材料和试剂

注意：除非另有说明，否则所有试剂和材料应保持在室温下。有关试剂的保存期限和存储温度，请参考制造商的说明。

1. 实验室外套和手套

2. BD结核菌素注射器（Fisher，BD Biosciences，目录号：14-826-88 或BD309626 ）

3. Exel International 10至12cc注射器（Fisher，目录号：14-841-54）

4. 针头（25 G x 5/8英寸）：BD通用针头和PrecisionGlide皮下注射针头（Fisher，BD Biosciences，目录号：14-826AA或BD305122）

5. 带有乙烯基解剖垫的铝解剖盘（Carolina，目录号：629004）

6. 轻型纸巾（乔治亚太平洋，布朗尼，目录号：29221）

7. 50毫升Falcon锥形离心管（Fisher Scientific，康宁，目录号：14-432-22）

8. Scientific幻灯片固定器（Starplex Scientific，目录号：V302SH）

9. 组织-Tek公司® 底模，不锈钢（樱，目录号4217）

10. 组织-Tek公司® 的Uni-盒，白色（樱，目录号：4170 ）

11. Superfrost Plus显微镜载玻片，白色（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：12-550-15 ）

12. 显微镜盖玻片（24x50-1.5）（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：12-544-E ）

13. 显微镜载玻片盒（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：03-448 ）

14. 成人对照和实验小鼠（例如，WT和Neu1  /  ）。

注意小号：

的生成和的初始特性Neu1  /  在去Geest的描述等。，2002。WT和Neu1  /  小鼠保持在房子里。
腓肠肌，肝，肾，肺和心脏来自WT和Neu1  /  在4月龄小鼠（FVB / NJ）被用于此协议的目的。任何背景，性别，年龄或组织类型（石蜡或冷冻）均可用于Masson染色。
15. Avertin（三溴乙醇； 12.5 mg / ml）；由SJCRH的ARC兽医服务提供

16. Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Corning，目录号：21-031-CV）

17. Advantus T形针（Fisher Scientific，目录号：S174301）

18. 预装的容器，10％中性福尔马林缓冲液，180毫升（Thermo Scientific，目录号：591801）

19. 石蜡（Thermo Fisher Scientific，目录号：8337）

20. Histoprep二甲苯（Fisherbrand，目录号：HC7001GAL）

21. 乙醇200证明（Greenfield Global的Pharmco，目录号：111000200）

22. 乙醇190证明（Greenfield Global的Pharmco，目录号：111000190）

23. 乙醇140证明（Greenfield Global的Pharmco，目录号：111000140）

24. Bouin的固定剂（Polysciences，目录号：16045-1）

25. 苏木精（Polysciences，目录号：02749-25）

26. 29％的氯化铁（Rowley Biochemical，目录号：SO-125A）

27. 盐酸（Fisher Scientific，目录号：A144S-500）

28. Biebrich猩红色，CI26905（Polysciences，目录号：0336-100 ）

29. 酸性品红，CI 42685（Polysciences ，目录号：24991 ）

30. 冰醋酸（Fisher Scientific，目录号：A38S-500 ）

31. 磷钨酸（西格玛，目录号：P4006-25 ）

32. 磷钼酸（Polysciences，目录号：01021-25）

33. 苯胺蓝，CI 42755（Polysciences，目录号：02570-25 ）

34. 细胞液二甲苯（Thermo Fisher Scientific，目录号：8312-4 ）

35. 魏格特的铁苏木精（请参阅食谱）

解决方案A

解决方案B

36. Biebrich猩红色酸品红溶液（请参阅食谱）

37. 磷钨/磷钼酸（请参阅食谱）

38. 苯胺蓝（请参阅食谱）

39. 1％乙酸（请参阅食谱）

设备

解剖工具：无菌剪刀和镊子（Roboz，目录号s ：RS-5983，RS-5877，RS-5358，RS-5135）
等温培养箱（Fisherbrand，Fisher Scientific，目录号：15-103-0513）
组织处理器Excelsior AS （Thermo Fisher Scientific ，目录号：A82300001 ）
注意：有关制造商的说明，请访问：https : //assets.fishersci.com/TFS-Assets/APD/manuals/A82310100_05%20-%20Operator%20Guide%20-%20Hi%20Res.pdf

