材料和试剂

1. 解剖板（发泡胶板）

2. 6孔组织培养（TC）板（Falcon，目录号：353046）

3. 固定介质（Diagnostic BioSystems，目录号：K024）

4. 11毫米x 11毫米盖滑片（IMEB，目录号：CG1-2450）

5. 60毫米TC板（猎鹰，目录号：353002）

6. 100毫米TC 平板（Falcon，目录号：353003）

7. 1.5毫升Eppendorf管（DOT Scientific，目录号：RN1700-GMT）

8. 15毫升聚苯乙烯离心管（Falcon，目录号：352095）

9. 50 ml高澄清度PP离心管（Falcon，目录号：352098）

10. 70 µm细胞过滤器（Falcon，目录号：352350）

11. 10毫升血清移液器（Falcon，目录号：357551）

12. 4-6周龄的老鼠

13. 磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）（Sigma-Aldrich，目录号：P3813）

14. Tween-20（VWR，目录号：97062332）

15. Dispase II（罗氏应用科学，目录号：04942078001）

16. II型胶原酶（沃辛顿，目录号：LS004177）

17. 0.25％胰蛋白酶（Gibco，目录号：25200056）

18. 胎牛血清（FBS）（Hyclone，目录号：SH3007103）

19. 马血清（HS）（Hyclone，目录号：SH3007403）

20. Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Sigma-Aldrich，D5796）

21. Ham's F-10营养混合物（Gibco，目录号：11550043）

22. I型胶原（Sigma-Aldrich，目录号：C7661）

23. 基质胶（Corning，目录号：354234）

24. 多聚甲醛粉末（Polysciences，目录号：00380）

25. 4'，6-二mid基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（Sigma-Aldrich，目录号：D8417）

26. 青霉素-链霉素溶液（Hyclone，目录号：SV30010）

27. 甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898）

28. 乙醇（Decon Labs，目录号：V1001）

29. 山羊血清（Jackson ImmunoResearch，目录号：005-000-121）

30. 牛血清白蛋白（BSA）（Gemini Bio-Products，目录号：700-105P）

31. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）

32. 叠氮化钠（Fisher Scientific，目录号：S2271）

33. 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（Promega，目录号：G5071）

34.一抗：

Pax7（发展研究杂交瘤银行）

MyoD（圣克鲁斯生物技术，目录号：sc-760）

MyoG（F5D）（发展研究杂交瘤库）

MyHC（MF20）（发育研究杂交瘤银行）

35. 二抗：

山羊抗小鼠IgG1，Alexa Fluor 568（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-21124）

山羊抗小鼠IgG2b，Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-21141）

山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-11034）

36. 70％乙醇（请参阅食谱）

37. I型胶原包被的TC板（请参阅食谱）

38. 涂有Matrigel的TC板（请参阅食谱）

39. 消化培养基（请参阅食谱）

40. 中和介质（请参见食谱）

41. 生长培养基（请参阅食谱）

42. 鉴别介质（请参见食谱）

43. 0.05％胰蛋白酶（请参阅食谱）

44. 4％聚甲醛（PFA）（请参阅食谱）

45. 100 mM甘氨酸溶液（请参阅食谱）

46. 阻塞缓冲区（请参见食谱）

47. bFGF库存（请参阅食谱）

48. PBS-T（请参阅食谱）

设备

解剖剪刀，10厘米，直（WPI，目录号：14393-G）
直镊4.75英寸（Excel，目录号：3-S-SE）
T型针（业务来源，目录号：32351）
秋千式离心机（Thermo Scientific，型号：CL2）
高压灭菌器（Beta Star生命科学，型号：小型消毒器系列26英寸x 26英寸）
II类，A2型生物安全柜（Labconco，目录号：3440009）
恒温水浴（Thermo Fisher Scientific，目录号：TSGP02）
细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：Heracell 240）
14.0 MP数码USB显微镜相机（OMAX显微镜，目录号：A35140U3）
Leica DMI 6000B荧光显微镜（Leica Microsystems，型号：DMI 6000 B）
Lumen 200荧光照明系统（Prior Scientific，型号：Lumen 200）
Coolsnap HQ CCD相机（光度学，型号：Coolsnap HQ）
超级移液器控制器（Corning，目录号：4099）
10μl，200μl，1,000μl移液器（Gilson，型号：Pipetman）

