材料和试剂

1. 1.5毫升微量离心管（Eppendorf）

2. 1.5毫升安全锁定微量离心管（Eppendorf）

3. 50毫升猎鹰管

4. 耐化学手套

5. 种子（例如，拟南芥）。

6. 生长培养基[ 例如，对于拟南芥0.5 x MS（1％w / v琼脂）平板或土壤：ver石（1：1）混合盆]

7. 蒸馏水（dH 2 O）

8. （ø Ptional）液态空气/ N 2

9. 磷酸二氢钾（西卡雷利® 实验室，目录号：1057211）

10. 磷酸氢二钾（西卡雷利® 实验室，目录号：1015211）

11. 氢氧化钠（氢氧化钠）（西卡雷利® 实验室，目录号：843211）

12. 盐酸（盐酸）（Biopack ，目录号：2000963208）

13. 苯肼（默克公司，目录号：107251 ）。在暗处室温下保存

14. 钾的铁氰化物（Anedra ，研究AG，目录号：7039）

15. 一水合乙醛酸钠（Sigma-Aldrich，Merck，目录号：G4502）

16. 提取缓冲液（请参见配方）

17. 反应缓冲液（请参见食谱）

设备

烧杯
（Ø Ptional）杵臼
植物生长室/ 温室
60-65°C恒温箱
分析天平0.5 / 0.0001 g（例如，Mettler Toledo，型号：AL204）
用微升转子在4°C下离心（例如，Thermo Scientific，Sorval Biofuge Primo R）
冰浴
100°C的热风浴
涡流混合器（例如，Decalab ）
通风柜
VIS分光光度计（例如，Bioamerican Science，型号：SP 2000 UV）
分光光度法塑料或玻璃VIS / UV-VIS半微量0.75-1.5 ml比色皿

程序

准备植物材料
在具有相应条件的温室/温室中种植植物。
注意：F 或生长拟南芥，将种子在4 °C下分层2-3 天，将种子播种在0.5 x MS琼脂平板上或土壤：ver 石（1：1）混合物中，并在16 h 下转移至生长室光照/ 8 小时黑暗光周期在22 ℃和100的光强度- 0.99 微摩尔光子米-2 小号-1 。

在1.5 ml安全锁微量离心管中收集约20 mg-0.5 g植物样品。
笔记：

对于拟南芥收获年轻，衰老和caulinar 叶，芽，花，长角果和成年植物的干种子（图小号2A- 2 F）或在收集0.5生长幼苗X 中号小号琼脂板（图2G）。
建议在生物学重复之间收集相似重量的植物样品。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 2003093--1427 CarlosLescano 861624 \ Figs jpg \ Fig。2 .jpg

图2用于量化尿素的拟南芥组织示例（A）8周龄植物（B）幼叶，（C）衰老叶，（D）芽，（E）花和（F）种子的详细信息（G）7天大的幼苗在0.5 x 琼脂平板上生长，比例尺s = 2 cm（AC，G），= 1 mm（DF）。

将带盖的微量离心管放在60-65°C的烤箱中过夜。
将干燥的植物样品称重并放回试管中，样品可在-20°C下保存。

从植物组织中提取尿素
可选步骤：用研钵和研杵将植物组织研磨成细粉，然后将其转移至微量离心管中。
注意：将植物样品研磨成细粉取决于组织和植物种类的类型。例如，从拟南芥中提取尿素不是必需的，但从其他植物种类的硬组织（如大豆（ Muñozet al。，2016）。

加入0.5 ml提取缓冲液。
在4°C下以17,758 xg离心5分钟。
在100°C的热空气浴中孵育20 分钟，确保所有试管保持密闭状态。
转移至冰浴中1分钟，确保所有试管保持密闭。
在4°C下以17,758 xg离心5分钟。
将补品转移至新的微量离心管中（无需使用安全锁定管），样品可在-20°C下保存数月，或在下一步之前在4-8°C下保存。

碱/酸水解
准备微量离心管，根据要测量的化合物（图1）对每个样品进行AC反应（图1），并根据其中发生反应的方式指定试管。
笔记：

根据表1中所示的待测化合物制备试管。例如，要测量样品＃1中的尿囊素和尿囊酸盐浓度，可以将试管命名为1A，1B和1C。
强烈建议对每个样本使用重复项。

表1.管的准备

待测化合物

一个

乙

C

尿囊素

--

X

X

尿囊酸盐

X

X

--

尿囊素和尿囊酸

X

X

X

总尿素

X

--

X

对于乙醛酸标准曲线，在100μl提取缓冲液中准备新的系列稀释的0、2、4、6、8和10 nmols乙醛酸钠一水合物，并按照与乙醛酸定量相对应的步骤进行（反应A）。一旦获得正确的乙醛酸酯标准曲线，就执行该步骤。
注意：对于乙醛酸标准曲线的每个浓度，建议使用一式三份。

按照相应的步骤，每个反应所表示。在表2 。执行相同的步骤为相应的空管，但增加100 Myueru提取液代替样品（步骤C3a的）。在步骤的C3d，C3E，反应3h和C3I系统。确保这所有管子保持良好密封。