加热石蜡包埋站（HistoCore Arcadia H，Leica Biosystems ）
冷板（HistoCore Arcadia C，徕卡生物系统公司）
Shandon Para Trimmer（Thermo Fisher Scientific ，目录号：B3120205）
切片机全自动旋转式（Leica Bios ystems，货号：RM2255）
注意：有关制造商的说明，请访问：https : //drp8p5tqcb2p5.cloudfront.net/fileadmin/downloads_lbs/Leica%20RM2255/User%20Manuals/Leica_RM2255_IFU_2v3J_en.pdf

½英寸美国画家画笔（Loew-Cornell，4550系列洗涤）
石蜡切片用水浴（Leica Biosystems ，型号：Leica HI1210 ）
珠浴（Precision Scientific，型号83，目录号：66551）
实验室装甲珠（Thermo Fisher Scientific，目录号：A1254301）
玻璃Coplin玻片染色罐（Thermo Fisher Scientific ，目录号：E94）
通用压力表（Fisherbrand，目录号：13-201-644）
实验室存在通风柜
Gemini AS自动幻灯片染色机（Thermo Fisher Scientific ，目录号：A81500002）
注意：有关制造商的说明，请访问：https : //assets.thermofisher.com/TFS-Assets/APD/manuals/Gemini%20AS%20Operator%20Guide.pdf

带相机的光学显微镜（徕卡，目录号s ：DM2500和DF450）

软件

影像软件。Leica Application Suite（LAS）版本4.9.0（内部版本：129）（Leica Microsystems，CMS GmbH）

程序

注意小号：

应该根据国家和机构政策来照顾和使用小鼠。所有规程必须由机构动物委员会批准。
可以在生物安全柜外部进行组织解剖，而无需无菌。

鼠标灌注
通过在20 腹腔内注射Avertin（12.5 mg / ml）来深度麻醉小鼠μ升/克体重。
将鼠标向下固定在仰卧位置（腹侧朝上）以解剖垫。用70％乙醇喷洒鼠标。
用剪刀和镊子打开无菌包装，然后在工作区域中放入预填充的10％中性福尔马林缓冲容器。
切开皮毛，然后沿中线切开腹膜。沿中线切开肋骨。
用胸骨切掉一部分肋骨，露出心脏和肺部。
剪下下腔静脉（IVC）放血小鼠（图2）。
取一个DPBS装满的10 ml注射器，将其连接到25 G x 5/8英寸的针上，然后将其按主动脉方向插入左心室（图2）。轻轻推动注射器的柱塞以灌注鼠标。
注意小号：

在停止心跳之前开始进行心脏灌注。
用DPBS灌注是为了清除血液中可能干扰后续染色的组织。作为正确灌注的指示，血液应从IVC排出。肺，肾和肝等器官应逐渐变白，以表示良好的灌注。
也可以使用蠕动泵进行心脏灌注。

图2 。胸腔。小鼠胸腔图像显示了与灌注针位置相关的解剖结构。主动脉和下腔静脉标有虚线。

肾脏解剖
收缩肠道和周围组织以暴露肾脏。
切开肾动脉以隔离肾脏。
小心地从腹腔中取出肾脏，将其放在解剖垫上，修剪附着在组织上的脂肪。
将肾脏放入预先填充的10％中性福尔马林缓冲容器中。固定肾脏48小时，然后直接进行S tep F1。
注意小号：

