材料和试剂

中号尖头刷
1.5 ml 微量离心管
15毫升玻璃试管
移液器技巧
带透明盖的Fisherbrand TM 培养皿（Fisher Scientific，目录号：0875713）
亚克隆效率TM DH5α TM 感受态细胞（该RMO Fisher Scientific公司，目录号：18265017 ）
M13引物，M13引物可从Alpha DNA （http://alphadna.com/）获得
氯化钾（KCl的）（BioShop ® ，目录号：POC308）
氯化钙（氯化钙2 ）（BioShop ® ，目录号：CCL302）
氯化镁，六水合物（氯化镁2 ）（BioShop ® ，目录号：MAG510）
Bacto TM 胰蛋白（（BD Biosciences，目录号：211699）
Bacto TM 酵母提取物（BD Biosciences，目录号：212720）
氯化钠（NaCl的）（BioShop ®，目录号：SOD001）
琼脂（BioShop ® ，目录号：AGR003）
五水壮观霉素二盐酸盐（Sigma - Aldrich，目录号：S9007）
氨苄青霉素（Sigma - Aldrich，目录号：A9393）
无水乙醇（商业酒精，目录号：P000EAAN）
无水D-葡萄糖（VWR，目录号：200003-818）
UltraPure TM 1 M Tris -HCl，pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，目录号：15568025）
乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0 （Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9260G）
牛胰腺核糖核酸酶A（RNase）（Sigma - Aldrich，目录号：R4642-10MG）
氢氧化钠（NaOH ）（VWR International，目录号：BDH9292）
十二烷基硫酸钠（SDS）电泳级（BioShop ® ，目录号：SDS001）
乙酸钾（Fisher Scientific，目录号BP364-500）
冰醋酸（Sigma - Aldrich，目录号：ARK2183）
TE，pH 8（Thermo Fisher，目录号：AM9849）
Gateway TM LR Clonase TM （Thermo Fisher，目录号：11791100）
蛋白酶K溶液（Thermo Fisher，目录号：AM2548）
Invitrogen公司TM 的PureLink TM HiPure 质粒中提试剂盒（Fisher Scientific公司，目录号：K210004）
鬼笔环肽-四甲基罗丹明B 异硫氰酸酯（Sigma - Aldrich，目录号：P1951）
5个KCM缓冲区（请参阅食谱）
LB汤（请参阅食谱）
大观霉素-或氨苄青霉素选择性LB琼脂平板（请参见食谱）
用于小规模制备质粒DNA（100 ml）的溶液1（请参阅食谱）
小规模制备质粒DNA（4 ml）的解决方案2（请参阅食谱）
小规模制备质粒DNA（100 ml）的解决方案3（请参阅食谱）

设备

水浴
250毫升锥形瓶
IEC Micromax RF冷冻微量离心机
VWR ® 模拟涡旋混合器（VWR国际，目录号：10153-838）
VWR ® 数字干块加热器
摇床
CO 2 飞板，标准尺寸（8.1 x 11.6 cm）（Genesee Scientific，Flystuff ，目录号：59-114）
P2，P20，P100和P1000微型移液器（例如，Gilson，目录号：F144801，F123600，F123615和F123602）
体视显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica MS5）
点扫描共聚焦系统（Leica Microsystems，型号：Leica SP8）

