材料和试剂

1. 显微镜载玻片（VWR，目录号：48311-703）

2. 盖玻片（Fisherbrand，目录号：12-545K）

3. HistoPrep笔（Fischer Scientific，目录号：14-905-30）

4. PAP-pen（电子显微镜科学，目录号：71310）

5. 10%中性缓冲福尔马林（Thermo scientific，目录号：5701），室温下储存

6. 二甲苯（Fisher Scientific，目录号：X3P-1GAL），室温下储存

7. 乙醇（Pharmco，目录号：111000200），室温储存

8. Citra plus抗原回收缓冲液（BioGenex，产品目录号：HK080-9K），储存于4°C

9. 磷酸盐缓冲盐水（Gelifesciences，HyClone，产品目录号：SH30013.03），储存于4°C

10. 吐温-20（Acros有机物，目录号：23336-0010），室温储存

11. Triton X-100（Millipore，OmniPur，目录号：9410），室温储存

12. 30%过氧化氢（H2O2）（费希尔化学公司，产品目录号：H325-100），储存于4°C

13. Image-iT FX信号增强器（Invitrogen，产品目录号：I36933），储存于4°C

14. 山羊血清（双子座，目录号：100-109），储存于-20°C

15. 二甲基亚砜（Sigma，目录号：D2650-100ml），室温下储存

16. FITC TSA试剂（PerkinElmer，目录号：NEL741B001KT），储存于4°C

17. Cy3 TSA试剂（PerkinElmer，目录号：NEL744B001KT），储存于4°C

18. 可选：Cy5 TSA试剂（PerkinElmer，目录号：NEL745B001KT），保存在4°C

19. DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：D9542），储存于-20°C，或Hoechst（Invitrogen，目录号：H3570），储存于4°C

20. SlowFade Gold防褪色贴片（ThermoFisher Scientific，目录号：S36937），室温下储存

21. 指甲油（任何种类或品牌都可以）

22. 抗体

a、抗MYCN抗体（细胞信号，目录号：51705S），储存于-20°C

b、抗MYC抗体（Abcam，目录号：ab32072），储存于-20°C

c、二级抗兔HRP（赛默飞世尔科技公司，目录号：31462），储存于4°c

23. 渗透缓冲液（见配方）

24. 阻塞缓冲区（见配方）

25. 抗体稀释剂（见配方）

26. 洗涤缓冲液（见配方）

27. FITC信号放大缓冲器（见配方）

28. Cy3信号放大缓冲器（见配方）

细胞系TSA-IF所需的其他材料和试剂：

1. 8个井室显微镜载玻片（康宁，目录号：354108）

2. 甲醇（Millipore，目录号：MX0485-7），室温储存

3. 抗体

a、抗组蛋白H3抗体（Abcam，目录号：ab1791），储存于-20°C

b、 Cy5结合抗兔二级抗体（Invitrogen，目录号：A10523），保存于4°C

设备

1. 滑盖加热器（例如，实验室线路仪器，型号：CPC-600N1）

2. 电压力锅（如Cuisinart，型号：CPC-600N1）

3. 显微镜载玻片湿度室（，Ted Pella，目录号：21053）例如

4. 玻片染色站（例如，Tissue-Tek，目录号：4451）

程序

组织切片

A、样品固定和制备

1. 收获组织时，迅速将样本（最大厚度为3 mm）直接放入10%中性缓冲福尔马林中，并在室温下培养24小时。

注意：在最初的几个小时内，每隔30分钟翻转容器和/或混合内容物，以确保均匀暴露和正确固定。

2. 将标本转移到70%的乙醇中，并将组织带到适当的设施中进行FFPE样品制备。

注：如果无法立即处理样本，则将样本放在4 °C。

3. 使用标准的microtone切片程序在带正电的显微镜载玻片上进行组织切片和干燥。

注：本方案已优化用于4微米厚的FFPE组织切片染色。如果组织不需要立即染色，则将切片浸入石蜡中并保存在4 摄氏度.

