材料和试剂

耗材
培养皿，聚苯乙烯，尺寸150 mm×15 mm，无菌
6孔透明多孔板，无菌
Kimwipes TM
低保留提示

用料
拟南芥种子，包括控制和治疗或突变组
强烈建议，以包括与在mRNA稳定性的缺陷作为阳性对照，突变体例如，ect2-1 （SALK_002225）。

试剂种类
液氮
RNaseZap TM （赛默飞，目录号：AM9780）或ELIMINase ® （DeconLabs ，目录号：1101）
Murashige 和Skoog基础培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M5519 ）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）
家用漂白剂（5.25％w / v次氯酸钠）
吐温® 20（Sigma-Aldrich公司，目录号：P9416 ）
无核酸酶的水
虫草素（Sigma-Aldrich，目录号：C3394）
RNA提取试剂盒（RNeasy Plant Mini Kit）（QIAGEN，目录号：74904）
cDNA合成试剂盒（iScript cDNA合成试剂盒）（Bio-Rad，目录号：1708890）
qPCR试剂盒（SYBR TM Green PCR Master Mix）（ThermoFisher，货号：4309155）
qPCR引物（在Prim er3Plus 上设计qPCR引物（Untergasser 等人，2012），并从Integrated DNA Technology订购qPCR引物）
注意：设计qPCR引物，使其更接近要检测的mRNA 的3 '端。QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒，Bio-Rad iScript cDNA合成试剂盒和ThermoFisher SYBR TM Green PCR Master Mix经过测试和效果良好，因此此处仅作为推荐试剂盒列出。但是，其他合适的RNA提取和RT-qPCR试剂盒也可用于此方案。

设备

多通道移液器
研钵和研杵
高压釜
-20°C冷冻室
拟南芥生长室
VWR ® 标准轨道摇床，3500（VWR，Ç atalog号：89032-092）
Eppendorf台式离心机5418，非制冷，配有转子FA-45-18-11和转子盖，230 V / 50-60 Hz（Eppendorf，目录号：5418000017）
Applied Biosystems TM QuantStudio TM 5实时PCR系统（ThermoFisher，目录号：A34322）或Bio - Rad CFX96触摸实时PCR检测系统（Bio - Rad，目录号：1855196）

软件

Primer3Plus（A.Untergasser ，https：//primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi ）
Excel（微软）
Applied Biosystems TM 分析软件或Thermo Fisher Cloud（Thermo Fisher Scientific，可在此处获取）

程序

准备试剂和缓冲液
注意：在根据实验设置开始试剂制备之前，计算所需的M S培养基和虫草素的量。大约需要50 ml MS培养基才能制备一块150 mm的平板。六孔板的每个孔需要约3 ml MS培养基。在每个时间点，每个样品至少应包括两个重复样品。根据幼苗的大小，六孔板的一个孔中可容纳约10至20个幼苗。

按照ABRC 拟南芥方案（Rivero et al。，2014）中所述，使用150 mm培养皿准备1 × MS 培养基板。准备好的板可以包装起来并在4°C下保存至少一个月。
通过将1 × MS培养基进行两倍稀释来制备0.5 × MS液体生长培养基。不要添加琼脂。高压灭菌的培养基可以在4°C下保存至少一个月。
制备种子表面灭菌溶液：用蒸馏水使用50％家用漂白剂与2.6％w / v的次氯酸钠的终浓度制备溶液，添加吐温® 20至0.05％的最终浓度。
将虫草素溶于无核酸酶的水中，使原料浓度达到0.6M。在-20°C下储存0.6 M虫草素原液。
在无核酸酶的水中将qPCR引物稀释至100μM 。储存在-20°C。

准备植物材料
将种子在表面灭菌溶液中浸泡5至10分钟，以将其在微量离心管中灭菌。用无菌蒸馏水冲洗五至七次以除去所有漂白剂（Rivero 等人，2014）。
将拟南芥种子（对照组和突变组，如图1所示）以每1 cm 2 约1个种子的密度播种到1x MS琼脂平板上，以利于随后的幼苗转移过程中的操作。冷分层后，将板垂直放置在生长室中，从而防止根生长到固体培养基中。按照ABRC 拟南芥方案，在无菌条件下生长拟南芥约12天（Rivero 等人，2014）。
D：\ Reformatting \ 2020-5-6 \ 1902964--1437贾天然819931 \ Figs jpg \ Figure1.jpg