软件

斐济（https://fiji.sc/）
R统计信息包（https://www.r-project.org/）

程序

一般克隆
从果蝇基因组学研究中心（https://dgrc.bio.indiana.edu）获得pDONR223入口网关载体中测试其相互作用的蛋白质的开放阅读框（ORF）克隆。
转化进入DH5α感受态细菌细胞的载体
将载体在2 100 xg 下于4°C 离心1分钟。
加入20 µl高压灭菌水。
涡旋1分钟。
在加热块上于50°C 加热10分钟或10分钟。
将准备好的DNA放在冰上。
在1.5 ml 微量管中加入80 µl高压灭菌水，20 µl 5x KCM缓冲液，1 µl制备的DNA（上面）和100 µl感受态DH5α细菌细胞。
将试管放在冰上30分钟。
通过将试管放在水浴中90 s，在42°C的温度下加热冲击电池。如果没有水浴，则任何标准的加热块也可以使用。
向试管中加入500 µl LB肉汤，并在摇动的同时在37°C下恢复1 h。
在壮观霉素选择性LB琼脂平板上平板。
在37°C下过夜孵育细菌。
使碱裂解minipreparations 的pDONR223进入网关的载体
以1：1,000的比例储备壮观霉素和LB培养基。
使用200 µl移液器吸头从壮观霉素选择性LB琼脂平板中选择一个成功转化的菌落。
将菌落放在15 ml 无菌试管中的3 ml大霉素/ LB储备液中，上下吸移五次以混合。
松开管盖，将培养物在37°C振荡器中孵育过夜。
第二天，将1.5 ml培养物倒入1.5 ml 微管中。
离心机在〜13000 ×g下在4℃下进行30秒。
丢弃上清液。
将剩余的1.5 ml培养物加入同一管中。
离心机在〜13000 ×g下在4℃下进行30秒。
丢弃上级表。除去细菌沉淀中的所有液体，必要时使用移液器吸出所有残留的液体。
将1.5 µl 微管中的100 µl冰冷的溶液1添加到细菌沉淀中。
涡旋30 s。
加入200 µl 溶液2。
将试管快速倒置五次以混合内容物。不要涡旋。将试管存放在冰上。
加入150 µl冰冷的溶液3 ，并将试管快速倒转五次。
将试管在冰上存放3-5分钟。
离心机中以〜13000 ×g下在4℃下5分钟。
将上清液转移至新的1.5 µl 微管中。丢弃沉淀。
加入2 ml 100％室温乙醇，并涡旋30 s。
使混合物在室温下静置2分钟，以沉淀双链DNA。
离心机中以〜13000 ×g下在4℃下5分钟。
丢弃上清液，让沉淀物风干10分钟。
用1 ml 70％冰冷的乙醇冲洗沉淀。
除去上清液，让沉淀物风干10分钟。
将DNA沉淀溶于50 µl超纯水中。
注：商业的基于列的套件还为工作小号TEPS 一个3A- A3 ÿ 。如果可用，请使用它们。

使用m13引物通过Sanger测序确认ORF身份。
执行从pDONR223入口向量到pUAS-BiFC 目的向量的网关克隆（图2；表1）。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1903038--1338 NicanorGonzález-Morales847657 \ Figs jpg \ Figure2.jpg

图2.将pDONR223载体序列网关克隆到pUAS-BiFC 载体中。pDONR223 载体赋予壮观霉素抗性，并包含attL 重组位点之间的目标基因。pUAS-BiFC 载体赋予氨苄青霉素抗性，并在attB 重组位点之间包含CcdB 毒素。attB 和attL 位点之间的重组介导了目标基因向pUAS-BiFC 的转移。

表1. 制备BiFC 转基因所需的克隆载体

向量名称

阳性抗生素标记

负选择标记

pDONR223

大观霉素

不适用

pUAS - RfB -HA-CYFP- attb

氨苄西林

CCDB ，氯霉素

pUAS -HA- RfB -CYFP- attb

氨苄西林

CCDB ，氯霉素

pUAS - RfB - myc -NYFP- attb

氨苄西林

CCDB ，氯霉素

pUAS-myc -NYFP- RfB-attb

氨苄西林

CCDB ，氯霉素

添加75纳克来自pDONR223进入载体的minipreparations （SE 式步骤A3）和75纳克的PUAS-附设目的地向量到1.5ml 微型管中。
在同一试管中，加入pH 8至4 µl的TE缓冲液。
在冰上解冻LR Clonase TM II酶2分钟。将酶混合物涡旋振荡2秒钟。
在装有DNA混合物和TE缓冲液的微管中加入1 µl LR Clonase TM II酶。涡旋2 s。
在25°C下孵育1小时。
向混合物中加入0.5 µl蛋白酶K，涡旋2秒钟。
在37°C下孵育10分钟。
将pUAS-BiFC 目的载体转化为DH5α感受态细菌细胞。
注意：步骤与上述步骤相同，除了一个例外：必须将细菌接种在氨苄青霉素选择性LB琼脂平板上。

执行中提所述的PUAS-附设使用从成功转化的细菌细胞中目的向量的PureLink TM HiPure 质粒中提试剂盒。
在250ml ë rlenmeyer烧瓶中，加入100 ml的LB培养基中，并加入100μl氨苄青霉素的。
使用200 µl移液器吸头从氨苄青霉素选择性LB琼脂平板中选择一个成功转化的含有pUAS-BiFC 目的载体的菌落。
/添加菌落于LB氨苄青霉素混合物在250ml的È rlenmeyer烧瓶中，移液管上下五次混合。
在37°C的振荡器中孵育过夜。
跟随在指定的指令的PureLink TM HiPure 质粒中提试剂盒。
将纯化的质粒DNA 重悬于100 µl水中，并置于1.5 ml 微管中。储存在-20°C。
使用表2中的引物通过Sanger测序确认ORF身份，以确认插入片段和方向。