为了更好地固定肾脏，可以将它们切成½（纵向或矢状切开）。
通常，对于福尔马林固定的组织，所有标本都放在一个足够大的容器中，以使组织标本与中性福尔马林缓冲液（10％）之间的比例为1至15 / 20x。
组织标本可以在室温下无限期地保存在装有10％中性福尔马林的容器中，而无组织过度硬化或收缩的风险。

肝夹层
切下将肝脏附着在横diaphragm膜，胃和小肠上的所有膜。
切开在肝脏和隔膜之间可见的血管。
从腹腔中取出整个肝脏。
将肝脏放入预先填充的10％中性福尔马林缓冲容器中。修正48小时，直接前进到小号TEP F1。

肺和心脏解剖
切开靠近头部的食道和气管。
使用镊子通过剩余的气管和/或食道抬起肺部和心脏。
切下附着在隔膜上的所有膜。
从胸腔中取出后，将器官放在解剖垫上并使心脏与肺分开。如果仍然附着胸腺，请将其丢弃。
将肺和心脏放入预先填充的10％中性福尔马林缓冲容器中。修正48小时，然后直接进入小号TEP F1。

腓肠肌（GA）解剖
将鼠标向下俯卧（背侧朝上）至解剖垫。用70％的乙醇喷洒鼠标。
去除后肢的皮肤，露出肌肉，然后轻轻切掉后肢的筋膜。
注意：为了隔离其他类型的肌肉，将肌肉以仰卧姿势（腹侧朝上）放置在解剖板上。

切断肌肉的跟腱。
用剪刀小心地将GA肌肉向上拉向膝盖关节，以去除周围的肌肉。
注意：请勿过分用力，因为这可能会影响组织的完整性并在染色的组织切片中形成伪影。

当靠近膝盖关节的上肌腱可见时，将其切断并去除GA肌肉。
将肌肉放入预先填充的10％中性福尔马林缓冲容器中。修正48小时，直接前进到小号TEP F1。

组织处理
将纸巾放入带有标签的Tissue-Tek Uni-cassettes中。
使用Excelsior AS组织处理器将组织处理过夜（表1）。
注意小号：

或者，可以手动处理组织。
步骤小号1- 6（脱水）完成由醇来替代水在组织/细胞。逐渐增加酒精浓度可避免组织变形。完成步骤s 7-9 （清除）以去除酒精。酒精不能与石蜡形成均匀的混合物。因此，二甲苯用作正中间溶剂。步骤小号10- 12完成置换二甲苯与石蜡以使组织准备用于嵌入。
每个步骤的孵育时间取决于组织的厚度（10-15毫米）。

表1. Excelsior AS中组织处理的逐步过程

脚步

试剂

时间（分钟）

温度

脱水

1个

70％乙醇

45

2

85％乙醇

45

3

95％乙醇

45

RT的所有步骤

4

100％乙醇

45

5

100％乙醇

45

6

100％乙醇

45

清算

7

二甲苯

45

8

二甲苯

45

RT的所有步骤

9

二甲苯

45

蜡渗透

10

石蜡

45

11

石蜡

45

所有步骤均在60 °C下进行

12

石蜡

45

打开冷板，并确保石蜡包埋站已打开并且石蜡为液体。
选择合适尺寸的基础模具，并向其中添加一些液体石蜡。
嵌入GA肌肉进行组织切片（图3）：
将整个肌肉从肌腱到肌腱放置在石蜡基模具上，以用于随后的组织纵向切片。
将肌肉横向切成两半，将两半切开，将切下的位置向下放到石蜡基模具上，以进行组织的冠状（额叶）切片。
可以根据所需分析的类型将其他组织放置在石蜡基模具上。

˚F igure 3 的GA肌肉的嵌入位置

将带有组织的基础模具放在冷板上的-10 °C开始固化石蜡，确保将组织向下压并完全浸入。
将预先标记的盒子放在装有组织的基础模具的顶部，并用其他液体石蜡填充模具。
让石蜡完全固化，然后再从模具中取出石蜡块。
使用Para Trimmer修剪纸盒侧面的多余石蜡。
现在，这些块已准备好进行切片，并且可以在室温下存储。