图1.在拟南芥中使用RT-qPCR进行RNA稳定性测量的工作流程图。将12天大的拟南芥野生型和突变体全苗从MS培养基琼脂板转移到装有0.5 × MS液体培养基的六孔板中，并孵育过夜（注意：液体的MS中只会浸入根）。第二天，加入虫草素至终浓度为0.6mM，并在虫草素处理后的指定时间点收集幼苗用于RNA提取。然后进行RT-qPCR确定RNA水平，并使用统计分析确定野生型和突变RNA稳定性之间的显着差异。

注意：长时间灭菌可能会杀死一些拟南芥突变体。按照ABRC 规程，拟南芥的幼苗也可以在液体培养基中生长（Rivero等，2014）。如果gr 在液体培养基中的六孔板中占有一席之地，请跳过第1天的步骤，然后按照第2天第1步中的说明将虫草素直接添加到六孔板中。

实验步骤
第一天

用无菌镊子将拟南芥整个幼苗转移到六孔板中，每孔在组织培养罩中加3 ml 0.5 × MS培养基。在转移过程中要注意不要损坏幼苗的根部。
在拟南芥生长室或室内以120 rpm的振动器孵育平板，以平衡幼苗过夜。

第二天

注意：如果是初次使用这些试剂盒，请在开始实验之前阅读RNA提取试剂盒，cDNA合成试剂盒和qPCR试剂盒的完整规程。使用RNaseZap TM （Invitrogen）或ELIMINase ® （DeconLabs ）擦拭和净化所有移液器和工作站。

加入虫草素（Sigma-Aldrich）的终浓度为0.6 mM（0.6M储备液的1至1,000稀释液），并处理所需的时间长度（例如0分钟，30分钟，90分钟，150分钟，210分钟，270分钟，如图1所示。
注意：可以先进行最长的处理（例如，本实验中为270 分钟），然后根据所需的处理时间长度添加虫草素，最后同时收集所有样品（图1和2）。

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图2.虫草素治疗时程分析的示意图

收集幼苗并在Kimwipes TM 上吸干以清除多余的液体。
立即用液氮将幼苗冷冻，然后研磨成细粉。转移到尺寸合适的冷却管中，使液氮蒸发而不使样品解冻，然后加入裂解缓冲液。重复其余的幼苗样品。进行RNA提取的以下的RNA提取试剂盒协议下一步骤尽快（见参考文献8 ）。
执行RNA质量控制：使用Nanodrop或Qubit确定RNA样品的纯度和浓度。
执行cDNA合成以下Bio-Rad公司的iScript TM cDNA合成试剂盒协议（见参考文献3 ），以及以下的qPCR SYBR ® 绿色PCR主混合物协议（见参考文献10 ）。
注意：需要反转录的阴性对照，以确保在RNA提取过程中消除所有DNA。要设置阴性对照，请在cDNA合成反应过程中用无核酸酶的水代替逆转录酶。在以下qPCR分析中包括阴性对照样品。需要针对不同的引物，靶标或cDNA样品优化qPCR 反应条件。将cDNA反应即荐的量为下游的qPCR结束是反应体积的十分之一，通常为1 微升10 微升反应。尝试将Ct值保持在35以下，这表示强烈的正信号。至少包括两个用于qPCR分析的内务控制。由于qPCR测定法对移液错误和变异性高度敏感，因此请使用多通道移液器和低保留吸头来设置qPCR反应。

数据分析

1. 质量控制：确保扩增曲线是典型的，解链曲线显示一个峰，表明每对引物都有一个扩增产物（如果未进行解链曲线分析，请运行琼脂糖凝胶检查扩增产物是否为单个扩增），复制组的变异系数等于或小于10％，并且在阴性对照组中未检测到信号（图3）。如果使用QuantStudio TM ，请使用Applied Biosystems TM 分析软件或Thermo Fisher Cloud查看质量标志（请参阅参考1 ）。删除质量差或标记的值。