软件

Photoshop软件（例如，Photoshop CC）

程序

Prepar 通货膨胀之前隔离
70％乙醇（请参见配方1）。
高压灭菌1.5 ml Eppendorf管。
用70％的乙醇消毒工具。
I型胶原蛋白可覆盖细胞培养板（请参见配方2）。
用基质胶包被细胞培养板（参见配方3）。
板涂
在室温下，在100 mm平板上涂5 ml I型胶原，以完全覆盖平板30分钟。30分钟后，将I型胶原转移到原始试管中，然后风干平板。该板可以存储在A2生物安全柜中，直到可以使用为止。该板将用于预镀。
注意：I型胶原蛋白可以重复使用，以备将来使用。

在室温下，用60 ml的板用3 ml的Matrigel涂膜完全覆盖板20分钟。20分钟后，将Matrigel转移到原始试管中，然后风干板。建议d在Matrigel干燥后立即使用板。该板将用于分化成肌细胞。
注意：Matrigel可以重复使用，以备将来使用。

消化介质（请参见配方4）。
中和介质（请参见配方5）。
生长培养基（见配方6）。
分化培养基（参见配方7）。
0.05％胰蛋白酶（请参见第8条）。
4％多聚甲醛（PFA）固定液（请参见第9条）。
100 mM甘氨酸溶液（请参见配方10）。
阻塞缓冲区（请参见配方11）。
bFGF（请参见第12条）。
PBS-T（请参阅第13条）。

肌肉解剖
在实验室中，按照批准的方案牺牲4-6周龄的小鼠。在这种情况下，使用颈脱位。
注意：无需在A2生物安全柜内进行鼠标解剖。

用70％的乙醇喷洒鼠标，然后将鼠标U钉在解剖板上。
用消毒的剪刀剪掉脚踝处的皮肤。将鼠标置于腹部横向位置时，使用镊子露出股四头肌。用冷PBS收集肌肉。翻转鼠标并将其背面朝上固定。去除下半身的皮肤，解剖两条后肢骨骼肌，然后将它们放入冷的PBS中。
将解剖工具和装有肌肉的平板转移到生物安全柜中。用70％的乙醇擦拭所有解剖工具，以避免来自生物安全柜外部的潜在污染。

D：\重新格式化\ 2020-6-1 \ 1903025--1447 Shihuan Kuang 819878 \视频1.jpg

视频1.小鼠的肌肉解剖。该视频演示了如何隔离后肢肌肉以及如何去除肌肉周围的上皮细胞和脂肪以及肌肉内神经束的详细过程。将肌肉转移到装有PBS的60 mm平板中后，将其在PBS中洗涤数次，用剪刀或剃须刀切碎，并用II型胶原酶消化，以从肌纤维中释放MuSC。

肌肉消化
用PBS清洗后肢肌肉，直至无毛。
注意：建议洗几次直到头发完全从肌肉组织上去除。

在薄纸上吸干肌肉。
将肌肉转移到1.5 ml Eppendorf管中。
使用1.5毫升Eppendorf管内的解剖剪刀将肌肉切碎。
注意：细碎的肌肉会产生更多的成肌细胞。

转移剁碎肌成一个15毫升Falcon管。
消化与消化介质肌肉（5毫升，每小鼠）一个37℃的水浴中12分钟，振摇管每2分钟。
用10毫升血清移液器混合消化过的肌肉，直到可以平稳地吸取混合物。
消化在另一个12分钟的37℃水浴中，摇动管每2分钟。
加入5 ml中和培养基停止消化。
在上面放置一个70μm的灭菌的细胞过滤的一个50ml试管中，和预湿用3ml中和介质的过滤器。
注意：预润湿对于细胞顺利通过细胞过滤器很重要。

使用10 ml血清移液器收集含有细胞混合物的培养基，并通过70μm无菌细胞过滤器过滤。
注意：Ç ollect细胞连接，使用1个毫升吸管ltrate下方细胞滤网。