B、抗原回收

1. 根据需要用HistoPrep笔标记载玻片。

2. 将载玻片放在载玻片加热器上，在60°C下加热60分钟，融化石蜡。

3. 快速将载玻片转移到已浸没在二甲苯中的垂直载玻片架上。

4. 在二甲苯中培养载玻片四次，每次10分钟。

5. 用分级酒精培养法对组织进行再水化：

a、 100%乙醇：两次单独培养，每次1分钟

b、 90%乙醇：两次单独培养，每次1分钟

c、 75%乙醇：两次单独培养，每次1分钟

d、 50%乙醇：两次单独培养，每次1分钟

e、 dH2O：两次单独培养，每次5分钟

6. 将载玻片转移到1x citra plus抗原回收缓冲液中。

7. 向压力锅底部加入175ml的dH2O，并将程序设置为高压（或125°C）4分钟。

8. 让载玻片在压力锅中再保持30分钟，以便减压和冷却。

9. 从压力锅中取出载玻片，让载玻片在室温下进一步冷却45分钟。

10. 用1x PBS清洗载玻片两次，每次5分钟。

C、阻塞步骤（不要让组织变干）：

1. 将载玻片在3%过氧化氢（1:10稀释30%过氧化氢于1x PBS中）中培养10分钟，使内源性过氧化物酶失活。

2. 用1x PBS清洗载玻片两次，每次5分钟。

3. 在室温下用渗透缓冲液使组织渗透20分钟，轻轻摇动。

4. 用1x PBS清洗载玻片两次，每次5分钟。

5. 迅速抽干组织周围的PBS，加入PAP圆，将载玻片放入显微镜载玻片湿润室，并将PBS加入PAP圆内的组织中，直到所有载玻片就位。

注：在底部加入0.5-1英寸的水显微镜下滑动湿室，并在孵育期间保持密封。

6. 抽吸PBS，在图像增强剂中培养载玻片30分钟。

7. 将载玻片转移到已浸没在阻挡缓冲液中的载玻片支架上，并在室温下培养1小时。

8. 用1x PBS清洗载玻片两次，每次5分钟。

9. 将载玻片放回显微镜载玻片湿度室，并向每个载玻片中添加PBS，直到所有载玻片转移完毕。

D、 MYC染色（TSA-IF第1轮）

1. 用抗MYC抗体配制适量的抗体稀释液，稀释倍数为1:500。

2. 用稀释的抗MYC抗体在4℃下孵育过夜。

3. 将载玻片转移到已浸没在冲洗缓冲液中的载玻片支架上，并培养5分钟。

4. 用1x PBS进一步清洗载玻片三次，每次5分钟。

5. 将载玻片放回显微镜载玻片湿度室，并向每个载玻片中添加PBS，直到所有载玻片转移完毕。

6. 将抗兔HRP二级抗体按1:1000的比例加入抗体稀释液中1h。

7. 将载玻片转移到已浸没在冲洗缓冲液中的载玻片支架上，并培养5分钟。

8. 用1x PBS进一步清洗载玻片三次，每次5分钟。

9. 将载玻片放回显微镜载玻片湿度室，并向每个载玻片中添加PBS，直到所有载玻片转移完毕。

10. 准备FITC SAB。

11. 一次一片，抽吸PBS并在组织上涂抹FITC SAB。

注：本方案已优化为应用FITC-SAB 6分钟。可能需要针对给定实验优化培养时间，以确保信号稳定且背景最少。后者可以通过使用不同MYC转录量的阳性和阴性对照来实现。在多张幻灯片上涂抹色斑时，要非常精确地把握时间。当FITC SAB应用于第一张幻灯片时启动计时器。继续用FITC-SAB代替PBS，并在每个玻片的确切指定时间停止反应。

12. 为了停止反应，将载玻片转移到冲洗缓冲液中。转移所有载玻片后，在洗涤缓冲液中培养5分钟。

13. 用1x PBS清洗载玻片两次，每次5分钟。

14. 用dH2O清洗载玻片一次5分钟。

15. 为准备第二抗体探针，执行抗原检索步骤B6-B10。

注：在这一点上，FITC被选择性地与MYC近端酪氨酸残基结合。在这一步中使用压力锅作为剥离方法来去除先前应用的一级和二级抗体。在注释部分有进一步说明，一定要包括适当的控制措施，以确保抗体被适当地剥离。

