材料和试剂

丁腈手套
15 ml Amicon 离心过滤器单元3 kDa MWCO（Millipore Sigma，目录号：UFC900308）
移液器吸头1,000 µl，200 µl，20 µl，2 µl
血清移液器
1.5 ml微量离心管
1.7 ml低保留微管（PHENIX Research Products，目录号：MAX-715L）
15 ml锥形管
一次性硼硅酸盐玻璃管（Fisher Scientific，目录号：14-961-29）
30毫升注射器
10毫升注射器
60毫升注射器
0.45 µm过滤装置
0.45 µm混合纤维素酯网格过滤器（Millipore Sigma ，目录号：HABG04700）
1 ml HiTrap SP HP预装色谱柱（GE Healthcare，目录号：17115101）
1 ml HiTrap Heparin HP预装色谱柱（GE Healthcare，目录号：17040601）
Spectra / Por 3 RC透析膜管3500道尔顿MWCO（光谱，目录号：132724）
反相HPLC色谱柱（Thermo Scientific，ProSwift RP-10R 1 mm x 50 mm，货号：164586TS）
20％Ë THANOL
一元磷酸钠（NaH 2 PO 4 ）
50万EDTA
DL-二硫苏糖醇无水（DTT）（Millipore Sigma，目录号：D9779）
氯化钾（KCl ）（Millipore Sigma，目录号：31248）
HPLC级水（Millipore Sigma，目录号：270733）
水中0.1％的甲酸（Millipore Sigma，目录号：576913）
乙腈中的0.1％甲酸（CH 3 CN）（Millipore Sigma，目录号：576956）
硫酸铵（（NH 4 ）2 SO 4 ）
氢氧化钠（Millipore Sigma，目录号：1.06462）
盐酸（HCl）（Millipore Sigma，目录号：H1758）
4-20％Mini-PROTEAN TGX预制蛋白凝胶（Bio - Rad，目录号：4561096）
50 mM碳酸氢铵（NH 4 HCO 3 ）pH 8.0
缓冲区A（请参阅食谱）
缓冲区B（请参阅食谱）

设备

移液器（P1000，P200，P20，P2）
超声仪（Qsonica ，Q500 超声仪，目录号：Q500-110）
离心机（Sorvall RC-6 +）
ÄKTA纯FPLC系统（或类似的液相色谱系统）https://www.gelifesciences.com/cn/gb/shop/chromatography/chromatography-systems/akta-pure-p-05844
高压液相色谱毛细管泵（Agilent，1100系列HPLC，型号：CapPump / G1376A ）
自动进样器（Agilent，1200系列，型号：MicroWPS / G1377A ）
除气器（Agilent，1200系列，型号：Degasser / G1379B ）
傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（Bruker，7T solariX 70 Hybrid FTMS System，型号：277070 ）

软件

适用于ÄKTApure FPLC系统的UNICORN 7控制软件
HyStar 3.4软件（布鲁克）
指南针SolariXcontrol （Bruker）软件
指南针数据分析软件版本4.0（Bruker，https://www.bruker.com/service/support-upgrades/software-downloads/mass-spectrometry.html）
IDCalc软件（MacCoss Lab，https : //proteome.gs.washington.edu/software/IDCalc/ ）

程序

从制备细胞提取物到通过FT-IC R-MS 鉴定和定量蛋白质同工型及其翻译后修饰的方案流程如图1所示。

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图1.该协议步骤的示意性工作流程

蛋白质样品制备
培养并收获所需细胞系后，将细胞重悬于锥形管中的10 ml缓冲液A中。
将细胞放在冰上并通过超声处理裂解细胞悬浮液，在30 s（30 s on / 30 s off）上交替打开/关闭脉冲，直到细胞完全溶解（如使用光学显微镜显示的样子）。
通过在4 °C下以10,000 xg离心15分钟来澄清裂解物。
将上清液转移到另一个锥形管中，并添加硫酸铵至终浓度为70％。
注意：可以在https://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm上找到确定体积的有用计算器。

恒定搅拌溶液孵育在4 ℃下在勒ASTö Ñ Ë 小时。
通过在10,000 xg下于4 °C 离心沉淀来沉淀蛋白质。
将沉淀重悬于10 ml缓冲液A中，并通过0.45 µm过滤器过滤。
储存在4 °C下，直到准备好将其注入样品定量环进行纯化为止；如果不进行纯化，则直到质谱分析。
注意：如果要直接进行质谱分析，请将悬浮液重悬于pH 8.0的50 mM碳酸氢铵（或您选择的MS兼容缓冲液）中，而不是将缓冲液A重悬。

