材料和试剂

1. 实验室标签胶带

2. 60×15毫米大小适中培养皿（Crystalgen ，目录编号：S-3004）

3. 90％的铂金，10％的铱线（Tritech Research，目录号：PT-9010）

4. 0.1-10 Myueru 微管提示（VWR，目录号：46620-316）

5. 1-200 Myueru 微管提示（VWR，目录号：53508-783）

6. 100-1 ，250个Myueru 微管提示（VWR，目录号：53508-918）

7. 15毫升离心管（热尔科技，目录号：339650）

8. 50 ml离心管（VWR，目录号：89401-572）

9. 30毫升注射器（Fisher Scientific公司，目录号：309650）

10. 无菌针筒过滤器，5 Myuemu ，25毫米（帕尔，目录号：4199）

11. 点板（Thomas Scientific，目录号：7812G17）

12. 9 mL玻璃培养管（VWR，目录号，47729-572）

13. 2毫升玻璃吸管（VWR，目录号码：14 673-043）

14. 18 x 18 mm，＃1.5厚度的显微镜盖玻片（Fisherbrand ，目录号：12-541A）

15. 25 x 75 x 1.0 mm显微镜载玻片（Fisherbrand ，目录号：12-550-A3）

16. 纸巾

17. 1.5毫升微量离心管

18. 蜗杆抓手（Tritech Research，目录号：TWPH1）

19. 大肠埃希菌OP50（明尼苏达大学，秀丽隐杆线虫遗传中心）

20. 秀丽隐杆线虫CA1202（体细胞组织中生长素诱导的降解实验的对照菌株）（明尼苏达大学，秀丽隐杆线虫基因中心，基因型：ieSi57 [ eft -3 > TIR1 :: mRuby ] II；ieSi58 [ eft -3 > AID ：：GFP ] IV）

21. 6.0 Pasento次氯酸钠溶液（Ace五金，目录号：1912120）

22. 萘乙酸酸（K-NAA）（植物技术实验室，目录号：N610）

23. 固定琼脂（VWR，目录号：0815）

24. 钠叠氮化物（NAN 3 ）（Sigma-Aldrich公司，目录号码：S2002）

25. 氯化钠（NaCl的）（Fisher Scientific公司，目录号：S271-3）

26. 蛋白ept （Thermo Fisher Scientific ，目录号：211677）

27. 细菌琼脂（实验室科学，目录号：A466）

28. 100％乙醇（Pharmco ，目录号：111000200）

29. 双蒸馏水（ddH 2 O）

30. 氢氧化钾（BioOH ，目录号：0489）

31. 胆固醇（BioExpress ，目录号：0433）

32. 氯化钙（CaCl 2 ）（Fisher Scientific，目录号：C79-500）

33. 硫酸镁（MgSO 4 ）（Fisher Scientific，目录号：M63-500）

34. 磷酸一钾（KH 2 PO 4 ）（Fisher Scientific，目录号：BP362）

35. 磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（Fisher Scientific，目录号：BP363）

36. 磷酸二钠（Na 2 HPO 4 ）（Fisher Scientific，目录号：S374）

37.5 M KOH储备溶液（请参阅配方）

38.5 mg / ml胆固醇（请参阅食谱）

39.1 M CaCl 2 储备溶液（请参阅配方）

40.1 M MgSO 4 储备溶液（请参阅配方）

41.1 M KPO 4 ，pH 6.0储备溶液（请参见配方）

42. 250 MM K-NAA原液（参见食谱）

43. 线虫生长培养基（NGM）板（请参阅食谱）

44. 含有K-NAA的NGM板（请参阅食谱）

45.1 x M9缓冲区（请参阅食谱）

46. 1个M9缓冲区中的K-NAA （请参阅食谱）

47.5 ％琼脂糖（请参阅食谱）

48.1 M NaN 3 储备溶液（请参阅配方）

49. 含有NaN 3的琼脂糖（请参阅食谱）

50. 含有NaN 3的琼脂糖垫（请参见食谱）

配套设备

0.1-2 Myueru 微管（托马斯科学，目录号：P3960-2A-B）
2-20 Myueru 微管（托马斯科学，目录号：P3960-20A-B）
20-200 Myueru 微管（托马斯科学，目录号：P3960-200A-B）
100-1 ，000 Myueru 微管（托马斯科学，目录号：P3960-1000A-B）
橡胶移液器灯泡（Thomas Scientific，目录号：1951F25）
微波炉
本生灯
规模
250毫升储存瓶
500毫升储存瓶
1 L储物瓶
4 L锥形瓶
磁力搅拌棒
高压釜
搅拌板（Corning，型号：PC-310）
涡旋混合器（VWR，目录号：10153-838）
微量仪（Eppendorf，型号：离心机5424）
台式离心机（贝克曼库尔特公司，型号：Allegra X-12R）
试管摇杆（Benchmark Scientific，型号：M2100）
干浴培养箱（Fisher Scientific，目录号：11-718）
解剖显微镜（蔡司，型号：Stemi 508）
EM-CCD相机（滨松，型号：C9100-23B）
旋转盘共聚焦显微镜（横河电机，型号：CSU10）

