材料和试剂

移液管头1000 微升/ 200 微升/ 20 微升（索伦森Bioscience公司，目录NU MBER 小号：34000/14220/15020）
低结合力离心管1.5 ml（Watson BioLab ，目录号：pk-15 c-500）
Rainin LTS 吸头10μl （Rainin ，目录号：30389228）
qPCR的96孔板（应用乙iosystems，目录号：4346907）
用于qPCR板的胶片（Applied B iosystems，目录号：4311971）
无核酸酶的水（Ambion ，目录号：AM9932）

用于细胞培养

细胞培养100毫米培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号172931）
15 ml锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339650）
所需的细胞系，在这种情况下，我们使用了乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7
RPMI 1640x基本介质（Thermo Fisher Scientific，目录号：C11875500BT）
胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：10270-106）
注意：FBS应在56℃下热灭活 °C 30分钟后使用。

抗生素/抗有丝分裂溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：15240062）
磷酸盐缓冲液（PBS）（DS Pharma Biomedical，目录号：DSBN200）
TrypLE Express（Thermo Fisher Scientific，目录号：12604013）
台盼蓝溶液0.4％（Gibco，货号：15250-061）
Neubauer改进的C芯片（NanoEnTek ，目录号：DHC-N01）
0.5 mol / L EDTA（Nacalai Tesque ，目录号：06894-14）
初始细胞悬液缓冲液（请参阅食谱）

用于单细胞分离和预扩增

C1单节自动准备IFC用于前置放大器（10-17 微米）（Fluidigm公司，目录号：100-5749）
注意：有多个通道尺寸板可调整到像元大小。有关更多信息，请参见注释。

20x基因特异性检测（Taqman ）
C1单细胞自动制备试剂盒（Fluidigm ，目录号：100-5319）
Ambion 单细胞对Ct qRT -PCR试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：4458237）
哺乳动物细胞的活/死试剂盒（生命技术，目录号：L-3224）（s 食谱）
裂解混合物（请参见食谱）
反转录最终混合物（请参阅食谱）
0.2x合并Taqman 底漆（请参阅食谱）
前置放大混音（请参阅食谱）

对于单细胞qPCR

Fluidigm 96.96定量PCR动态阵列微流控芯片（Fluidigm ，目录号：BMK-M-96.96GT ）
Taqman Universal PCR Master Mix 2x（Applied Biosystems，目录号：PN 4304437）
20x GE样品加载试剂（Fluidigm ，目录号：PN 100-7610）
2x上样试剂（Fluidigm ，目录号：PN 100-7611）
单细胞qPCR的10次检测（请参阅食谱）
样品预混（请参阅食谱）

设备

纽鲍尔室
微量移液器（P2，P10，P20，P200，P1000）
高精度多通道移液器P10（Rainin ，目录号：17013802）
细胞培养培养箱：37 °C 和5％CO 2 （Panasonic Healthcare，目录号：MCO-170AICUVH-PJ）
无尘工作台（松下，目录号：MCV-131BNF-PJ）
离心1.5 ml管（Eppendorf ，型号：5418R ）
15 ml管离心机（Tomy ，型号：Ax-511 ）
96孔板离心机（Sigma ，型号：4-16KS ）
Vortex （科学工业公司，型号：Vortex - Genie 2 ）
荧光共聚焦显微镜（Keyence ，型号：BZ-X700 ）
冰箱和冰柜（任何公司的产品都可以）
C1自动准备系统（Fluidigm ）
IFC 控制器HX（Fluidigm ）
用于实时定量PCR的BioMarkHD 系统（Fluidigm ）

软件

Fluidigm 实时PCR分析软件v.2.1.3
Fluidigm 数据收集软件v.2.1.3
电子表格
R（版本3.3.2）

程序

单细胞qPCR方案可以主要划分d INT O 4个馏分：所述第一个包括细胞培养和细胞悬液的制备。第二个和第三个主要由C1集成流体回路完成，它允许单细胞分离，细胞裂解和预扩增。最后一部分是单一实时qPCR，由BioMarkHD 系统完成。中表示的那些步骤˚F igure 1。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902855--1329山本佑介811073 \ Figs jpg \ Fig1.jpg