FPLC方法的创建和设置
机器预启动
检查FPLC运行期间使用的所有缓冲液的所有体积，以确保运行期间没有空气进入管线/泵。
注意：所有缓冲液必须至少为300 ml。

50毫升˚F 爱尔康用20％管Ë 为背漂洗溶液THANOL（降低ÄKTA机的右下角）

过滤后的纯净水

20％Ë THANOL

缓冲液A / B

确保正确的行在正确的缓冲区中。
A1 =纯化缓冲液A

A2 =纳米纯水（已过滤）

B1 =纯化缓冲液B

B2 = 20％e 醇（过滤）

每次运行之前，请清空废液容器，以防止系统装满和背压。
灌注入口和清洗泵头
打开ÄKTAPure FPLC，并在短时间内使泵和灯初始化约30 s。
确保在方法运行期间要使用的所有入口管都放置在正确的缓冲液中。
在开放系统控制模块的过程画面中：
单击缓冲液入口。
选择要填充的进样口的位置。以相反的字母顺序选择位置，并从最高编号开始。例如，如果要填充进水阀AB中的所有四个入口，请按照以下顺序B2，B1，A2，A1进行填充。
60ml的注射器连接到第正在准备（泵的泵头中的一个电子排气阀小号EE页91在ÄKTA 纯操作说明书指南）。确保注射器牢固地插入吹扫连接器中。
逆时针旋转排气阀约四分之三圈，打开排气阀。将液体缓慢吸入注射器，直到液体到达泵。
顺时针旋转将其关闭。断开注射器的连接并丢弃其内容物。
对运行期间要使用的每条进口管重复步骤B 2 c-B 2 d 。
在方法编辑器中创建自定义方法
打开“方法编辑器”窗口。
单击[创建新方法] → 选择[机器编号] → 检查[预定义的应用程序]，然后选择用于亲和，离子交换等色谱分析的应用程序，或者如果您希望从头开始定义自己的参数，请选择[空方法] → 单击[确定] 。预定义的应用程序是方法创建的建议选择。
方法设置：
从列表中选择列或保留为“任何”。
如果设置为“ any”，请确保确定色谱柱压力极限并在此窗口中进行相应设置。

选择将在柱阀中使用的正确柱位置。
除非使用多个色谱，否则通常将其设置为“ 1” 。

选择正确的缓冲液入口
A1和B1是默认设置，通常用于缓冲区A和B。

平衡：
选择总体积（柱体积= CV）或平衡条件。
将平衡设置为10 CV缓冲液A或稳定的紫外线15 s，两种方法都可以。

选择％B缓冲液进行平衡。
设为0％

样例应用：
选择回路类型（即，超级回路或毛细管回路）。
选择回路阀（1-5）上的回路位置。
设置将要进样的总样品量（1-99毫升）。
选择所需的分馏：
馏分收集器，用于收集洗脱馏分。

如果选择馏分收集器，请设置所需的馏分体积。
柱洗：
按体积或条件稳定的UV洗涤色谱柱。

优选使用稳定的紫外线，以确保从色谱柱上洗净所有未结合的蛋白质。

洗脱液
将洗脱方法设置为梯度洗脱。
线性=设定目标％B和CV中的梯度长度

目标％B应设置为100，CV应设置为25

将馏分设置为馏分收集器。
1）将分馏类型设置为固定体积。

2）将分馏体积设置为1 ml。

可选：如果您希望样品从色谱柱底部到顶部洗脱，可以选择上流洗脱。
平衡：
设置标准以平衡系统并将色谱柱返回缓冲液A。

FPLC运行初始化
（连接柱小号在EE页109 ÄKTA 纯操作说明书）：
将合适的管子连接到柱阀端口（示例：1A）。
打开系统控制模块。
在过程画面中：
1）单击[色谱柱] → 选择[色谱柱向下流动]。