软体类

ImageJ（版本：2.0.0-rc-69 / 1.52p）

程序

次氯酸钠处理使L1期同步
注意：通过产卵同步是可以使用的另一种方法（Gidalevitz 等，2009）。

准备NGM板（食谱7）。
NGM板种子200-300 Myueru 过夜培养中的大肠杆菌OP50在无菌条件下，将平板干在室温约48 H.储存在4 ℃，直到使用。暖板在室温下才可使用。
蠕虫选择器使用，挑期望数量L4期CA1202蠕虫或任何AID-标记菌株的兴趣，走上接种NGM板大肠杆菌OP50。允许蠕虫生长，直到成年。根据不同的费率使用中，成长温度介于15至25 °C 之间（Stiernagle，2006年）。
通过用ddH 2 O 洗涤平板，在15 ml离心管中回收妊娠的成虫。
加入ddH 2 O至8 ml的总体积。
加入600μl5 M KOH。
1200添加Myueru 6.0 Pasento次氯酸钠溶液。
将蠕虫放在低速摇杆上7-9分钟。
使用台式离心机在室温下以400 x g的速度离心1分钟，以沉淀颗粒，然后快速但小心地倾析上清液。
注意：如果需要，请使用含9.8毫升ddH 2 O 的平衡器。

在沉淀物中加入10 ml的ddH 2 O，颠倒3-4次，轻轻混合。
颗粒通过台式离心机在室温下以400 x g 离心2分钟来释放卵子，迅速而小心地倾析上清液。
注意：如果需要，请使用含有10 ml ddH 2 O 的平衡器。

向沉淀物中加入10 ml 1x M9缓冲液，轻轻颠倒3-4次将其混合。
重复步骤A11。
向沉淀物中加入1x M9缓冲液至最终体积为3 ml，并在低速摇杆上于20 °C 孵育卵。
孵育16小时后，将所需浓度的L1蠕虫添加到接种有OP50的2-3个NGM板中。
使用标准的生长条件，使蠕虫生长到所需的发育阶段（Stiernagle ，2006年）。

固体培养基上的生长素处理
准备包含1 mM 或4 mM K-NAA的NGM板（配方8 ）。
NGM板含种子K-NAA 200-300 Myueru 过夜培养中的大肠杆菌OP50在无菌条件下，将平板干在室温约48 H.储存在4 ℃，直到使用。温暖牌在室温前使用。
在一旦发育阶段需要，已同步蠕虫在1.5ml 微量管洗涤板采用500 Myueru 中1X M9的缓冲区。
通过使用微量离心机在室温下以200 × g的速度离心2分钟来轻轻地沉淀蠕虫。
用微量移液器小心地除去尽可能多的上清液，并丢弃。
轻轻敲击试管底部，混合剩余的内容物（即蠕虫和残留的细菌性食物）。
分配内容物均匀涂抹于2-3 NGM板含有K-NAA接种大肠杆菌OP50（100-200蠕虫每盘）。
少等待30分钟，以观察生长素诱导d降解援助-标记C. 线虫下蛋白质旋转盘共聚焦显微镜（图1 ）。在这个时候，评分制备琼脂糖垫包含的NaN 3 （配方14和程序D ）。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1903029--1360 DavidMatus 846754 \图jpg \图2.jpg

图1 K-NAA介导的降解在C. 线虫。微分干涉对比（DIC）和相应的绿色荧光蛋白（GFP）图像子宫锚细胞（ACS）（箭头）在中间L3阶段C. 线虫幼虫发展。比例尺，5 MYU 中号。

液体介质中的生长素处理
在1x M9缓冲液中（配方10）准备1 mM 或4 mM K-NAA。在4 °C下储存直至使用，使用前在室温下加热溶液。
准备一个室内湿度培养箱（图2 ）。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1903029--1360 DavidMatus 846754 \图jpg \图1.jpg

图2 。一个内部的湿度孵化箱。湿纸巾放在沿四底部边缘的空吸管盒及干纸巾连接到内表面上的盖子，然后将湿纸巾应该创建一个口袋A的点板适合。

一旦处于所需的发育阶段，通过在1x M9缓冲液中用500μlK -NAA 洗涤板，在点板上回收同步的蠕虫（每孔100-200个蠕虫）。
注意：直接从板上清洗蠕虫可转移细菌食物来源，防止短期饥饿（〜2 h）。可以根据需要重新悬浮其他细菌食物。我们建议让蠕虫在点板上自由free打而不是一个1.5毫升的微量离心管，因为它降低了我们手中的降解效率。