切片
将水浴预热至37 °C 。
将石蜡块安装在切片机上。
注意：根据用户的喜好，可以将块安装在垂直或水平位置。

在整个块上切6毫米薄的切片，以收集组织的不同层。
注意：骨骼肌可能难以切片，从而保持组织的完整性。为了提高切片的质量，在切片之前，将块放在冷板上。

用小刷子拾起切片并将其轻轻地转移到水浴中。
注意：将切片仅漂浮很短的时间，因为长时间漂浮可能会导致肌肉纤维分离。

通过将载玻片浸入水浴中并使其附着在载玻片表面上来收集组织切片。
将幻灯片放到幻灯片盒中。
将玻片放入45 °C 恒温箱中干燥1小时或过夜，以干燥玻片。

Masson的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的Trichrome染色
注意：在整个染色过程中，请在通风橱中戴着防护手套进行所有步骤。

开始染色程序之前，请预先准备所有试剂。
将珠浴放在通风橱中，并将其设置为60 °C 。
将玻因在玻片架中的溶液在珠浴中预热至60 °C 。
注意小号：

Bouin溶液（无机氧化物）迅速渗透组织，保留糖原并增强染料的结合。
Bouin的溶液可以通过合并75毫升苦味酸（饱和），25毫升甲醛（37-40％）和5毫升冰醋酸来制备。
使用Gemini AS自动玻片染色机对玻片进行脱蜡处理（表2）。
注意：此步骤也可以手动执行。

表2.去石蜡和复水步骤

小号TEPS

[R eagent

Ť IME （分钟）

1个

X 亚基

3

2

X 亚基

3

3

X 亚基

3

4

100％乙醇

3

5

100％乙醇

3

6

95％乙醇

3

7

70％乙醇

3

8

蒸馏水

1个

将载玻片放入装有Bouin溶液的载玻片架中，然后将其紧密合上。
将玻片在Bouin溶液中于60°C孵育1小时。
将溶液丢入标签正确的废液瓶中。
笔记：

由于Bouin溶液中含有甲醛，苦味酸和乙酸，因此是一种危险溶液，应采取正确的安全措施和处置措施。少于10％的水中的苦味酸具有爆炸性。
使用后，应按照有关处理有害溶液的机构指导方针，在适当的废物容器中丢弃溶液。
用自来水冲洗载玻片5分钟，以确保完全除去Bouin溶液。
将幻灯片转移到coplin罐中。
用Weigert的苏木精将组织切片染色10分钟（配方1）。
注意小号：

Weigert的铁苏木溶液将使nu clei染成深紫色/黑色。有关处置指导，请参见步骤H7的注释b。
Weigert的铁苏木与染色质和核结构结合。苏木精的氧化产物血红素是阴离子的，因此对DNA没有良好的亲和力。但是，铁盐与血红素的结合会产生带正电荷的染料复合物，该染料复合物可以有效地与阴离子染色质结合。
用自来水冲洗5分钟，然后用蒸馏水冲洗两次。
在Biebrich猩红色- 酸性品红溶液中孵育玻片5分钟（配方2）。
注意小号：

Biebrich猩红色- 酸性品红溶液会使细胞质和肌肉组织染成红色。红色染色减少表示染色液已陈旧或使用过度。有关处置指导，请参见步骤H7的注释b。
像其他实验污渍一样，Biebrich Scarlet 的化学基础和确切机理仍不清楚。但是，其对低pH细胞质和肌纤维的特异性是通过磷钨/磷钼酸的组合进行额外处理而获得的，这使得渗透性较低的结构能够保留红色，同时从胶原纤维中去除染料。
用蒸馏水冲洗玻片3次。
将幻灯片放到磷钨/磷钼酸溶液中10分钟（配方3）。
注意：磷钨/磷钼酸溶液用作脱色剂，可导致Biebrich猩红色酸品红从胶原纤维中扩散出来，同时使肌肉纤维染成红色。有关处置指导，请参见步骤H7的注释b。