2）单击[泵] → 输入较低的系统流量（例如0.25 ml / min。）→ 单击[设置流速]。

3）当缓冲液以连续模式离开管路，并且色谱柱的顶部已充满缓冲液时，请将管路连接到色谱柱的顶部。

4）当缓冲液以连续模式离开色谱柱底部的管子时，请将色谱柱连接至色谱柱阀。使用与已经连接到色谱柱的端口相反的端口，在本示例中，如果使用1A，则使用端口1B。

注意：确保列位置与在为运行创建的方法中设置的位置匹配。

进样：
使用样品注入超容量（小号在EE页122 ÄKTA 纯操作说明书指南）：
1）使用色谱柱固定器将Superloop 连接到仪器。

2）在过程画面中，单击[进样阀] → 选择[手动负载]。

3）在过程画面中，单击[循环阀] → 选择回路连接的位置，例如[位置2]。

4）用步骤A7中过滤的蛋白质样品填充注射器。

5）使用约0.5μg 蛋白质样品。

6）将注射器连接到进样阀端口（ÄKTA 机器的V9-Inj上的Syr ）。

7）通过将注射器排空到进样阀中，将样品加载到Superloop中。

注意：大号屋檐连接到注射器锡尔河端口，直到运行结束。

打开“方法编辑器”模块，然后打开将用于洗脱运行的方法。
1）在“方法设置”中，确保设置要连接色谱柱的色谱柱位置，例如，1。

2）在“样品应用程序”中，设置要进样的总样品量以及定量环的类型和位置。

3）选择要运行的方法，然后单击[运行]图标。

利用装满一次性玻璃管的馏分收集器收集馏分

小号用于随后的色谱运行充足制备
将峰馏分合并在一起，并转移到分子量截断值为3.5 kDa的15 ml Amicon 离心过滤装置中。
注意：根据制造商的指南旋转样品，直到样品浓缩为止。

用缓冲液A填充过滤柱，并重复上述离心步骤。
注意：重复此步骤5-10次。

从过滤器顶部移出蛋白质样品，转移到新的收集管中，并添加足够体积的缓冲液A，以填充您选择的样品定量环，以进行其他色谱分析。
如果使用10毫升Superloop，则为10毫升。

可选：这次使用浅梯度进行第二轮阳离子交换层析
注意：创建相同的方法，不同的是用45 ml洗脱，而不是第一轮阳离子交换色谱用25 ml洗脱，以更好地分离洗脱峰。

重复步骤s C1-C3 ，随后进行蛋白洗脱，以进行最后一轮肝素色谱分析。
运行我同样洗脱THOD这是用于圆1阳离子交换色谱法（例如，25 CV梯度洗脱），。
肝素亲和试验的代表性色谱图见图2。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902862--1335 Paul Blum 781897 \ Figs jpg \图2.jpg

图2.通过肝素亲和层析FPLC分离染色质蛋白。通过肝素亲和色谱法分离蛋白质，并通过在280 nm处的吸光度监测洗脱。

保存单独的峰分数，以通过FT-ICR-MS对完整蛋白进行MS分析。
您可以选择将级分浓缩至更高的蛋白质浓度，以适应质谱法。

重新泥炭步骤C1-C3 为以下从肝素蛋白的洗脱缓冲液交换成MS-相容的缓冲液（即。，50mM碳酸氢铵）。
可选：您可以选择将干燥的蛋白质样品真空干燥，以重新制成所选的缓冲液，以替代渗滤。但是，可能有必要在真空干燥之前除去盐，以防止形成盐晶体。
通过SDS-PAGE分析蛋白质的组成，以确定各个FPLC峰中纯化蛋白质的各自质量。
有关图2中峰中蛋白质含量的代表性图像，请参见图3。

Ñ OTE ：在凝胶分析是在各个峰蛋白质含量定性评价。所有峰均作为溶液中未消化的完整蛋白质进行分析，用于后续的FT-ICR-MS分析。

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图3 。肝素亲和层析后纯化的天然染色质提取物的SDS-PAGE分析。在进行MS鉴定之前，对从肝素树脂洗脱的各个峰馏分进行了蛋白质同一性分析。

LC-FT-ICR质谱
在方法编辑器中创建质谱仪自定义方法。
打开计算机，然后打开Compass SolariXcontrol 软件。
软件将上传仪器使用的最后一种方法。
打开[方法编辑器]窗口。
在“方法编辑器”窗口中，单击[离子转移] 。
在[Source Optics]中将参数设置为：
毛细管放电至180 V