在室温下以2,000 xg 旋转细胞混合物5分钟。
使用真空吸管丢弃上清液。
注意：请勿抽吸细胞沉淀。

用5 ml生长培养基重悬细胞沉淀。
将一只小鼠的细胞播种到未涂覆的100 mm培养板中，并在37°C下孵育4天，并每天在预先存在的培养基上添加5 ml生长培养基，持续3天。
注：细胞混合物和碎纤维的异质群体将在显微镜下被可视化上d 着y 4。

原代成肌细胞分离和预铺
上d 着y 4，小纤维片具有圆形主成肌细胞可以看出，和细胞现在准备好进行预镀。
机械分离附着于细胞的通过使用10ml的血清吸液管并转移到移液板的底部一个50ml管中。漂浮细胞也转移到50ml管中。
注意小号：

该方法仅利用机械分离，因此不需要胰蛋白酶。
通过在显微镜下检查，确认大多数细胞是否从板上脱落。
将50 ml试管以2,000 x g 离心5分钟。
注意：在不施加制动的情况下让离心机停止。这通常需要几分钟。

从50毫升试管中吸出培养基。
在仔细并孵育加入3 ml胰蛋白酶到50ml管中重悬细胞一个37℃的水浴中5分钟。
注意：细胞仍然是异质种群。

将50 ml试管以2,000 x g 离心5分钟。
弃去上清液而不干扰沉淀，并用5 ml生长培养基重悬细胞
转移到一个未涂覆的培养板中，孵育37℃的培养箱中45分钟。
45分钟后，将上清液从未包被的培养板转移到胶原包被的板中。
注意：成肌细胞不会在短时间内粘附在培养板上，因此，转移上清液有助于从培养皿底部的其他细胞（如成纤维细胞）中纯化成肌细胞。

可以重复执行步骤D2-D9（预镀）以获得纯度≥95％的成肌细胞。
注意：预镀可以重复两次以增加成肌细胞的纯度。成肌细胞应看起来较小且呈圆形，而成纤维细胞应看起来呈细长形，有时具有双极性过程。

培养与差异化
在生长培养基中培养纯化的原代成肌细胞，每2天更换一次培养基。保持细胞密度在80％融合以下，以防止原代成肌细胞融合。
注意：预铺步骤后不需要I型胶原涂层板。

分化之前，在室温下的通风橱中用3 ml Matrigel覆盖60 mm培养板20分钟。
取出Matrigel后，在通风橱中完全蒸发30分钟。
注意：建议不要重复使用Matrigel 5次以上，并且在不使用时应存放在4 °C或冰上。

在室温下用1 ml胰蛋白酶孵育细胞1分钟，以将原代成肌细胞和种子细胞分离到基质胶包被的板上。
注意：将原代成肌细胞在含有4 ml生长培养基的Matrigel包被的板上培养，直到达到所需的细胞密度。

一旦融合达到80-90％，将成肌细胞培养基改为分化培养基。
在接下来的三天内，用分化培养基维持原代成肌细胞。
注意：必须在显微镜下每日监测原代成肌细胞的形态变化。在第3天可以观察到从圆形原代成肌细胞到细长肌管的明显形态学变化。

原代成肌细胞的免疫染色
将高压灭菌的盖玻片放在6孔板的孔中。
高压灭菌的盖玻片上的种子成肌细胞
注意小号：

第二天，应在盖玻片上看到附着的成肌细胞。
成肌细胞可以培养数天至所述期望的汇合。
从抽吸生长培养基的培养板中。
通过添加1 ml 4％PFA固定贴壁细胞，并在室温下孵育15分钟。
抽吸4％PFA从所述培养板中。
在室温下用1 ml PBS轻轻清洗3次，每次5分钟。
从培养板上吸出PBS。
加入1 ml 100 mM甘氨酸，在室温下孵育10分钟。
除去100 mM甘氨酸，在室温下用1 ml PBS洗涤5分钟。
重复š 总共3次洗涤TEP 9。
加入1 ml封闭缓冲液，在室温下孵育1-2小时。
加入适量的一抗（Pax7-1：10，MyoD-1：300在封闭缓冲液中）并在4°C下孵育过夜。
在室温下用1ml PBS-T 轻轻清洗3次，每次5分钟。
（山羊抗兔IgG为MF20，DAPI山羊抗小鼠IgG1对的Pax7，MyoG基因，山羊抗小鼠IgG2b为MyoD的添加二级抗体的适当量- ：1 1 ，在室温下搅拌1 000在PBS-T） H。
注意：次生胫骨对光敏感，因此以下步骤应在黑暗的房间中执行。

