA束的尺寸。C、黄色箭头在图的下半部分显示了DNA纤维的方向和长度；鉴于其他DNA纤维数量较多，这些纤维不能用于测量，这减少了单个DNA特征的识别。红色箭头表示密度和荧光的纤维，这是分析单个DNA性状的最佳选择。D、斐济软件分析中直线工具的屏幕截图示例。

3. 从主窗口选择一条直线并测量光纤的长度。斐济软件的直线工具提供通过x、y和角度坐标确定的选定光纤的长度；参见图3D中的直线工具屏幕示例。

4. 在本例中，绘制了从三个独立实验中计算出的平均纤维长度±标准偏差。根据之前的工作，通过使用GraphPad Prism 8软件的学生t检验来评估统计显著性（Cruz García等人，2014年）。然而，在通过GraphPad Prism或类似程序检查数据的正态性时，必须根据实验计划来确定更具信息性的数据表示方式和统计分析的适当测试。

食谱

1. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）

137毫米氯化钠

2.7毫米氯化钾

10毫米Na2HPO4

1.8毫米KH2PO4

2. 扩展缓冲器

0.5%十二烷基硫酸钠（SDS）

200mm Tris HCl pH值7.4

50毫米EDTA pH值8

致谢

我们感谢斯巴罗健康研究组织(http://www.shro.org)为它的支持。

我们感谢安德烈Cruz García、AnaLópez Saavedra和Pablo Huertas首先开发了SMART分析法（Cruz-García等人，2014年），从中修改了本协议。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

工具书类

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