样品可以在步骤C3j之后在-20°C下保存几个月，或保持在4-8°C下以立即继续操作。

注意：建议对被分析的样品同时进行相同的反应，同时，其他反应的试管可以在4-8°C下保存。

表2. 尿素水解

试剂/管

一个

乙

C

样品
100微升

100微升

100微升

卫生署2 Ø
400微升

300微升

200微升

0.5 N Na（OH）
--

--

100微升

在100 °C下孵育
--

--

8分钟

继续冰浴
1分钟

1分钟

1分钟

0.65 N盐酸
--

--

100微升

0.15 N盐酸
--

100微升

--

在100 °C下孵育
--

4分钟

4分钟

继续冰浴
1分钟

1分钟

1分钟

反应缓冲液
100微升

100微升

100微升

分光光度法测量
注意：使用适当的个人防护设备，在通风橱中进行HCl工作。

在Falcon管中准备新鲜的3mg / ml 苯肼和16mg / ml含dH 2 O的铁氰化钾，将其倒转并在涡旋中剧烈摇晃混合，然后将其在黑暗中室温保存。
加入100 µl 3 mg / ml 苯肼，涡旋混合并在室温下孵育5分钟。
加入500 µl 37％HCl，然后颠倒混合。
加入100 µl 16 mg / ml铁氰化钾并颠倒混合，应观察到粉红色至红色。
在室温下孵育10分钟。
吸光率测量1 ，5 -Diphenylformazan在520nm吸光度（Abs 520 ）在RT下，一个值的ABS 520 获得用于每个反应管，即阿布斯520 甲，ABS 520 B，阿布斯520 Ç 。
笔记：

如果Abs 520 超出标准曲线确定的线性范围，请在18.5％HCl中稀释样品并立即再次测量。建议使用1/5和1/10稀释（分别为5和10稀释因子）。
制作表格以写下每个样品的获得数据：鲜重，干重，稀释系数，Abs 520 A，Abs 520 B，Abs 520C 。

数据分析

确定标准曲线的截距和斜率值。典型的乙醛酸酯标准曲线如图3 所示。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 2003093--1427 CarlosLescano 861624 \ Figs jpg \图3.jpg

图3. 代表性的乙醛酸盐标准曲线通过连续稀释乙醛酸钠一水合物生成标准曲线，截距= 0.0006;斜率= 0.0214; R 2 = 0.9998（计算时未考虑10 nmol点）。

乙醛酸含量计算（G）在管A，B和C使用式[阿布斯520 -截] /斜率以获得值g 甲，G 乙和G Ç 。
样品中的尿素含量可以使用以下公式计算：
总脲含量（nmol）= [G C -G A ] = [ 尿囊素含量+ 尿囊酸盐含量]

尿囊素含量（nmol）= [G C -G A ]

尿囊含量（纳摩尔）= [G 乙-G 甲]

使用以下公式确定样品中的尿素浓度（nmol / mg干重）：
总脲含量= [总脲含量（nmol）] × [稀释因子] / [干重（mg）]

尿囊素浓度= [尿囊素含量（nmol）] × [稀释因子] / [干重（mg）]

尿囊酸浓度= [ 尿囊酸总含量（nmol ）] × [稀释系数] / [干重（mg）]

报告酰脲含量的分析材料/ S以nmol / mg干重（DW），E. G. ，尿囊素和尿囊浓度不同的拟南芥组织见图4 。所描述的协议也被用于确定修改在酰脲在不同营养和胁迫条件下生长的拟南芥植物芽中的浓度（Lescano 等人，2016和2020）.2周龄拟南芥根中，尿囊素的浓度分别为18.2 nmol / mg和6.3 nmol / mg （Lescano 等人，2016 ，图8）。尿囊素和尿囊酸浓度为从木质部汁液中6周龄拟南芥是0.27±0.07 纳摩尔/ Myueru 和0.09±0.08 纳摩尔/ Myueru 分别此协议还进行了有关确定酰脲结瘤和非结瘤大豆植物的根和茎中的浓度（Muñoz 等，2016）。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 2003093--1427 CarlosLescano 861624 \ Figs jpg \ Fig.4.jpg

图Ure 4。不同拟南芥组织中的尿素浓度。成年植物和7 日龄整苗的不同器官和组织中尿囊素和尿囊素的含量。DW =干重。星号表示与幼叶样品相比有显着差异（P < 0.05 ，邓恩的测试）

菜谱

反应缓冲液（0.4 M磷酸钾缓冲液）
通过将相应量的盐溶解在dH 2 O中来制备500 ml 0.4 M磷酸一钾和500 ml 0.4 M磷酸二钾
将200 ml 0.4 M 磷酸二钾放入烧杯中
加入所需量的0.4 M磷酸二氢钾使溶液的pH值达到7，得到的溶液为0.4 M磷酸钾缓冲液。将反应缓冲液储存在4-8° C并将储备溶液储存在-20°C
提取缓冲液（25 mM磷酸钾缓冲液）
将31.25 ml反应缓冲液放入烧杯中
用0.5 N HCl将溶液调至pH 7
并添加dH 2 O，最终体积为500 ml

致谢

本程序来自Lescano 等人（2016）和Lescano 等人（2020 ）的工作。这项工作得到了国家科学技术基金（FONCyT ，阿根廷）[PICT-2009-0114]和作者感谢科尔多瓦国立大学科学技术部长（阿根廷SECyT -UNC）。作者对玛丽亚·劳拉·罗哈斯（Biol。MaríaLaura Rojas）对该协议的重要修订表示感谢。

利益争夺

没有利益冲突。

参考文献

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Lescano，CI，尼，C.，冈萨雷斯á 勒莱，CA和德西蒙，M。（2016）.Allantoin积累由allantoinase下调和运输由酰脲通透5所赋予盐胁迫耐受性来介导的拟南芥植物。植物分子生物学91（4- 5）：581-595。
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