表2. pUAS-BiFC 目的载体测序的引物

引物名称

序列

目标向量

描述

CY-CYFP

GGAACATCGTATGGGTACAT

pUAS - RfB -HA-CYFP- attb

对于C末端的CYFP标签

纽约州

CGATGTTCCAGATTACGCTT

pUAS -HA- RfB -CYFP- attb

对于N端的CYFP标签

NYFP

GAAATCAACTTTTGCTCCAT

pUAS - RfB - myc -NYFP- attb

对于C末端的NYFP标签

纽约州

GTTGATTTCTGAGGAGGATC

pUAS - myc -NYFP- RfB - attb

对于N末端的NYFP标签

制作转基因品系和遗传杂交
转基因果蝇是通过使用ΦC31整合酶方法显微注射而产生的。我们建议将此部分外包给处理显微注射的公司，例如BestGene 或Genome ProLab 。
我们建议使用以下着陆点来创建转基因蝇系：
ZH-58A BDSC＃244844：第二条染色体上的M [ 3xP3-RFP.attP] ZH-58A。
ZH-86Fb BDSC＃24749：第三条染色体上的M [ 3xP3-RFP.attP] ZH-86Fb。
注意：在不同的染色体上具有CYFP和NYFP的转基因很方便。

为了激活pUAS BiFC 标记的蛋白的表达，必须掺入Gal4驱动程序。
准备每个与含Gal4的谱线交叉的pUAS BiFC 构建体的库存（表3）。

表3.一些建议的实验和对照实验的示例。我们还建议您使用的利息（N-末端标记的蛋白质类似的实验，即，YFP-蛋白1）。

蛋白质1

蛋白质2

实验类型

蛋白质1-myc-NYFP

蛋白质2-HA-CYFP

实验性

myc -NYFP

蛋白质2-HA-CYFP

负控制

蛋白质1-myc-NYFP

羟CYP

负控制

蛋白质1-HA-CYFP

蛋白质1-myc-NYFP

实验性

羟CYP

蛋白质1-myc-NYFP

负控制

设置适当的交叉点，一次获得YFP半个和Gal4驱动程序。此时为必要的控件设置叉号。
图3中提供了示例杂交方案以及与对照组合的一些可能性。我们还建议测试两种相互作用被称为阳性对照的蛋白质，并进行基线荧光测量。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1903038--1338 NicanorGonzález-Morales847657 \ Figs jpg \ Figure3.jpg

图3. 交叉方案示例。A.建立带有NYFP和CYFP标签的目标蛋白版本的库存。B.在X染色体上掺入间接飞行肌特异性Gal4驱动剂。C.使用B中已建立的库存来测试相互作用和阴性对照。

间接飞行肌肉的解剖和成像
收集正确基因型的果蝇。
如前所述（Xiao 等人，2017）解剖间接飞行肌以进行成像。
我们建议使用四甲基若丹明（TRITC）缀合的鬼笔环肽进行肌动蛋白染色。

通过共聚焦显微镜对间接飞行的肌肉成像。
使用Leica SP8点扫描共焦系统。其他共焦显微镜也应工作。
使用63x / 1.4油镜和1个通风单位（AU）的针孔对肌肉纤维进行成像。
最初使用明场定位肌肉纤维，以不漂白样品。
为YFP和TRITC检测设置适当的过滤器。
以9x放大倍数1,024 x 1,024像素（〜20 µm x〜20 µm ）拍摄图像。
图4中提供了示例图像。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1903038--1338 NicanorGonzález-Morales847657 \ Figs jpg \ Figure4.jpg

图4. BIFC图像和绘图示例。A.肌原纤维在Z盘处具有阳性荧光信号（所选Z盘下方的红色星号），表明YFP重组和目标蛋白之间的相互作用。红点虚线显示了ImageJ软件中的Plot Profile工具。B.阴性对照样品的肌原纤维，Z盘处没有可检测到的YFP（红色星号）。C. 具有阳性BiFC信号的单个肌节的图谱。D. BiFC阳性信号的几个肉瘤的图谱。在C和D中，强度峰值都对应于Z盘。E.具有负BiFC信号的单个肌节的图谱。D. BiFC信号为负的几个肉瘤的图谱。在CF中，荧光强度值对应于y轴和Z盘在x轴上的位置。Z盘处的荧光峰值表明BiFC信号为正。