在室温下用1 ml PBS -T 轻轻清洗5次，每次5分钟。
注意：建议多洗手以减少背景污染。

用一滴安装介质安装盖玻片并使其干燥。
在荧光显微镜下评估染色。

数据与分析

该方案包括在分化前和分化后，用特异性成肌标志物免疫染色后体外观察和评估成肌细胞。通过添加4％PFA固定在生长培养基中培养的原代成肌细胞，并用Pax7和MyoD染色，这是未分化成肌细胞的标志物（图1）。将原代成肌细胞接种到基质胶包被的平板上后，成肌细胞融合度达到80％后，将生长培养基更改为分化培养基。分化3天后，将成肌细胞固定并分别用MyoG和MF20染色，这是成肌分化早期和晚期的标志（图2）。出于研究目的，可用其他抗体对成肌细胞进行染色，但建议与一种成肌标记物共染色以确认成肌细胞的分化状态。

D：\重新格式化\ 2020-6-1 \ 1903025--1447 Shihuan Kuang 819878 \ Figs jpg \ 1-word.jpg

图1 。未分化的原代成肌细胞的相衬成像和免疫荧光染色。代表性相衬图像（20x）展示了未分化的原代成肌细胞（A）的形态。细胞培养一天后，将原代成肌细胞固定以进行免疫染色。使用Pax7（红色）和MyoD（绿色）成肌标记物对未分化的原代成肌细胞进行代表性免疫荧光成像。细胞核用DAPI（蓝色）染色（B）。

D：\重新格式化\ 2020-6-1 \ 1903025--1447 Shihuan Kuang 819878 \ Figs jpg \ 2-word.jpg

图2 。分化3天后肌管的相衬图像和免疫荧光染色。A. 分化的肌管形态的代表性相衬图像（20x）。B. P rimary成肌细胞上的基质胶包被的平板中培养3天，以形成完全分化的肌管。为了进行免疫染色，将MyoG（红色）和MF20（绿色）用作成肌标记，进行分化以可视化多核肌管。细胞核用DAPI（蓝色）染色。

记事簿

从幼鼠（3-4周龄）分离的原代成肌细胞的产量高于成年鼠（2个月龄）
当务之急是在解剖和清洗步骤中将头发完全去除，因为多余的头发可能是主要培养物污染的来源。
精细地切成小片小号ö 在切碎步骤f肌肉组织（步骤C 4）是有帮助的成肌细胞增加的产量。
如果成肌细胞的纯度低于95％，则可以进行额外的预镀。
对于染色，可以在室温下将一抗孵育1小时，但强烈建议在4°C下孵育过夜。

菜谱

70％乙醇
加70毫升100％乙醇和30毫升的DDH 2 ö 。室温保存

I型胶原蛋白涂层
将0.1％的I型胶原蛋白溶于0.1 M乙酸中，并在室温下搅拌混合物1 h，制成10 x 储备液
将10 x I型胶原原液在0.1 M乙酸中稀释至1 x ，以获得0.01％I型胶原
储存在4°C
涂料基质胶
加入1.4体积的DMEM培养基以稀释基质胶

对于2.4毫升溶液，用1.4毫升DMEM培养基稀释1毫升Matrigel，在4°C下储存

消化培养基
通过将分散酶II和II型胶原酶分别溶于浓度为2.4 U / ml 和2.9 U / ml的PBS中制备消化培养基，并补充2.5 mM CaCl 2

对于50 ml的消化介质，d 溶解125 mg分散酶，0.5 g II型胶原酶，然后添加125μl1 M CaCl 2 。储存在-20°C

中和介质
F-10 Ham培养基中补充了20％FBS和1％青霉素-链霉素。

对于50 ml中和培养基，将在39.5 ml F-10 Ham's培养基中补充10 ml FBS和500μl青霉素-链霉素。储存在4°C

生长培养基
F-10 Ham's培养基补充了20％FBS，4 ng / ml碱性成纤维细胞生长因子和1％青霉素-链霉素

对于50 ml生长培养基，将在F-10 Ham's培养基中补充10 ml FBS，50μlbFGF储备液和500μl青霉素-链霉素。储存在4°C

分化培养基
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）补充有2％的马血清和1％的青霉素-链霉素。