D：\ Reformatting \ 2020-5-6 \ 1902964--1437贾天然819931 \ Figs jpg \ Figure3.jpg

图3.内源性对照和pri-miRNA基因的典型扩增曲线和解链曲线。正常扩增曲线在PCR的指数阶段是平滑的。阈值循环（Ct）值是反应的荧光信号超过阈值的循环，通常由qPCR软件自动设置该阈值，即信号在背景上明显增加。良好的解链曲线显示出一个峰，表明来自每对引物的单个扩增产物。对于重复曲线，曲线的聚类应该紧密。

2. 使用比较Ct（  Ç Ť ）方法来确定相对权通过在Excel中用软件分析或人工计算（见参考文献测试样品中的每个目标的tity 1 ，Schmittgen 和Livak ，2008）。该目标被归一化至内源性对照（例如，GAPDH ，肌动蛋白，UBQ 等），并且所述控制或参考样品。将每个靶标的相对定量或倍数变化与时间点作图（图4，Schmittgen 和Livak ，2008）。

3. 统计分析：进行Student's t 检验以检查在每个时间点对照组和突变组之间的差异。临界值设置为P 值<0.05，倍数变化大于2。

D：\ Reformatting \ 2020-5-6 \ 1902964--1437贾天然819931 \ Figs jpg \ Figure4.jpg

图4. pri-miR172a和EIF4A mRNA RNA稳定性测量的代表性结果。UBQ5 用作内部控制。在时间点0收集的样本在此处用作样本对照或参考。将时间0的值设置为1。误差线表示与两次样品重复的标准偏差。对于每个样品重复，对单个基因靶标进行技术三次重复。

致谢

感谢陈学梅博士和加州大学河滨分校的支持。这项工作是由资助美国国立卫生研究院（GM061146）和戈登和贝蒂·摩尔基金会（GBMF3046）到博士雪梅陈。该协议改编自Lidder 等人以前的工作。（2005年），张等人。（2014年）和贾等人。（2017）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突或利益冲突。

参考资料

Applied Biosystems TM 分析软件：Applied Biosystems TM 相对定量分析模块用户指南。赛默飞世尔科技。取自：https : //assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0014820_RelativeQuant_UG.pdf。
虫草素：产品信息。Sigma-Aldrich。取自：https : //www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/c3394pis.pdf。
iScript TM cDNA合成试剂盒：iScript TM cDNA合成试剂盒产品插件，Ver D. Bio-Rad。取自：https : //www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4106228.pdf。
贾，T.，张，B.，你，C.，张，Y.，曾庆红，L.，李，S.，约翰逊，KCM，玉，B.，李，十，陈，X 。（2017）。在拟南芥MOS4相关复合促进微小RNA生物合成和前体信使RNA剪接。植物细胞29：2626-2643。
Lidder ，P.，Gutiérrez，RA，Salomé，PA，McClung，CR和Green，PJ（2005）。信使RNA稳定性的昼夜节律控制。与序列特定的信使RNA衰变途径相关。植物生理学138（4）：2374 - 2385。
NCI药物词典。取自：https：//www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-drug/def/cordycepin。
Rivero的，L.，舍尔，R.，Holomuzki ，N.，克里斯特，D.，Grotewold ，E。和Brkljacic ，J。（2014）。处理拟南芥植物：生长，种子保存，转化和遗传杂交。方法分子生物学1062：3-25。
RNeasy Plant Mini套件：RNeasy Mini手册-（ZH）。QIAGEN。取自：http : //www.bea.ki.se/documents/EN-RNeasy%20handbook.pdf。
Schmittgen ，TD和Livak ，KJ（2008）。通过比较C（T）方法分析实时PCR数据。纳特Protoc 3（6）：一一〇一至〇八年。
SYBR ® 绿色PCR预混：用户指南SYBR ® 绿色PCR预混和SYBR Green RT-PCR ® 试剂盒。生命生物技术。取自：https : //assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/cms_041053.pdf。
Untergasser ，A.，Cutcutache ，I.，Koressaar ，T.，Ye，J.，Faircloth，BC，Remm ，M.和Rozen ，SG（2012）。Primer3-新功能和接口。Nucleic Acids Res 40（15）：e115。
Zhang，S.，Liu Y，and Yu，B.（2014年）。PRL1，一种RNA结合蛋白，正调控拟南芥中miRNA和SiRNA的积累。PLoS Genet 10（12）：e1004841。