16. 通过执行步骤C1-C2和C5-C9重新锁定组织。

E、 MYCN染色（TSA-IF第2轮）

1. 用抗MYCN抗体配制适量的抗体稀释液，稀释倍数为1:500。

2. 用稀释的抗MYCN抗体在4℃孵育载玻片过夜。

3. 将载玻片转移到已浸没在冲洗缓冲液中的载玻片支架上，并培养5分钟。

4. 每片用PBS冲洗5分钟。

5. 将载玻片放回显微镜载玻片湿度室，并向每个载玻片中添加PBS，直到所有载玻片转移完毕。

6. 将抗兔HRP二级抗体按1:1000的比例加入抗体稀释液中1h。

7. 将载玻片转移到已浸没在冲洗缓冲液中的载玻片支架上，并培养5分钟。

8. 用1x PBS进一步清洗载玻片三次，每次5分钟。

9. 将载玻片放回显微镜载玻片湿度室，并向每个载玻片中添加PBS，直到所有载玻片转移完毕。

10. 准备Cy3 SAB。

11. 一次一片，抽吸PBS并在组织上涂抹Cy3 SAB。

注：本方案已优化为应用CY3-SAB 8分钟。可能需要针对给定实验优化培养时间，以确保信号稳定且背景最少。后者可以通过使用不同MYCN转录量的阳性和阴性对照来实现。在多张幻灯片上涂抹色斑时，要非常精确地把握时间。当CY3 SAB应用于第一张幻灯片时启动计时器。继续用CY3-SAB代替PBS，并在每个玻片的确切指定时间停止反应。

12. 为了停止反应，将载玻片转移到冲洗缓冲液中。转移所有载玻片后，在洗涤缓冲液中培养5分钟。

13. 用1x PBS清洗载玻片两次，每次5分钟。

14. 在1:50000条件下使用DAPI或1:2000在RT条件下使用Hoechst 15分钟。

注：如果需要缩短显微镜下的曝光时间，则增加培养时间。

15. 用1x PBS清洗载玻片三次，每次5分钟。

16. 通过涂抹2-4滴Slowfed Gold防腐蚀贴片，放置在盖玻片上，轻轻施加压力使气泡滚出，并吸干多余的安装介质，从而密封纸巾。

17. 平放，让载玻片在避光的室温下干燥一夜。

注意：若要长期使用，请用指甲油密封封盖条边缘，并存放在4号°C。

腔室滑道

A、幻灯片准备

1. 优化室内载玻片的播种密度，使细胞在固定时接近汇合。

注：本方案已优化为8孔室载玻片和细胞接种后4-5天的固定。

2. 用1x PBS快速冲洗。

3. 在100%甲醇中培养载玻片10分钟。

4. 用1x PBS清洗载玻片两次，每次5分钟。

注：根据实验设计，可以在此时或之后的任何时候从载玻片上取下腔室。在PBS存在的情况下，根据制造商的建议移除腔室，不要让电池干燥。

B、阻断和抗体孵育

1. 如前一节程序C、D和步骤E1-E13所述，对FFPE组织进行阻断步骤和抗体培养。

2. 用dH2O清洗一次玻片。

3. 为准备第三个抗体探针，执行与上一节步骤B6-B10、C1-C2和C5-C9中描述的FFPE组织相同的抗原检索和重新锁定步骤。

4. 在1:100的条件下应用组蛋白H3抗体，并在4℃下培养过夜。

注：应用组蛋白H3抗体作为核复染。抗原回收步骤后，核染料如DAPI和Hoechst将不再完全定位于细胞核。

5. 将载玻片转移到已浸没在冲洗缓冲液中的载玻片支架上，并培养5分钟。

6. 用1x PBS进一步清洗载玻片三次，每次5分钟。

7. 将载玻片放回显微镜载玻片湿度室，并向每个载玻片中添加PBS，直到所有载玻片转移完毕。

8. 取Cy5结合的抗兔二级抗体1:200，RT孵育1h。

9. 将载玻片转移到已浸没在冲洗缓冲液中的载玻片支架上，并培养5分钟。

10. 用1x PBS进一步清洗载玻片三次，每次5分钟。

11. 通过涂抹4-6滴Slowfed Gold防腐蚀贴片，放置在盖玻片上，轻轻施加压力使气泡滚出，并吸干多余的安装介质，从而密封纸巾。

12. 平放，让载玻片在避光的室温下干燥一夜。

13. 用指甲油封住盖玻片的边缘（至少涂三层以确保电池完全密封且贴片不会泄漏），并在4°C下储存。

数据分析

1. FFPE组织切片：手动拍照或进行全玻片荧光成像，每个荧光团不过度曝光。复合FITC[激发（494 nM），发射（517 nM）]，Cy3[激发（550 nM），发射（570 nM）]和DAPI[激发（358 nM），发射（461 nM）]图像作为单通道和叠加图像（图1）。