图1.单细胞qPCR协议方案

样品制备
该协议从已经进行的细胞培养开始。

当细胞达到融合度的70％时，随时可以收集。
除去培养基，并用PBS清洗培养皿一次。
加入1毫升的TrypLE Express。
放置在37 °C 的培养皿中，并孵育3-5分钟，直到细胞分离。
在37 °C 下加入4 ml预热的完全培养基以终止反应。
小心移液以确保所有细胞完全分离，但不损坏细胞。
将细胞转移到15 ml管中。
在300 xg 4 °C下离心5分钟。
吸出培养基并加入5 ml PBS 。
分开100 微升计数细胞。
将15毫升试管在300 xg 4 °C下离心5分钟。
离心时，将分离的细胞与台盼蓝溶液按1：1比例混合。
将10μl 混合液插入Neubauer腔室。
用显微镜计数总细胞数（包括死细胞）。
除去PBS。
将细胞以300细胞/ 微升（3 x 10 5 细胞/毫升）的浓度重新悬浮在初始细胞悬液缓冲液（配方1）中，并置于冰上。
注意：建议至少10,000个细胞的数量以获得完整的捕获，我们观察到，少于该数量的细胞会留下多个通道，而IFC板中未附着细胞。

单细胞分离
从储备的-20 °C中取出所有必要的试剂，并在开始实验前在冰上融化30分钟。刚开始使用之前，请先将试剂保存在4 °C的温度下，然后将其放在冰上。
注意：切勿将盘子放在冰上。

卸下位于集成流体回路（IFC）板按钮处的黑色塑料。
在启动之前，请打开C1机器，因为它需要一些时间才能启动（大约3分钟）。
按照该方案吸取几种试剂：

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902855--1329山本佑介811073 \ Figs jpg \ Fig2.jpg

图2. IFC板的示意图，指示要添加不同试剂和溶液的孔。相同的数字表示相同的溶液和体积。灰色的孔表示被纸膜覆盖的芯片部分，在实验结束时，该膜将包含预先扩增的每个单细胞样品，准备在sc -qPCR中使用。

①。加入200 微升收获试剂。此孔就像一个在铁心轴上带有塑料盖的按钮。要施加试剂，请用笔尖轻轻按一下，然后滑落，将笔尖放在空间上。然后慢慢加入试剂。如图3所示。

②。加入20 微升收获试剂。

③。移液15μl 封闭剂。

④。加入20 微升预压试剂。

⑤。加入20 微升洗涤液的。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902855--1329山本雄介811073 \ Figs jpg \ Fig3.jpg

图3. 在IFC板上应用Harvest试剂（200μl ）的方案

将印版插入IFC机器，条形码朝外。
注意：如果板的底部脏了，机器将无法检测到它并给出错误信息。如果是这样，请用70％的乙醇擦拭底部，然后再次放置。

根据所选的芯片通道大小，运行模式STA ：Prime （1782x / 1783x / 1784x）。此过程需要10到12分钟。
在灌注时，准备细胞混合物。

制备细胞混合物：30 微升细胞悬浮液和20 微升悬浮液试剂。
注意：只要保持比例，就可以制备较少量的细胞混合液。例如，6μl 和4μl 。

灌注完成后，单击弹出并取出板。
用P200移液器除去残留的C1封闭剂（孔如图2 - ③所示）。
插入细胞和活/死染色溶液，如下所示：

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902855--1329山本佑介811073 \ Figs jpg \ Fig4.jpg