将点样板放入室内湿度培养箱中（图2 ）。合上盒盖。
少等待30分钟，以观察生长素诱导降解援助-标记C. 线虫下蛋白质旋转盘共聚焦显微镜（图1 ）。在这个时候，评分制备琼脂糖垫包含的NaN 3 （配方14和操作D ）。

蠕虫安装和麻醉
30分钟后，轻轻掰开两个显微镜载玻片接口连接利用的琼脂糖凝胶垫包含的NaN 3 。使用显微镜载片用的琼脂糖凝胶垫含麻醉剂。
注意：我们建议在5分钟内使用琼脂糖垫以防止干燥。

在固体培养基上进行生长素处理时，将1.2μl 的1x M9缓冲液添加到垫的中心，拾取30-50个蠕虫并将其轻轻轻拍在M9 上，使用解剖显微镜以确保蠕虫已完全从蠕虫拾取器中移出。。
生长素治疗在液体培养基中，删除1.2-2 Myueru 用微量˚F 罗中心的现货板孔并删除蠕虫在中心垫。
将显微镜盖玻片轻轻放在琼脂垫上。
注意：为避免气泡在盖玻片下面出现，将盖玻片成45度角，然后将盖玻片轻轻地放到琼脂垫上，应轻轻地盖上盖玻片以免外阴排出，我们不建议按下释放后在盖玻片上盖上。

蠕虫成像
将显微镜载玻片放在载物台上，并用载物台夹固定。
将10倍物镜移到适当位置。
使用粗调焦旋钮将焦点对准蠕虫。
使用微调焦旋钮完成对蠕虫的聚焦。
在盖玻片上滴一小滴油。
将100倍物镜移到适当位置。
使用微调旋钮缓慢聚焦在感兴趣的组织或细胞上。
使用连接到旋转盘共聚焦显微镜的EM-CCD相机收集16位z堆栈图像。
成像参数（例如，曝光设置和激光功率）应记录在案并保持一致。

资料分析

打开ImageJ软件（版本：2.0.0-rc-69 / 1.52p）。
单击分析> 设置度量，确保选择了平均灰度值。
拖放包含DIC z堆栈图像的TIFF文件。
滚动浏览DIC Z堆栈图像以找到感兴趣的单元格。
放大感兴趣的单元格。
使用徒手选择工具勾勒出感兴趣的单元格（图3）。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1903029--1360 DavidMatus 846754 \图jpg \图3.jpg

图3. DIC显微镜显示的轮廓为d AC的屏幕截图

单击分析> 工具> ROI管理器。
单击添加[t]。
拖放包含相应荧光蛋白z堆栈图像的TIFF文件。
单击ROI（图4）。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1903029--1360 DavidMatus 846754 \图jpg \图4.jpg

图4.表达eft-3 > AID :: GFP 的转基因蠕虫中概述的AC的屏幕快照

单击分析> 测量。
将徒手选择内容拖到图像中的背景区域。
单击分析> 测量。
从目标单元的平均灰度值中减去背景的平均灰度值。
在电子表格中记录计算出的值，并对每个成像的蠕虫重复分析。
通过将生长素处理后的细胞平均灰度值除以生长素处理之前的细胞平均灰度值来归一化数据。
每个治疗条件至少执行三个独立的实验，每个实验至少检查20-30个蠕虫。

注意事项

一直没有测试它是否一个较高浓度K-NAA（> 4 MM ）会抑制大肠杆菌OP50增长，或者它是否会导致更快耗尽AID标签的蛋白质在C. 线虫（马丁内斯等人，2019 ）。总的来说，降解速率是类似中存在1 MM 和4 MM 生长素（张等人，2015年，马丁内斯等人。，2019）一些的内生标记的蛋白质似乎更好地应对4 MM生长素，这种作为核激素受体NHR-25（Martinez et al。，2019）。然而，我们目前认为AID系统中的限速因子是生长素受体TIR1。

菜谱

5 M KOH储备溶液
将280.55 g的KOH溶于1 L 的ddH 2 O中
将200毫升分装到500毫升的储存瓶中并在室温下储存
5毫克/毫升胆固醇
将2.5克胆固醇溶解在500毫升100％乙醇中
在30 °C 混合15-30分钟以溶解
将100毫升分装到250毫升储存瓶中
室温保存
1 M CaCl 2 储备溶液
将73.5 g CaCl 2 溶于500 ml ddH 2 O中，并高压灭菌30 分钟

