材料和试剂

C18墨盒（Waters，Sep-Pak，货号：WAT091139）
ZipTipC 18 （默克密理博（Merck Millipore），目录号：ZTC18S096）
NUCLEOSIL ® 100-5 NH 2 （MACHEREY-NAGEL，NUCLEOSIL ，目录号：712200.10）
一次性20 毫升注射器（BD，货号：300296）
过滤纸
Oasis MAX 3 cc Vac滤芯（Waters，Oasis，货号：186000367）
几个明显的化学玻璃瓶，250毫升（PYREX ® ，目录号：1515-06D ），500毫升（PYREX ® ，目录号：1515-08D）
PYREX ® 13×100毫米圆底玻璃管中（Corning，目录号：99449-13）
康宁® 可重复使用的酚醛GPI 13-415螺丝帽与PTFE制的内衬（康宁，目录号：9998-13）
玻璃巴斯德吸管中（Corning，目录Ñ 棕土：7095B-9）和塑料移液管尖端
pH指示条pH 0-14通用指示剂（默克密理博（Merck Millipore），目录号：1.09535.0001）
1.5毫升Eppendorf安全锁管（Eppendorf，目录号：0030120086 ）
氢氧化钠（Merck Millipore，目录号：106498）
二甲基亚砜（DMSO）（Merck Millipore，目录号：1029310161）
甲基碘（用银稳定）（Merck Millipore，目录号：806064）
100％乙酸（冰）（默克密理博）
乙腈（ACN）（VWR化学品，目录号：20060.320 ）
甲醇（VWR化学品，目录号：BDH1135-1LP）
3,4-二氨基二苯甲酮（DABP）（Acros Org anics TM ，目录号：184800250）
醋酸铵（NH 4 OAc）（Sigma Aldrich，目录号：5.43834）
三氟乙酸（TFA）（Sigma-Aldrich，目录号：302031-100m），在4 °C下储存
甲酸（FA）（默克密理博（Merck Millipore），目录号：5.438040.100 ）
2.5％ACN（200毫升）（请参阅食谱）
10％ACN（200毫升）（请参阅食谱）
25％ACN（200毫升）（请参阅食谱）
50％ACN （200毫升）（请参阅食谱）
0.1％TFA（50毫升）（请参阅食谱）
75％ACN，0.1％TFA（50毫升）（请参阅食谱）
95％ACN（50毫升）（请参阅食谱）
95％ACN，0.1％FA（50毫升）（请参阅食谱）
50％ACN，0.1％FA（50毫升）（请参阅食谱）
1 M醋酸铵（NH 4 OAc）（请参阅食谱）
50％ACN，2.5 mM NH 4 OAc（50 ml）（请参阅食谱）
50％ACN，10 mM NH 4 OAc（50 ml）（请参阅食谱）
100 mM NH 4 OAc（200 ml）（请参阅食谱）
80％ACN，1 mM NH 4 OAc（200 ml）（请参阅食谱）
60％乙腈，20％甲醇，100 mM NH 4 OAc （200毫升）（请参阅配方）

设备

陶瓷研钵和杵
实验室通风柜
50°C加热器
涡流精灵® 2（科学工业）加上9-16毫米的泡沫插入物（科学工业，型号：503-0278-00）
学者SpeedVac中® 浓缩器（热科学，型号：ISS110）与转子（Thermo Scientific的，目录号：RH20-12）
MALDI-TOFTOF 4700蛋白质组分析仪或任何等效的MALDI-TOFTOF系列（Applied Biosystems，Sciex ）质谱仪

软件

数据浏览器版本4.5 （应用生物系统）

程序

聚糖的全甲基化
任何合理大小的聚糖，包括使用常规方法从糖蛋白，细胞，组织和器官制备的哺乳动物N- 和O- 聚糖的正常范围（Jang-Lee 等，2006；Morelle和Michalski ，2007）。根据聚糖的释放方法，具有游离末端或还原末端的还原基可进行此处所述的过甲基化和样品净化/ 微分离操作。重硫酸化糖胺聚糖片段没有被测试，但50 皮摩尔起始的材料四硫酸diLacNAc 四糖
可以有效地被甲基化，保留在SepPakC18中，并通过随后的MALDI-MS分析成功检测到（Yu 等，2009）。