数据分析

在斐济/ ImageJ中测量YFP强度
在斐济/ ImageJ程序中打开肌原纤维图像。
选择直线工具，并将线宽设置为30像素。
在从M线到M线的每个Z盘上绘制一条直线，确保将Z盘包含在中心。
使用“图轮廓”工具创建荧光相对于距离的图，可以在“分析”菜单中访问该工具。
从每种基因型的不同肌原纤维图像中重复至少三十种不同的Z盘。

使用R Statistics软件包（R版本3.5.1）将多个Z盘的图折叠为一张。
将上一步中的所有绘图配置文件保存到单个文件夹中。
打开R统计包
将包含所有绘图配置文件的文件夹设置为工作目录
运行R脚本（代码1）。
正负BiFC 信号的绘图示例如图4所示。
注意：代码1根据与Z碟片对应的最高强度点对齐强度信号。如果BiFC 信号来自多个地方，脚本的对齐部分可能会导致奇怪的绘图。

代码1.常规R脚本，以读取“地块纵断面”并将其折叠为单个图

库（data.table ）

＃获取数据

setwd （“包含文件夹的绘图配置文件”）

temp = list.files （pattern =“ *。csv”）

myfiles = lapply （临时文件，read.csv）

a = lapply （myfiles ，“ [”，2，drop = FALSE）

a = 施加（a，比例，中心= F）

B = 矩阵（nrow = 80，NcoI位=长度（a））的

＃对齐轮廓

为（i in 1：length（a））{

x =不列出（a [ i ]）[1:80]

n =长度（x）/ 2-其中（x == max（x））

n = 平方（n * n）

s = shift（x ，n = n，fill = NA，type =“ lead”）

s [ is.na（s）] = x [1：n]

b [ ，i ] = s

}

了#make 一个X / Y情节

情节（-1，-1，xlim = c（1,80），ylim = c（0,3），ann = FALSE）

for（i in 1：length（b [1，]））{点（b [，i ]，pch = 16，col = Adjustcolor （“ orange”，.3））}

lines（rowMeans （b），类型=“ l”，lwd = 3）

title（main =“ BiFC ”）

笔记

消极控制的重要性
当标记的蛋白结合CYFP或NYFP标签时，可能会出现假阳性信号。为了排除这种情况，至关重要的是，所选蛋白要用CYFP和NYFP标记，然后再单独对互补标签进行测试。标记的蛋白质可能仅结合一半的YFP。在这种情况下，应将相互作用的蛋白质和相互作用的YFP一半融合在一起。由于只有在实验完成后才能获得此信息，为避免浪费时间，因此应在克隆步骤中完成YFP一半和蛋白质之间的所有可能组合。

间接飞行肌肉发育过程中的BiFC
我们只分析了成人间接飞行的肌肉，但我们的协议与解剖兼容。在发育过程中采用GFP标记间接飞行肌肉的方案可用于解剖阶段的IFM （Kao 等人，2019）。使用GFP作为反染剂与BiFC 方案不兼容，但其他荧光蛋白（如Zasp52-mCherry）可与BiFC 结合使用（Gonzalez-Morales 等，2019b）。重要的是，蛋白质含量和同工型的使用在间接飞行肌肉发育过程中是高度动态的（Spletter 等人，2018）。在进行p BiFC 实验时应考虑这一点。

其他肌肉类型的BiFC
我们的协议经过优化，可用于分析间接飞行肌肉中的Z-disc蛋白质，但也可以应用于其他肌肉。蛋白质和同工型分布因肌肉类型而异。对于果蝇中的Zasp 蛋白而言尤其如此（Gonzalez-Morales 等人，2019a）。因此，仅在一部分肌肉中可能会发生某种相互作用。为了将我们的方案调整为适用于其他肌肉，必须使用不同的Gal4品系，例如Mef2-Gal4可以在所有类型的肌肉中驱动强表达，Act79B-Gal4仅在跳跃肌肉中表达（Bryantsev 等人，2012；Fernandes和Schöck，2014； Spletter和Schnorrer，2014年）。

使用其他技术或数据库验证结果
重要的是要注意，我们的BiFC 协议基于标记蛋白的过表达。肌肉对相对蛋白质浓度特别敏感（Beall 等人，1989），因此蛋白质的过表达可能会对肌肉超微结构和蛋白质结合伴侣产生潜在影响。始终应使用另一种独立的推断蛋白质与蛋白质相互作用的方法来验证BiFC 结果。对于间接飞行肌肉，可以使用dSTORM 获得超分辨的蛋白质定位图集，并用于估计目标蛋白质是否接近支持直接结合（Szikora 等，2020）。此外，酵母的两个杂交或GST下拉实验是很好的验证工具。