对于50 ml分化培养基，DMEM将补充1 ml马血清和500μl青霉素-链霉素。储存在4 °C

0.05％胰蛋白酶
对于50 ml 0.05％的胰蛋白酶，在40 ml高压灭菌的PBS中加入10 ml的0.25％t胰蛋白酶

储存在4°C

4％多聚甲醛（PFA）
将4％PFA（m / v）溶于PBS溶液，在60℃下搅拌混合物 °C水浴，并通过添加NaOH将pH值提高至7.4，以使PFA粉末更易溶解

100毫升4％PFA，吨AKE 80 毫升PBS溶液，添加4 克对的FA粉末，如上所述溶解PFA，并调整体积至100毫升，PBS溶液中。储存在4 °C

100 mM甘氨酸溶液
将甘氨酸以100 mM 的浓度溶于PBS

对于50 ml的甘氨酸溶液，d 将3.75 g的甘氨酸溶解在50 ml的PBS中。储存在4°C

阻塞缓冲区
PBS补充有5％山羊血清，2％BSA，0.2％Triton X-100、0.1％叠氮化钠

对于100 ml封闭缓冲液，将5 ml山羊血清，2 g BSA，2 ml 10％Triton X-100和0.1 g叠氮化钠添加到PBS中。分装并储存在-20°C

bFGF库存
通过以4:1的浓度在无血清培养基中溶解的bFGF制备的bFGF库存微克/毫升（1 ，000 x）的

对于4μg/ ml bFGF储备液，将4μgbFGF溶于1 ml无血清DMEM中。分装并储存在-20°C

PBS-T
加入PBS中的0.1％Tween-20

对于1升PBS-T溶液1 ml Ť 吐温-20在1升中加入PBS。室温保存

致谢

该方案改编自我们之前发表在《自然通讯》（Yue 等人，2017）和《生命》（Jia 等人，2019）中的工作。这项工作得到了美国国立卫生研究院（R01AR071649）和美国农业部国家粮食与农业研究所（NC-1184）的资助。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

在动物研究中执行的所有程序均由普渡大学的动物护理和使用委员会（PACUC）协议编号1112000440指导。

参考资料

NA，Dumont和MA，Rudnicki（2016）。靶向肌肉干细胞固有缺陷来治疗杜氏肌营养不良症。NPJ Regen Med 1。
贾Z，聂Y，岳F，孔Y，顾丽，加文，TP，刘新，匡光（2019）。小鼠胚胎肌发生和成年肌肉再生中Polo样激酶1的需求。Elife 8：e 47097 。
Kuang，S.，Kuroda，K.，Le Grand，F.和Rudnicki，MA（2007）。肌肉中卫星干细胞的不对称自我更新和承诺。细胞129（5）：999-1010。
Kuang，S.，Gillespie，MA和Rudnicki，MA（2008）。生态位调节肌肉卫星细胞的自我更新和分化。细胞干细胞2（1）：22-31。
Liu L.，Cheung，TH，Charville，GW和TA Rando（2015）。通过荧光激活细胞分选法分离骨骼肌干细胞。Nat Protoc 10（10）：1612-1624。
N.Motohashi，Y.Asakura和A.Asakura （2014）。肌肉卫星细胞的分离，培养和移植。 Ĵ OVE （86）。DOI：10.3791 / 50846。
马萨诸塞州的鲁德尼基（Rudnicki），F。勒格兰德（Le Grand），I。麦肯内尔（McKinnell）和S. 肌肉干细胞功能的分子调控。冷泉Harb Symp Quant Biol 73：323-331。
Scheffer ，G 。和Yablonka-Reuveni ，Z。（2005）。骨骼肌肌纤维的分离和培养，作为分析卫星细胞的一种手段。方法分子生物学290：281 - 第304
Yin，H.，Price，F.和Rudnicki，MA（2013）。卫星细胞和肌肉干细胞的生态位。生理学杂志93（1）：23-67。
岳峰，毕鹏，王成，珊婷，聂妮，拉特里夫，TL，加文，TP和匡南（2017）。Pten对于静止和维持成年肌肉干细胞是必需的。Nat Commun 8：14328。