排干玻片，将其直接转移至苯胺蓝5分钟（配方4）。
注意小号：

苯胺蓝会使胶原蛋白染成蓝色。有关处置指导，请参见步骤H7的注释b。
由于先前的反应（H14）与磷钨/磷钼酸的混合混合物的作用，两性苯胺蓝染料现在可以染色胶原纤维。
用蒸馏水冲洗玻片3次。
通过将载玻片在1％乙酸中孵育1分钟来区分染色的组织结构的颜色（配方5）。
笔记：

如果结缔组织的蓝色染色消失，则应缩短在乙酸溶液中的孵育时间。
可以将醋酸溶液与流水一起丢弃在水槽中。
用蒸馏水冲洗玻片。
在95％乙醇中脱水，然后在100％乙醇中脱水2分钟。
注意：根据组织的不同，可以减少脱水时间，以避免红色褪色。

在二甲苯中清洗载玻片2分钟。
用Cytoseal XYL 固定介质进行安装，方法是将两滴液滴滴在切片上，并用盖玻片覆盖。
排干多余的细胞密封并干燥载玻片。
使用光学显微镜对图像进行切片。
注意小号：

4x或10x物镜可用于各部分的概述，更详细的图片可使用20x - 100x物镜。
组织纤维化程度的分析可以由病理学家手动完成，也可以使用成像/处理软件（例如Image J，Photoshop和Aperio）进行定量分析。

数据分析

为了可视化胶原蛋白在不同的受影响器官/组织中的沉积/分布，并将其与相应的健康组织进行比较，有必要对整个器官进行切片，并对受影响和未受影响的组织的相似区域成像。
可以使用图像分析方法（例如，Image J，Photoshop和Aperio）对存在于组织切片中的结缔组织/胶原蛋白（蓝色）的程度进行定量。使用Aperio Scanscope XT（Leica），可以扫描整个幻灯片图像，并使用Aperio颜色解卷积算法来量化胶原蛋白程度。例如，GA肌肉中被Masson's Trichrome染色的纤维化区域可以表示为结缔组织面积（蓝色染色）的百分比除以扫描的总面积。WT和不同年龄小鼠肌肉的比较可以评估结缔组织/胶原蛋白区域的逐渐增加。这种进展与结缔组织扩张引起的肌纤维侵袭的增加直接相关，导致结缔组织的肌纤维结构破坏和功能丧失（Zanoteli 等人，2010； van de Vlekkert 等人， 2019）。可以对用Masson's Trichrome染色的所有组织进行类似的分析。
有关Aperion Scanscope 和软件的更多信息，请访问网站和用户指南：https : //aperiosoftware.com/
https://tmalab.jhmi.edu/aperiou/userguides/Image_Analysis_UG.pdf

笔记

Masson的三色染色程序已针对我们的实验室进行了优化。一些过程步骤和试剂组合物进行了调整，从公开的方案（R uegg 和意谓，2015;卡森等人，1990）。

菜谱

魏格特的铁苏木精
将一份溶液A与一份溶液B混合。工作溶液在室温下稳定10天。

解决方案A

S 表在室温下放置1年。

1.0克苏木精

500.0 ml乙醇190证明

解决方案B

S 表在室温下放置1年。

20.0毫升的29％氯化铁

5.0毫升盐酸

475.0毫升蒸馏水

Biebrich猩红色酸品红溶液
在室温下稳定6个月。

2.7克Biebrich猩红色

0.3克酸性紫红色

3.0毫升冰醋酸

300.0毫升蒸馏水

磷钨酸/磷钼酸
在室温下稳定6个月。

25.0克磷钨酸

25.0克磷钼酸

1.0升蒸馏水

苯胺蓝
在室温下稳定6个月。

2.5克苯胺蓝

1.0毫升冰醋酸

100.0毫升蒸馏水

1％醋酸
在室温下稳定2年。

1.0毫升冰醋酸

99.0毫升蒸馏水

致谢

经费：这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）赠款R01GM104981，RO1DK095169和CA021764，孟菲斯的阿西西基金会以及美国黎巴嫩叙利亚联合慈善机构的部分支持。该协议改编自van de Vlekkert 等人。，2019。