DGRC中其他DNA收集品的兼容性
还有其他大量可公开获取的质粒集合，它们允许将BIFC标签克隆为特定基因和同工型（MiMIC ，Gold集合，Fosmid 集合等），但此处的优势在于ORFeome 位于pDONR223载体中，可促进Gateway克隆。可能会使用其他克隆方法和质粒收集来创建BiFC 标记的蛋白质，以用于ORFeome 收集中找不到的同工型特异性蛋白质标签或ORF 。

从样本噪声中区分出实际的BiFC 信号
BiFC 信号来自重构的YFP，一旦两个YFP半部都靠近，就会形成该信号。虽然这是一个功能强大的系统，可以可视化单个Z盘中的蛋白质相互作用，但YFP信号有时足够低，难以区分真实的结合事件和样品噪声，这可能是一个挑战。但是，由于肉瘤是具有良好定义的区域（Z盘，M线，A带等）的组织良好的结构，因此我们可以将感兴趣的内源蛋白的定位与BiFC 信号的定位进行比较。如果内源蛋白和BiFC 信号定位于相同的结构，则可能代表了真正的结合事件。

映射负责蛋白质相互作用的域
鉴定介导蛋白质之间物理相互作用的残基或蛋白质结构域是重要的信息。通过将突变直接引入进入载体，我们的BiFC 设置可用于此目的。验证突变蛋白版本的正确定位非常重要，因为BiFC 信号的减少可能来自定位错误。使用目标向量中的Myc 或HA标签可以轻松地对此进行测试。

解释BiFC 结果时出现问题或负面结果
即使完全没有可检测的BiFC 信号，也几乎不可能完全排除仅基于BiFC 的一对蛋白质之间的结合。添加的附设标签可能会破坏空间位阻或通过使蛋白质-蛋白质相互作用错误折叠的蛋白质。另外，即使蛋白质结合在一起，两个YFP一半也必须相距很近才能重建功能性YFP。如果其中一种蛋白质很大，则标签之间的距离可能足够大，以防止YFP重组。可能需要测试N端和C端标签之间的所有组合。

菜谱

5个KCM缓冲区
5.1毫升1 M 氯化钾

1.5毫升1 M CaCl 2

2.5毫升1 M氯化镁2

0.9毫升ddH 2 O

LB肉汤
溶于1 L的ddH 2 O：
50克Bacto TM 胰蛋白p

25克Bacto TM 酵母提取物

50克氯化钠

高压釜
壮观霉素-或氨苄青霉素选择性LB琼脂平板
准备50 mg / ml 壮观霉素和100 mg / ml氨苄西林储备溶液
溶于1 L的ddH 2 O：
50克Bacto TM 胰蛋白p

25克Bacto TM 酵母提取物

50克氯化钠

75克琼脂

高压釜
加入1ml的spectinomy CIN 或氨苄青霉素贮备液（1：1,000浓度）
倾介质进入P ETRI菜肴和llow固化
存放，在4°C下覆盖
小规模制备质粒DNA的溶液1（量为100 ml）
5 ml 1 M葡萄糖（最终浓度为50 mM 葡萄糖）

2.5毫升1 M的的Tris-HCl pH 8.0中（终浓度为25 mM的的的Tris-HCl ）

2 ml的500 mM EDTA pH 8.0（最终浓度为10 mM EDTA）

90.5毫升ddH 2 O

2克RNase A（20毫克/毫升）

用于小规模制备质粒DNA的溶液2（制备4 ml）
160 µl 5 M NaOH （最终浓度为0.2 M NaOH ）

400 µl的10％SDS（最终浓度为1％SDS）

3.44毫升的ddH 2 O

小规模制备质粒DNA的溶液3（量为100 ml）
60 ml 5 M乙酸钾

11.5毫升冰醋酸

28.5毫升H 2 O

Acknowledg 发言：

我们感谢贝利胡锦涛与帮助果蝇注射，用共聚焦显微镜的帮助下，CIAN成像设备果蝇基因组资源中心，和Sven波格丹。这项工作得到了加拿大卫生研究所的运营赠款MOP-142475的支持。我们没有利益冲突要声明。

利益争夺

我们声明没有利益冲突。

参考文献

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