图4. IFC板的示意图，指示要添加不同试剂和溶液的孔

①。加入6μl 细胞混合物。

注意：请勿涡旋细胞。加入前用移液器吸取。

②。加入20 μl的活/死染色溶液（配方2）的。

将IFC板放入C1系统。
根据所选的芯片通道大小，选择“ STA：Cell Load＆Stain （1782x / 1783x / 1784x）” 。这需要30-65分钟，具体取决于板的细胞大小。
同时，准备Lysis Mix，RT Mix和PreAmp Mix（配方3、4和5）。
加载完成后，从C1中取出板并用Keyence显微镜拍摄细胞照片。使用10倍的相衬，可以轻松地在板的中央部分观察到通道和荧光染色的细胞，在图4中用灰色显示。还可以观察到每个孔的数量。
记下有死细胞的通道，空通道和有一个以上要丢弃的细胞的通道（图5）。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902855--1329山本佑介811073 \ Figs jpg \ Fig5.jpg

图5.活/死染色示例。绿色细胞是活细胞，而阅读细胞则死了，或者是高度受损的细胞。此外，右室显示双峰，左室显示透明单细胞。

细胞裂解，逆转录和预扩增。
按照图6中的方案添加试剂：

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902855--1329山本佑介811073 \ Figs jpg \ Fig6.jpg

图6. IFC板的示意图，指示要添加不同试剂和溶液的孔

①。加入180μl 的Harvest试剂。小心地从一侧移至另一侧，以确保试剂覆盖所有表面。

②。添加7 微升裂解最终修复。

③。添加7 微升RT最后的混音的。

④。加入24μl 的预扩增混合物（配方6）。

将板放入C1系统。
选择STA：PreAmp （1782x / 1783x / 1784x）– 根据所选的芯片通道大小，然后选择结束时间。我们通常将其放置一夜，并于第二天早晨收集它以进行实验。该过程本身大约需要5-6小时。
STA：前置放大器过程完成后，选择EJECT并卸下IFC板。
使用新的PCR 96孔板，在每个孔中添加25μlC1 稀释试剂。
取出纸张，然后保护IFC板上的输出孔（这些盖板在图2、4和6中用灰色表示）。
使用八通道微量移液器（Rainin ），将样品转移到96孔板上。
注意：样品量应接近3μl ，但要确保将微量移液器设置为4μl 。

使用此特定顺序转移样品，如图7所示。
注意：使用8通道微量移液器，并考虑到IFC板每条泳道有16孔，因此它的大小可确定其他每孔的大小。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902855--1329山本佑介811073 \ Figs jpg \ Fig7.jpg

图7.说明从IFC板转移到PCR 96孔板的顺序的方案

涡旋96孔板并向下旋转。此时，样品可以在-20 °C 下冷冻，并在使用前保存数周，在这种情况下，请使用PCR板膜将板密封。

单细胞qPCR
从储备的-20 °C中取出所有必要的试剂，并在开始实验前在冰上融化30分钟。刚开始使用之前，请先将试剂保存在4 °C的温度下，然后将其放在冰上。
注意：切勿将盘子放在冰上。

打开标准96孔热循环仪，因为它需要一些时间才能启动。
去除96.96芯片底部的蓝色保护膜。
使用工具包中的注射器，将控制管线流体注入两个大的中央孔中，并在十字之间压紧（可以看到十字，在图8中用箭头标记）。
注意：机油容易泄漏，因此在管理注射器时要小心。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902855--1329山本佑介811073 \ Figs jpg \ Fig8.jpg

图8. 96.96 定量PCR动态阵列微流控芯片的示意图。箭头显示应在其中施加管线流体的空间。

插入板（条形码朝外）。
选择选项Prime（136x）。此过程大约需要20分钟。
同时，准备预混样品（配方8）。
在新的PCR 96孔板中，在每个孔中添加3.3μl 样品预混物。
添加2.7 微升cDNA样品的用多通道微量（步骤C9获得的样品）制备6的总体积微升在每个入口。
用PCR板膜密封。
准备Taqman 分析混合物（配方7）并用PCR板膜密封板。
将两个板涡旋10秒钟，然后旋转。
灌注完成后，收集芯片。
转移样品和Taqman 测定。按照以下顺序（图9和10）：