将适当准备的聚糖样品（在M illi-Q水中）分装到13 x 100 mm玻璃管中。
用SpeedVac 干燥聚糖。
将5 ml DMSO加入研钵中，然后加入5个NaOH沉淀。使用杵将NaOH颗粒研磨成浆液。
将0.2 ml的NaOH / DMSO浆液添加到含有聚糖的玻璃管中，然后添加0.1 ml的甲基碘。在实验室通风柜中执行此步骤。
将样品放在涡旋混合器上，在4°C轻轻涡旋3 h
直接将0.2 ml冷的M illi-Q水滴加到玻璃管中以淬灭反应，然后小心地用几滴5％的乙酸水溶液中和。用pH指示条检查样品的pH值直至pH为5-8。通过将样品放在通风橱中的氮气流下除去甲基碘。
注意：中和的反应混合物可以直接装入Oasis®MAX 柱中（请参阅过程E）。

Sep-Pak C18清除过甲基化聚糖
依次用3 ml 100％ACN，3 ml甲醇和3 ml水平衡C18 Sep-Pak柱。
将中和的反应混合物转移到已涂底漆的C18 Sep-Pak柱中。
随后用5 ml的水，5 ml的2.5％ACN和10％ACN清洗墨盒，以去除亲水性盐和污染物。
用3 ml 25％ACN 洗脱全甲基化聚糖，然后将3 ml 50％ACN洗脱到同一试管中。
笔记：

二硫酸化的全甲基化N-聚糖将以25％的ACN馏分收集，单硫酸化的非硫酸化的全甲基化N-聚糖将以50％的ACN馏分洗脱。
对于O-聚糖，通常会以25％的ACN分数发现二硫酸化，单硫酸化，较小的非硫酸化全甲基化O-聚糖的一部分，而较大的单硫酸化全甲基化O-聚糖和较大的非硫酸化的O-聚糖将以50％的ACN分数收集。
通过SpeedVac 干燥样品

通过MALDI-MS在负离子模式下筛选过甲基化的硫酸化聚糖
在1.5 ml Eppendorf管中，在75％ACN和0.1％TFA中制备10 mg / ml 3,4-二氨基二苯甲酮。
溶于20-50全甲基化的聚糖样品μ 升的ACN 。
注意：溶解样品的乙腈的量高度取决于聚糖的量。如果数量是不清楚的，20-50 μ 升ACN的是一个很好的起始体积。

取0.5 微升样品，并用充分混合0.5 微升在Eppendorf管3,4-DABP作为基质的。
将混合后的样品点到50 °C加热器上方的MALDI目标板上。
在负离子模式，反射器模式下获取MS数据。
根据结晶状态在手动或自动目标移动下获取MS数据
激光能量为组3 ，4 -DABP类似于2,5--DHB。在我们的4700蛋白质组学分析仪和4800加MALDI TOF / TOF分析仪的经验，激光能量设置为4左右，500-5 ，使用000激光的Nd-YAG 200赫兹。
典型的采集包括总共20个子光谱，每个子光谱有50个激光发射。

胺尖端分离硫酸化的全甲基化聚糖和非硫酸化的聚糖
准备自包装的胺尖。
取200 μ 升黄色移液管尖端和通过使用5的堵塞其用滤纸（0.1厘米×0.1厘米大小）锥形端厘米长度n eedle或任何等同的工具（如在图2A中示出）。
吸收甲醇中的胺珠，并将其装入黄色尖端。的黄色枪头填充珠子的体积通常为20 μ 升。
使用20毫升注射器的柱塞（图2B）轻轻施加压力以冲洗出甲醇（图2C）。不要完全弄干自包装的胺尖。
通过添加100μl100 ％ACN来平衡填充的胺尖，并再次使用20 ml注射器柱塞施加压力以推出溶剂。与另一个100遵循微升95％ACN的0.1％FA和100 微升50％ACN的0.1％FA，和100 微升95％ACN的0.1％FA，顺序。
溶解从全甲基化的聚糖步骤B5在20-50 μ 升100％ACN的。
将过甲基化的聚糖加载到自填充的胺尖上，并收集通过Eppendorf管的流量。
将通过样品收集的流重新装到吸头上，并通过新的Eppendorf管收集流。
用100洗尖端μ 升95％ACN的。收集流通液并在同一Eppendorf管中洗涤馏分。该试管包含未硫酸化的全甲基化聚糖。
洗脱单硫酸化的全甲基化的聚糖与100 微升2.5 毫NH 4 OAC于50％ACN ，并收集在新的Eppendorf管中的洗脱液。
洗脱二硫酸化的全甲基化的聚糖与100 μ 升10 mM的NH 4 OAC于50％ACN ，并收集在新的Eppendorf管中的洗脱液。
通过MALDI-MS在负离子模式下筛选样品（与步骤C相同）。