2. 室内载玻片：虽然细胞主要以单层形式生长，但我们建议使用全载玻片Z-stack荧光成像。

任何细胞/组织切片在染色过程中变干将导致荧光强度和背景增强。使用MYCN和MYC阳性和阴性对照来指示荧光粉的暴露水平。避免在组织边缘附近拍摄图像。

图1。人组织标本和细胞系培养中MYCN和MYC的TSA-IF。A-B.TNBC-FFPE临床标本中MYCN和MYC的代表性TSA-IF染色（A）和在8孔室玻片中生长的TNBC细胞系（B）。颜色代表细胞核（蓝色）、MYCN（洋红色）和MYC（绿色）。比例尺=20米。μ

笔记

1. 不要让纸巾变干。

2. 在培养期间和组织切片或培养箱载玻片盖好后，通过覆盖显微镜载玻片水分室来保护荧光团免受光照。

3. 所有冲洗和堵塞步骤均在室温下进行。

4. 始终包括MYCN和MYC的经验证的阳性和阴性对照品。设计实验，使每一个对照组织都符合整个实验方案以及单独的原始染色。虽然使用该方案在MYCN和MYC之间没有观察到抗体交叉反应性，我们建议研究者包括控制，以确认没有交叉反应性。

5. 可能需要对Cy3进行优化和培养。

6. 单或双MYC家族亚型TSA-IF可通过执行额外的抗原回收以去除先前的结合抗体而与其他抗体复合。之后，第三次TSA-IF反应可使用Cy5 TSA试剂（PerkinElmer，目录号：NEL745B001KT）进行，也可对任何物种的次级抗体应用非专用IF协议。

食谱

1. 渗透缓冲液（0.1%吐温-20）

1毫升吐温-20

999毫升1x PBS

2. 阻断缓冲液（0.3%Triton X-100，5%目标血清，1x PBS）

3毫升Triton X-100

50ml山羊血清

947毫升1x PBS

3. 抗体稀释液（5%山羊血清，1x PBS）

25毫升山羊血清

475毫升1x PBS

4. 洗涤缓冲液（0.1%Triton X-100，0.25%山羊血清，1x PBS）

1毫升Triton X-100

2.5毫升山羊血清

996.5毫升1x PBS

5. FITC信号放大缓冲器（SAB）

a、用150μl二甲基亚砜重组水解FITC

b、每次施用SAB前，立即向200μl 1x Plus放大稀释剂（H2O2添加剂）中加入1μl 30%H2O2

c、要创建工作SAB，计算给定实验所需的体积，并添加1:50的FITC和1:100的H2O2添加剂。例如，对于1 ml SAB，在970μl 1x Plus放大稀释剂中添加20μl FITC和10μl H2O2添加剂

注意：使用前应立即准备FITC SAB。

6. Cy3信号放大缓冲器（SAB）

a、用150μl二甲基亚砜重组水解Cy3

b、每次施用SAB前，立即向200μl 1x Plus放大稀释剂（H2O2添加剂）中加入1μl 30%H2O2

c、为了创建工作SAB，计算给定实验所需的体积，并添加1:50的Cy3和1:100的H2O2添加剂。例如，对于1 ml SAB，向970μl 1x Plus扩增稀释剂中添加20μl Cy3和10μl H2O2添加剂

注意：使用前应立即准备Cy3 SAB。

致谢

我们感谢为本研究提供组织的患者。这项研究得到了以下方面的支持：Incyte公司作为Incyte-Vanderbilt联盟的一部分；NCI的一份CA068485；以及一份susang.Komen-grant SAC110030。我们感谢Vanderbilt Ingram癌症中心（P30 CA068485）支持的翻译病理学共享资源核心，以及乳腺癌卓越研究专业计划（SPORE）的病理学和组织信息学核心（P50 CA098131）提供的组织病理学帮助和专业知识。

相互竞争的利益

这项研究的部分资金是由Incyte公司的一笔研究补助金提供的。本公司现有员工的手稿与本公司现有员工的手稿相对应。P、 C.C.L.和P.S.是Incyte公司的前雇员；目前的附属公司分别是Kymera Therapeutics和Prelude Therapeutics。

伦理学

用于发展FFPE TSA-IF染色程序的组织标本最初由范德比尔特英格拉姆癌症中心（VICC）的临床提供者收集，并在范德比尔特大学医学中心（VUMC）翻译病理学共享资源核心进行处理。VUMC机构审查委员会根据既定法规和政策，对样本进行了去鉴定，禁止发布数据。VICC是NCI指定的综合癌症中心，由P50 CA098131支持，根据NCI政策，采用最佳实践管理核心服务。

工具书类

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