偏转板至280 V

漏斗1至110 V

撇渣器1至30 V

漏斗RF幅度达到210 Vpp

在[ Octopole ]中将参数设置为：
频率至5 VMHz

射频幅度达150 Vpp

在[Quadrupole]参数中设置：
Q1质量到250 m / z

在[碰撞池]中将参数设置为：
碰撞电压至- 1.5伏特

DC提取偏置至0.6 V

射频频率2 MHz

碰撞RF幅度达到1,500 Vpp

在[Transfer Optics]中将参数设置为：
飞行时间到1 毫秒

频率4兆赫

RF振幅至440 Vpp

在[气体控制]中将参数设置为：
流量15％

选中[启用]框

在“方法编辑器”窗口中，单击[API源]。
在[API Source]中将参数设置为：
ESI的来源类型

毛细管设置为4,500 V

端板偏移至-500 V

在[气源气调]中将参数设置为：
选中[干燥气体流量]框

选中[干气加热器]框

选中[雾化器气体流量]框

在[分流阀]参数中设置：
检查废物的[位置]

在“方法编辑器”窗口中，单击[模式]。
在[获取质量控制]中，将参数设置为：
宽带检测模式

TD（采集）到2 M

低质量至150.59 m / z

高质量至3,000.00 m / z

在[累计]中将参数设置为：
平均光谱为1

源累积到0.010 s

IO N累积时间0.800小号

离子冷却时间至0.010 s

飞行时间到1 毫秒

在“方法编辑器”窗口中，单击[分析器]
将参数设置为：

将出口透镜转移到-16 V

分析仪的-10 V入口

侧踢至7 V

侧脚偏移到-1.5 V

前挡板至1 V

背陷板至0.9 V

将励磁功率提高到15％

将方法另存为[ nameMS ]。
在方法编辑器中创建色谱自定义方法
打开计算机并打开HyStar 3.4软件。
如果您想从头开始定义自己的参数，请单击[方法] → 选择[新方法] → 单击[确定]或打开任何方法，然后单击[编辑]。
在“方法编辑器”窗口中，单击[常规]。
在[作者]中输入您的名字
在[说明]中描述您的方法
在“方法编辑器”窗口中，单击[LC参数]
在[Total Runtime]中，将参数设置为：
总运行时间为90分钟

在[数据采集]中，将参数设置为：
启动延迟到0分钟

运行时间到90分钟

选中[干气加热器]框

在[LC Pump]中将参数设置为：
流速0.02 ml / min

压力限制为最小0和最大400 bar

溶剂至7

溶剂A1至100％

溶剂B1降至0％

在“方法编辑器”窗口中，单击[LC时间表]
在[设备]下拉菜单中选择[泵-Agilent G1376A Micro]。
将[时间]设置为0分钟

在[功能]下拉菜单中选择[流量]。
将流速设置为0.02 ml / min

在[设备]下拉菜单中选择[泵-Agilent G1376A Micro]。
将[时间]设置为0分钟

在[功能]下拉菜单中选择[溶剂混合]。
将溶剂混合液设置为100％A1和0％B1

在[设备]下拉菜单中选择[泵-Agilent G1376A Micro]。
将[时间]设置为1分钟

在[功能]下拉菜单中选择[溶剂混合]。
将溶剂混合液设置为100％A1和0％B1

在[设备]下拉菜单中选择[泵-Agilent G1376A Micro]。
将[时间]设置为75分钟

在[功能]下拉菜单中选择[溶剂混合]。
将溶剂混合物设置为20％A1和80％B1

在[设备]下拉菜单中选择[泵-Agilent G1376A Micro]。
将[时间]设置为78分钟

在[功能]下拉菜单中选择[溶剂混合]
将溶剂混合液设置为0％A1和100％B1

在[设备]下拉菜单中，选择[Pump-Agilent G1376A Micro]
将[时间]设置为79分钟

在[功能]下拉菜单中选择[溶剂混合]。
将溶剂混合液设置为0％A1和100％B1

在[设备]下拉菜单中选择[泵-Agilent G1376A Micro]。
将[时间]设置为80分钟

在[功能]下拉菜单中选择[溶剂混合]。
将溶剂混合液设置为100％A1和0％B1

在[设备]下拉菜单中选择[泵-Agilent G1376A Micro]。
将[时间]设置为90分钟

在[功能]下拉菜单中选择[溶剂混合]。
将溶剂混合液设置为100％A1和0％B1

在“方法编辑器”窗口中，单击[信号1-8]
从[1号信号]中选择MS（顶点系列）MS和间隔BPC，全部
从[2号信号]中选择MS（顶点系列）MS和Interval TIC，全部
将方法另存为[ nameLC ]
代表性的HPLC光谱见图4A。