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902855--1329山本佑介811073 \ Figs jpg \ Fig9.jpg

图9. 96.96芯片的示意图，以黄色显示插入Taqman 分析的进样口，以绿色显示插入样品预混物的进样口

①。加入5 微升的的Taqman 测定法在黄色入口，使用以下顺序（图10A），以从传送的qPCR 96孔板到IFC芯片。

②。在绿色进样口中以相同顺序（图10A）添加5μl 样品预混物。

笔记：

入口壁不是水平的，而是具有对角线。确保更好的应用；最好的选择是将尖端倾斜插入，如图10B所示。
移液时避免气泡。但是，如果有泡沫，但他们移动，意味着它们在表面上，和TH EN 它们不会干扰分析。如果气泡不动，用微量移液器吸头除去气泡。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902855--1329山本佑介811073 \ Figs jpg \ Fig10.jpg

图10. 将样品转移到96.96芯片的订购方案和方法。A.说明从PCR板到96.96芯片的孔转移顺序的方案。B. 96.96个进样口中的样品应用方案。

将芯片插入IFC Controller HX，然后运行脚本Load Mix（136x）。
在运行“加载”脚本时，打开连接到BioMarkHD 系统的计算机以进行实时qPCR。
运行软件Biomark 数据收集。
双击打开选项“灯”以启动。此过程大约需要20-30分钟。

加载完成后，将芯片带入BioMarkHD 系统并按照以下步骤操作：
单击“开始新运行”。
条形码朝外插入芯片。
选择：加载

 下一个

选择96.96芯片的设置。
选择名称和要将文档保存到的文件夹。
 下一个

应用类型：单探头。
探针：FAM_MGB
 下一个

通讯协定：GE 96x96标准v1。
 下一个

开始运行。
完成后，请卸下盖板，然后关闭软件并关闭计算机。

数据分析

数据分析程序参考我们之前的报告（Prieto-Vila et al。，2019）。

取出死/损坏的细胞
运行qPCR后，使用Biomark 软件收集要分析的原始数据。
使用设置线性（导数）和用户（检测器）设置为每个基因生成Ct值。
删除所有置信度小于0.2的值。
将数据导出到excel文件。
使用在步骤B14中从实验方案中获得的数据（活/死染色图片），去除所有染成红色（死）的细胞，一个或多个细胞的腔室，或不去除任何细胞。
删除管家基因的Ct值低于16的细胞。在我们的案例中，我们同时使用了BACTIN和GAPDH。

数据标准化
规范化可以通过两个系统进行：

为了消除分析之间的差异，可以使用管家基因进行归一化。在我们的案例中，我们利用了GAPDH。：归一化是通过下式计算2 - ΔΔ CT 。
在单细胞分析中另一种广泛使用的方法是通过log 2 Ex 进行归一化，该表达在log base 2中高于背景的转录水平（Livak 等，2013）。在我们的案例中，我们将LOD（检测限）设置为26，因为它是每个基因的最低可检测Ct值的平均值。这可以通过下式计算：日志2 用Ex = LOD（限位中检测）Ç q - c ^ q [基因] 。
不Ë 小号：

两种规范化都可以使用Excel完成。
有关包含示例的更详细的协议，请参阅本手册：“单一：分析工具集”（P / N 100-5066）https://www.fluidigm.com/binaries/content/assets/fluidigm/singular-analysis- toolset-3.5 / singular-analysis-toolset-3.5-userguide.pdf。

可以对单细胞qPCR进行多种统计分析
单细胞最常见的统计分析可能是t-SNE图，热图和ViolinPlot 。

对于Heatmap，我们使用了软件Partek Genomics Suite Software。t-SNE和Violin Plot都是由免费软件R使用“ ggplot2”软件包完成的。