利益争夺

作者没有利益冲突或利益冲突声明。

伦理

将动物饲养在完全由AAALAC（实验室动物护理评估和鉴定）认可的动物设施中，该动物设施具有受控的温度（22 °C ），湿度和光照（交替的12小时光照/黑暗周期）。随意提供食物和水。小鼠中的所有程序均根据圣裘德儿童研究医院机构动物护理和使用委员会以及美国国立卫生研究院指南批准的动物规程进行。

圣裘德儿童研究医院环境健康与安全办公室的程序得到执行，以确保按照州和联邦法规正确处置所有有害物质。

参考文献

卡森·F（1990）。组织技术自学教科书。1990，第一版，pp142-143，ASCP，生病
de Geest，N.，Bonten，E.，Mann，L.，de Sousa-Hitzler，J.，Hahn，C. and d'Azzo，A.（2002）。全身和神经系统异常可区分小鼠的溶酶体疾病唾液酸中毒和半乳糖唾液酸中毒。哼哼Mol Genet 11（12）：1455-1464。
Gattazzo ，F.，Urciuolo ，A.和Bonaldo ，P.（2014）。细胞外基质：干细胞生态位的动态微环境。Biochim Biophys Acta 1840（8）：2506-2519。
Hinderer，S.和Schenke-Layland ，K.（2019）。心脏纤维化-原因和治疗策略的简短回顾。Adv Drug Deliv Rev 146：77-82。
RT肯德尔（Kendall）和加利福尼亚州费加利-博斯特威克（Feghali-Bostwick）（2014）。纤维化中的成纤维细胞：新颖的作用和介质。前沿药理学5：123。
Lederer，DJ和Martinez，FJ（2018）。特发性肺纤维化。Ñ 英格兰医学杂志379（8）：797-798。
MAA的Mahdy （2019）。骨骼肌纤维化：概述。细胞组织研究375（3）：575-588。
Majo ，J.，Klinkhammer ，BM，Boor，P.和Tiniakos ，D.（2019年）。器官纤维化的病理学和自然史。Curr Opin Pharmacol 49：82-89。
Rockey ，DC，Bell，PD和Hill，JA（2015）。纤维化-器官损伤和衰竭的常见途径。Ñ 英格兰医学杂志372（12）：1138至1149年。
Ruegg，M.和Meinen，S.（2015年）。Masson三色染色切片的组织病理学。SOP。2015 V 1.0，MDC1A_M.1.2.003。瑞士巴塞尔。
van de Vlekkert，D.，Demmers，J.，Nguyen，XX，Campos，Y.，Machado，E.，Annunziata，I.，Hu，H.，Gomero，E.，Qiu，X.，Bongiovanni，A. ，Feghali-Bostwick，CA和d'Azzo，A.（2019）。过量的外泌体释放是将溶酶体缺乏症与广泛性纤维化联系起来的致病途径。科学建议5（7）：eaav3270。
Zanoteli ，E.，van de Vlekkert，D.，Bonten ，EJ，Hu，H.，Mann，L.，Gomero，EM，Harris，AJ，Ghersi ，G.和d'Azzo，A.（2010）。神经氨酸酶1缺陷型小鼠的肌肉变性是由结缔组织扩张引起的肌纤维浸润所致。Biochim Biophys Acta 1802（7-8）：659-672。