图2.演示如何制作自包装胺尖。步骤1.用针将黄色吸头插入滤纸中（如A所示）。步骤2.使用20米升注射器，柱塞和放在一个塑料软管上的注射器以配合黄色尖端（B中示出）。步骤3.使用注射器将溶剂珠粒装到黄色尖端中，以洗去溶剂（C所示）。

由绿洲从非硫酸那些硫酸全甲基聚糖的分离® MAX
平衡的绿洲® MAX盒机智ħ3毫升95％ACN和3ml 100mM的NH的4 OAC 。
将1 ml的100 mM NH 4 OAc加到小柱中，装入中和的反应混合物（步骤A），并将所有未结合的样品收集在一个玻璃管中。将未结合的馏分重新装入MAX柱。
先用1 ml 100 mM醋酸铵洗涤墨盒，再用6 ml水洗涤，以除去尽可能多的盐。
用6 ml的95％ACN洗脱未硫酸化的全甲基化聚糖，并将洗脱液收集到新的玻璃管中。
用在80％ACN中的6 ml 1 mM NH 4 OAc 洗脱单硫酸化的Permthylated 聚糖，并将洗脱液收集在新的玻璃管中。
用溶于60％ACN和20％甲醇中的3 ml 100 mM NH 4 OAc 洗脱含更多硫酸盐的全甲基化聚糖，并将洗脱液收集到新的玻璃管中。
通过SpeedVac 干燥样品
注意：此混合模式滤芯可一步一步直接纯化并顺序分离成未硫酸化和硫酸化的聚糖。

通过ZipTipC 18 进一步清除过甲基化的聚糖或浓缩
将全甲基化的聚糖（在ACN中）转移到0.5 ml或1.5 ml Eppendorf管中并干燥。
溶解全甲基化的聚糖在20 μ 升10％的ACN 。
注意：要在10％ACN，使用2全甲基化的聚糖的更好的溶解度μ 升100％ACN的再溶解和顺序地添加18 μ 升的水中，同时不断涡流管。

均衡ZipTipC 18 由10 μ 升的50％甲Ç N，0.1％TFA，然后10 μ 升0.1％的TFA 。
通过移液几次加载样品。
洗涤ZipTip Ç 18 由1 0 μ 升TFA，三倍的0.1％。
洗脱聚糖由10 μ 升50％的ACN ，0.1 ％TFA，体积或更小，收集到微管或与基质直接点样到MALDI目标板上，然后MS采集（步骤C）。

数据分析

甲LL的MALDI-MS数据被手动解释。在哺乳动物糖基化中，常见的糖基残基为Hex，HexNAc ，dHex （Fuc ），Neu5Ac和Neu5Gc，全甲基化形式的标称质量分别为204、245、174、361和391 u。可以很容易地计算出准确的单同位素形式和不同单糖形式的准确质量，或参考Dell 等人的表I。（1994）。对于处于负离子模式的全甲基化聚糖的M ALDI-MS ，未硫酸化的全甲基化聚糖通常不提供任何负离子信号，因为所有羟基（OH）已被衍生为O- 甲基（OMe ）和羧基（COOH））唾液酸到甲基酯（COOMe ）的组合。
要在负离子模式下计算硫酸化过甲基化聚糖的单电荷m / z 值，请使用以下通式：
单硫酸化的全甲基化聚糖，检测为[MH] -
m / z =（CH 3 + OCH 3 ）+Σ糖基残基质量+（OSO 3 -- OCH 3 ）

检测为[M + Na-2H]的二硫酸化全甲基化聚糖-
m / z =（CH 3 + OCH 3 ）+Σ糖基残基质量+ 2 x（OSO 3 -- OCH 3 ）+23

（CH 3 + OCH 3 ）分别对应于非减少和减少的最终质量，标称质量为46 u。对于通过还原消除从糖蛋白释放的O- 聚糖，以及任何其他预先还原的N- 聚糖，其还原端为醛糖醇状态（标注为-itol ），相应的标称质量为62你（OSO 3 -- OCH 3 ）指携带的第一硫酸盐，对应于65 u质量增加，并且带负电。此后，对于二硫酸基聚糖和多硫酸基聚糖，由于第二硫酸盐的电荷被钠平衡，因此每个额外的硫酸盐基团均使单硫酸基聚糖的质量增加88 u（65 + 23 u）。例如，在图3中，单硫酸化的NeuAc 1 Hex 2 HexNAc 2 -itol 的[MH] - 分子离子信号在m / z 1386 对应于[62 + 361 + 204 x 2 + 245 x 2 + 65] ，而对于二硫酸化Hex 3 HexNAc 3 -itol，在[ m / z 1562 ]处的[M + Na-2H] - 分子离子信号对应于[62 + 204 x 3 + 245 x 3 + 65 + 88]。