笔记

对于单细胞分析，认为在物理上也是不可能的，而不是重复，这对于增加样品数量更为重要。因此，我们将每个样本运行了两次。每个样品分析总共192个单个细胞。
三种尺寸的C1 IFC板可将通道调整为不同大小的单元。在选择板的尺寸之前，我们通过取下分离后的细胞的照片并通过Keyence软件测量尺寸来计算细胞的大小。可用的尺寸为：S（5-10 微米），M（10-17 微米），L（17-25 微米）。作为参考，我们将M大小用于MDA-MM-231和MCF7单元；并且我们已经在L尺寸平板中运行了肝细胞（Katsuda 等，2019）。
最重要的步骤之一是单细胞隔离。在此过程中，细胞是从其本地环境中分离出来的，因此，保持这些细胞存活并处于良好状态以进行适当的进一步分析是必不可少的（Van Den Brink 等人，2017）。请仔细管理它们。
该协议是根据Fluidigm 系统制造商的协议（PN-100-6177 J1和PN 68000130 E1）完成的，可以在以下网址找到：https ://www.fluidigm.com/binaries/content/documents/fluidigm/resources/ c1-taqman-pr-100％E2％80％906117 / c1-taqman-pr-100％E2％80％906117 / fluidigm％3Afile 和https://www.fluidigm.com/binaries/content/documents/fluidigm/ resources / 96.96-ge-taqman％E2％80％90std-qr-68000130 / 96.96-ge-taqman％E2％80％90std-qr-68000130 / fluidigm％3Afile。