室温保存

1 M MgSO 4 储备溶液
将60.2 g MgSO 4 溶解在500 ml ddH 2 O中，高压灭菌30分钟

室温保存

1 M KPO 4 ，pH 6.0储备溶液
将68.0 g KH 2 PO 4 溶解在500 ml ddH 2 O中
将52.3 g的K 2 HPO 4 溶解在300 ml的ddH 2 O中
在测量1 M KH 2 PO 4 的pH值时，缓慢加入并搅拌1 MK 2 HPO 4，直到pH值从4.0升至6.0
分装和高压灭菌30分钟
室温保存
250 mM K-NAA储备溶液
在50 ml离心管中将2.243 g K-NAA 溶于40 ml ddH 2 O，并在室温下涡旋以完全溶解该化合物
通过连接到30 ml注射器的无菌注射器过滤器将溶液澄清到新的50 ml 离心管中
储存在4 °C下长达六个月
NGM板
将6 g NaCl ，5 g蛋白ept，34 g细菌琼脂和磁力搅拌棒添加到4 L锥形瓶中
加入1,944 ml的ddH 2 O
高压灭菌30分钟
让NGM冷却到55-60 °C。
加入2毫升5毫克/毫升胆固醇，2 毫升的1M 的CaCl 2 ，2毫升的1M硫酸镁的4 ，和50毫升的1M KPO 4 ，pH 6.0的
在搅拌板上将烧瓶中的药物充分混合
每60 x 15毫米培养皿分配8毫升，使其固化48小时
含有K-NAA的NGM板
在分配高压灭菌的NGM 之前立即添加K-NAA至所需的最终浓度
1对于毫K-NAA，添加32 微升250 毫摩尔K-NAA。的对于4 毫米K-NAA，添加128 微升250 毫摩尔K-NAA
板可在4 °C下保存长达一个月
1个M9缓冲区
6克添加的Na 2 HPO 4 ，3g的KH的2 PO 4 ，和5去˚F 的NaCl -to的1L储存瓶
加1 L的ddH 2 O
将200毫升分装到500毫升的储存瓶中并高压灭菌30分钟
向每个瓶中添加200μl1 M MgSO 4
室温保存
1个M9缓冲区中的K-NAA
在1x M9缓冲液中将K-NAA稀释至所需的最终浓度和10 ml的最终体积
1对于毫K-NAA，稀40 微升250 毫摩尔在960 K-NAA 微升1×M9缓冲液中。将对于4 毫米K-NAA，稀160 微升250 毫摩尔在840 K-NAA 微升1×的M9缓冲
溶液可在4 °C下保存长达一个月
5％琼脂糖
向250 ml的储存瓶中加入5 g 熔化的琼脂糖和磁力搅拌棒
加入100毫升ddH 2 O
微波直到糖完全溶解
将琼脂糖放在搅拌板上，将5毫升等分到9毫升玻璃培养管中
固允许IFY
室温保存
1 M NaN 3 储备溶液
将0.65 g NaN 3 溶解在10 ml的ddH 2 O中
将溶液灭菌并分装到1.5 ml 微量离心管中
在室温下储存长达2-3个月
含N aN 3的琼脂糖
轻轻地将5 ml等分的5％琼脂糖微波加热7 s
使用本生灯，仔细观察并彻底融化琼脂糖
将其放在65 °C 的干浴恒温箱中以防止其固化
将35μl1 M NaN 3 加入5 ml融化的5％琼脂糖中，最终浓度为7 mM
重悬混音
每24小时或在每次成像前准备新鲜
含NaN 3的琼脂糖垫
小心地从2毫升玻璃移液器上取下吸头
在玻璃移液器的顶部安装一个橡胶移液器灯泡。
使用连接在玻璃移液器上的橡胶移液器灯泡，吸出一滴含NaN 3 的琼脂糖，并将其滴到显微镜载玻片上，避免产生气泡。
快速，垂直地将第二个显微镜镜载玻片放在装有麻醉剂的琼脂糖液滴的载玻片上，让琼脂糖凝固
注意：建议垂直侧翼基地显微镜载玻片随着录音的显微镜载玻片同一维度并行放在平坦的水平Surfa 策准备新鲜的每次20分钟。

致谢

该方案改编自Martinez 等人（20 19）。我们感谢K. Ames关于建立室内湿度培养箱的建议，也感谢Matus 实验室，合作者和同事在制定该方案的一部分时进行了深入的讨论。。M.马丁内斯资助的全国学院健康（NIH）国立综合医学科学（NIGMS）[3R01GM121597-03S1 。D. 马特斯也资助由NIH NIGMS [1R01GM121597-01。D. 马特斯接收达蒙·鲁尼恩癌症研究基金会[DRR-47-17]的其他支持。

竞争利益

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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