LC-FT-ICR-MS 数据采集
打开计算机，然后打开Compass SolariX Control和HyStar 3.4软件。
在Compass SolariX Control软件中打开[ nameMS ]方法。
在HyStar 3.4软件中打开[ nameLC ]方法。
检查HPLC运行期间使用的所有缓冲液的所有体积，以确保运行期间没有空气进入管线/泵。
注意：所有溶剂必须至少为100 ml。

确保正确的线在正确的溶剂中
A1 =溶剂A（水中0.1％甲酸）

B1 =溶剂B（乙腈中的0.1％甲酸）

每次运行之前，请清空废液容器，以防止系统装满和背压。
初始化Agilent 1100 HPLC系统。
打开Agilent 1100 HPLC系统（右侧）。
给泵和灯泡初始化一小段时间（约30 s）。
确保机器和计算机正在通信。
灌注入口和清洗泵头。
打开系统控制模块。
在窗口底部的过程画面中：
1）点击[清除]。

2）选择要填充的进样口位置。以相反的字母顺序选择位置，并从最高编号开始。例如，如果要填充进口阀AB中的所有四个入口，请按以下顺序填充它们L B2，B1，A2，A1。

3）单击[开始清除]。

在Agilent LC系统出口和MS仪器入口之间连接ProSwift 色谱柱（1 x 50 mm）。
将样品放在Agilent 1200 系列自动进样器中的正确位置（例如1-B，1）。
将样品添加到样品表。
在HyStar 3.4软件中单击[样品表] 。
点击[添加新样品]。
1）在[样品瓶]框中，定义样品在自动进样器中的位置（例如1-B，1）。

2）在[样品ID]中定义样品的名称。

3）将[注入]设置为1。

4）将[Volume]设置为5 µl。

5）在[数据路径]中定义将结果存储在何处。

6）对于[LC方法部分]框，选择[ nameLC ]。

7）对于[自动进样器方法零件]框，选择[标准]。

8）对于[MS方法部分]框，选择[ nameMS ]。

在样品表中检查样品行，然后单击[开始]。
分析运行之后，关闭所有软件。
有关在不同保留时间的代表性m / z光谱，请参见图s 4B和4C。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902862--1335 Paul Blum 781897 \ Figs jpg \图4.jpg

图4. FT-ICR-MS 色谱图和完整蛋白质的质谱图。A.HPLC色谱法，随后进行反相纯化。B- C 。26.4完整质量- 对应于Cren7蛋白28.1分钟保留时间亚型B和Sso7D亚型C.所有峰的M / Z的变化对应于14沓指示变量度甲基化。

数据分析

FT-ICR-MS数据分析可参见Johnson 等。，2019，材料和方法：FT-ICR-MS部分。数据分析必须在逐个蛋白质的基础上确定，因为取决于目标蛋白质和PTM，许多参数可能对特定结果起作用。

笔记

所有缓冲液必须至少为300 ml 。
如果仪器关闭或与网络断开连接，它将显示为灰色，无法连接。
在系统准备运行期间，请在系统控制窗口中的色谱图窗格上观察系统压力跟踪。如果发现系统压力波动非常不稳定，则系统缓冲管路中会存在空气。所有的缓冲泵将需要清除你的洗提运行之前解决这个问题（小号EE步骤B2 ：底漆入口和清洗泵头）。
在系统准备运行期间，请注意系统中是否有缓冲区泄漏，并拧紧所有松动的连接以解决问题。
但是，应将一些常规参数设置如下：
信噪比（S / N）为3。预期蛋白质的最小和最大质量（包括任何已知的PTM，包括截短和加工）。最大荷电状态还取决于预期蛋白质的质量，应设置在20（小蛋白质）和150（大蛋白质）之间。前体/碎片误差达到10 ppm。

菜谱

缓冲液A
30 mM磷酸钠

0.1毫米EDTA

1毫米DTT

pH值6.6

缓冲液B
30 mM磷酸钠

0.1毫米EDTA

1毫米DTT。

0.75 M 氯化钾

pH值6.6

致谢

上述方案改编自最新出版物（Johnson 等，2019）中描述的工作。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

约翰逊，T.，佩恩，S.，树丛，R.，麦卡锡，S.，Oeltjen ，E.，马赫，C.，Adamec ，J.，威尔逊，MA，范棉花糖，K。和百隆，P。（ 2019）。在古细菌Sulfolobus solfataricus的进化品系中，染色质蛋白的甲基化缺乏是一种非突变和表观遗传学特征。生物化学杂志294（19）：7821-7832。