菜谱

注意：所有配方，除非另有说明，都是一次运行所需的试剂。

初始细胞悬液缓冲液
组件数量

EDTA（5M）0.1毫升

FBS 50 微升

PBS 10毫升

*该溶液可多次使用，应保存在4 °C下。

LIVE / DEAD细胞染色溶液（总计1253.13 微升）
组件数量

细胞洗涤缓冲液（C1单细胞自动制备试剂盒）1250 微升

乙锭同型二聚体-1（活/死盒）2.5 微升

钙黄绿素AM（活/死盒）0.63 微升

裂解混合物（总计18.1 微升）
组件数量

单细胞裂解液（Ambion公司单细胞-的Ct 的qRT -PCR试剂盒）12.75 微升

C1裂解Plus试剂（C1单细胞自动制备试剂盒）4.35 微升

C1 DNA稀释试剂（C1单细胞自动制备试剂盒）1 微升

*彻底涡旋

逆转录最终混合物（总计12.4 微升）
组件数量

终止溶液（Ambion公司单细胞-的Ct 的qRT -PCR试剂盒）1.94 微升

单细胞RT VILO混合物（Ambion公司单细胞-的Ct 的qRT -PCR试剂盒）5.84 微升

单细胞的SuperScript RT（Ambion公司单细胞-的Ct 的qRT -PCR试剂盒）3.62 微升

装载试剂（C1单细胞自动制备试剂盒）1 微升

*彻底涡旋

0.2x合并Taqman 引物（总计100μl ）
组件数量

1 微升的每个的Taqman 探针（X96探针）1 微升每

C1 DNA稀释试剂（C1单细胞自动制备试剂盒）4 微升

*彻底涡旋

**该试剂可预先制备，等分试样可在-20 °C下储存长达6个月。

前置扩增混合液（总计60μM ）
组件数量

单细胞PreAm 混合物（Ambion公司单细胞-的Ct 的qRT -PCR试剂盒）12 微升

样试剂（C1单细胞自动制备试剂盒）3 微升

合并的引物（预先制备的混合物）15 微升

DNA-游离水30 微升

*彻底涡旋

单细胞qPCR的10次检测
在qPCR 96孔板中，在每个入口中为每个Taqman 分析添加以下混合物。

组件每个入口的体积体积10个反应液

20倍的Taqman 基因表达测定法2.5 微升25 微升

2X测定样试剂2.5 微升25 微升

**该试剂可以预先制备，并且可以在-20 °C下保存6个月

样品预混
每个进样口的组分体积所有孔的样品预混合

的Taqman 通用PCR主混合物2.5 微升360 微升

20X GE上样试剂 0.25 微升36 微升

致谢

这项工作得到了科学研究资助（C）JSPS KAKENHI资助号：19K16761，青年科学家资助（A）JSPS KAKENHI资助号：17H04991和“诊断学的发展”的部分支持。日本医学研究与发展局（AMED）授予的“检测体液中miRNA的技术”。

该协议改编自Fluidigm 系统制造商的协议（PN-100-6177 J1和PN 68000130 E1）。

利益争夺

我们没有利益冲突要声明。

参考文献

Karaiskos ，N.，Wahle ，P.，Alles ，J.，Boltengagen ，A.，Ayoub，S.，Kipar ，C.，Kocks ，C.，Rajewsky ，N.和Zinzen ，RP（2017）。在果蝇胚胎，在单细胞转录组的分辨率。科学358（6360）：194-199。
Katsuda，T.，保坂，K.，松崎，J.，Usuba ，W.，Prieto的维拉，M.，山口，T.，土屋，A.，特莱，S。和Ochiya，T。（2019）。肝细胞异质性的转录组解剖：连接倍性，分区和干/祖细胞特征。细胞分子胃肠激素肝素。
Livak ，KJ，Wills，QF，Tipping，AJ，Datta，K.，Mittal，R.，Goldson，AJ，Sexton，DW and Holmes，CC（2013）。qPCR基因表达谱分析方法应用于1440个淋巴母细胞单细胞。方法59（1）：71-79。
M.Prieto -Vila，W.Usuba ，RU，高桥，I.Shimomura，H.Sasaki，T.Ochiya和Y.Yamamoto（2019）。单细胞分析揭示了管腔型乳腺癌亚型中先前存在的耐药性亚群。癌症研究79（17）：4412-4425。
Prieto- vila ，M.，Yamamoto，Y.，Takahashi，R.Ochiya，T.（2018）。单细胞转录组学。于：单细胞技术手册。新加坡施普林格。
Rato ，S.，Golumbeanu ，M.，Telenti ，A.和Ciuffi ，A.（2017年）。使用单细胞测序探索病毒感染。病毒Res 239：55-68。
V 的巢穴Brink的，SC，鼠尾草，F.，V é rtesy ，Á 。，Spanjaard ，B.，彼得森-马杜罗，J.，男爵，CS，罗宾，C.和van Oudenaarden ，A。（2017）。单细胞测序揭示了在组织亚群中解离诱导的基因表达。Nat Methods 14（10）：935-936。
Wen L.和Tang F.（2016）。干细胞生物学中的单细胞测序。Genome Biol 17：71 。
Woyke ，T.，Doud ，DFR和Schulz，F.（2017）。微生物单细胞测序的轨迹。Nat Methods 14（11）：1045-1054。
Zheng C.，Zheng L.，Yoo ，JK，Guo，H.，Zhang，Y.，Guo，X.，Kang，B.，Hu，R.，Huang，JY，Zhang，Q.，Liu， Z.，Dong，M.，Hu，X.，Ouyang，W.，Peng，J.和Zhang，Z.（2017）。通过单细胞测序揭示了肝癌中浸润性T细胞的景观。Cell 169（7）：1342-1356 e1316。
齐根海恩，C.，Vieth ，B.，帕雷克，S.，Reinius ，B.，Guillaumet -Adkins，A.，Smets ，M.，莱茵哈特，H.，海恩，H.，海尔曼，I。和Enard ，W （2017）。单细胞RNA测序方法的比较分析。Mol Cell 65（4）：631-643 e634。