通常容易产生与在MALDI电离过程中二硫酸和多硫酸化聚糖损失亚硫酸钠（-102 u，NaSO 3 ）相对应的信号。有时仅检测到这些，而不检测到所有硫酸盐。它的质量也等同于单硫酸化物质的-14 u，并且与任何甲基化不足的形式（如果存在）重叠（如Khoo和Yu （2010）中的图1.3A所示）。
注意：在实践中，相对信号强度monosodiated ，二硫酸化的全甲基化的聚糖和那些就吃克损失的额外的亚硫酸钠从样本到样本而异，也一定程度上取决于MALDI-MS仪器条件。在图3B所示的示例中，在m / z 1562处的二硫酸O-聚糖离子信号的强度比在m / z 1460处的信号强得多，但是在其他样品中也观察到了相反的模式。

图3. 在负离子模式下，单硫酸化（A）和二硫酸化（B）的全甲基化O- 聚糖的MALDI-MS谱图。使用此处所述的方案，通过胺珠将单硫酸化和二硫酸化的全甲基化O-聚糖分为不同的馏分。的单硫酸化ø -glycans是在较早的2.5mM NH洗脱4 OAC于50％ACN 组分（A），而二硫酸化ø -glycans在10mM的NH 4 OAC于50％ACN 级分（B）。如原始报告中所述（Yu et al。，2018），此处显示的O- 聚糖从用GlcNAc6ST-2转染的结肠癌细胞系SW480 中还原释放。

笔记

如果未唾液酸化的唾液酸的羧基在全甲基化过程中仍未被甲基酯化，则未硫酸化的唾液酸化的聚糖将与硫酸化的聚糖共洗脱，并以负离子模式被检测到。该甲基化不足的问题可以通过回收的聚糖的再甲基化来解决。在进行过甲基化之前，先用石墨化碳柱对天然聚糖进行纯化，这可能有助于实现完全过甲基化。详细的协议在Khoo和Yu（2010）中进行了描述。

菜谱

2.5％乙腈（200毫升）
5毫升100％乙腈

195毫升ddH 2 O

10％乙腈（200毫升）
20毫升100％乙腈

180毫升ddH 2 O

25％乙腈（200毫升）
50毫升100％乙腈

150毫升ddH 2 O

50％乙腈（200毫升）
100毫升100％乙腈

100毫升ddH 2 O

0.1％TFA（50毫升）
50 μ 升在49.95毫升的的DDH TFA的2 ö

75％ACN，0.1％TFA（50毫升）
37.5毫升100％乙腈

12.45毫升的ddH 2 O

50 μ 升TFA的

95％ACN（50毫升）
47.5毫升100％乙腈

2.5毫升ddH 2 O

95％ACN，0.1％FA（50毫升）
47.5毫升100％乙腈

2.45毫升的ddH 2 O

50 μ 升FA的

50％ACN，0.1％FA（50毫升）
25毫升100％乙腈

24.95毫升的ddH 2 O

50 μ 升FA的

1 M醋酸铵（NH 4 OAc）
在去离子水中制备100 ml 1 M乙酸铵（NH 4 OAc）作为储备溶液：

7.7克NH 4 OAc，100毫升ddH 2 O

50％ACN，2.5 mM NH 4 OAc（50毫升）
25毫升100％乙腈

0.125毫升1M NH 4 OAc

24.875毫升的ddH 2 O

50％ACN，10 mM NH 4 OAc（50毫升）
25毫升100％乙腈

0.5毫升1 M NH 4 OAc

24.5毫升ddH 2 O

100 mM NH4OAc（200毫升）
20毫升1 M NH 4 OAc

180毫升ddH 2 O

80％ACN，1 mM NH 4 OAc（200毫升）
160 ml 100％乙腈

0.2毫升1 M NH 4 OAc

39.8毫升ddH 2 O

60％乙腈，20％甲醇，100 mM NH 4 OAc（200毫升）
120毫升100％乙腈

40毫升甲醇

20毫升1 M NH 4 OAc

20毫升ddH 2 O

致谢

Yu 等人最初开发了基于MA LDI-MS分析过甲基化聚糖的糖酵解工作流程。（2009），如Khoo和Yu （2010）所述，并通过引入MAX分馏方法进一步完善，如Cheng 等人（2009）。（2013年）。它是由中国科学院支持中央研究院，台湾行政院国家科学委员会授予竹脚妇幼医院和NRPGM核设施蛋白质组学和糖组学位于IBC，学术界报。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

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