材料和试剂

麻醉
米冰C57BL / 6J
Sevofluorane （Sevorane ® ）
氧气（O 2 ）纯度：99 。995％（液化空气，Alph agaz TM ）
一氧化二氮（N 2 O）（液化空气，Alphagaz TM ，CAS号：0 10024-97-2 ）

AAVs注射
高电平表面消毒剂依靠+论TM 卫可® （杜邦® ）
Barrie r和未过滤的移液器吸头（艺术吸头，Thermo Scientific）
胰岛素注射器BD Micro-Fine + Demi 0 。3毫升，30规格，8毫米（Becton Dickinson ，目录号：324826）
AAV。为了在该方案中靶向星形胶质细胞，我们使用AAV-PHP.eB-gfa-ABC 1 D-GFP构建体
Pluronic F-127（Sigma-Aldrich，目录号：P2443-2506）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Gibco TM ，目录号：70011044）
帕拉膜纸（美国Bemis，PM-996）

脑单细胞悬液
显微手术剪刀（精细科学工具，目录号：91501-09）
手术刀刀片（N ° 24，KRAPE SA，目录号：BS EN 27740）
˚F 等人牛血清（FBS）（Gibco公司TM ，目录号：10270）
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich）
DNase I（Roche Diagnostics，目录号：10104159001）
胰蛋白酶（Sigma-Aldrich ，目录号：T4799）
NaCl （Merck，目录号：106404）
KCl （Merck，目录号：104936）
MgSO 4 · 7H 2 O（默克，目录号：5886）
NaHCO 3 （Sigma，目录号：6329）
NaH 2 PO 4 ·2H 2 O （默克，目录号：106345）
β- D（+）葡萄糖（Sigma，目录号：G 5250）
酚红。（西格玛，目录号：P 5530）
KH 2 PO 4 （默克，目录号：4873）
HEPES（Sigma，目录号：H 3375）
CaCl 2 ·2H 2 O（默克，目录号：102381）
伯爵的平衡盐溶液（EBSS）缓冲液（请参阅食谱）
HBSS缓冲区（请参阅食谱）
Disagg reging 解决方案（请参阅食谱）
RESU spension溶液（见食谱）

线粒体ROS测定
MitoSOX TM 红色线粒体超氧化物指示剂（Molecular Probes，Inc.，Invitrogen TM ，Thermo F 垫圈，目录号：M36008）

设备

麻醉程序和AAV处理
自动移液器（Gils on的PIPETMAN TM ）
微量离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5424）
Vortex（科学工业公司，型号：Vortex Genie 2）
由气体分配塔（Hersill H-3，西班牙）和蒸发器（InterMed Penlons Sigma Delta）组成的麻醉系统（图1）
相当于Telstar Bio II Advance的II类机柜已通过EN-12469-2000认证

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图1 。麻醉系统

线粒体ROS测定
FACSCalibur TM 流式细胞仪（Becton Dickinso n ，目录号：342975），配备了15 mW的氩激光器
适用于流式细胞仪试管的离心机（Eppendorf，型号：C entrifuge 5810 R）

软件

BD CellQuest TM Pro 5.2版（Becton，Dickinson ＆Company和BD Biosciences）
FlowJo X 10.0.7r2（FlowJo ，LL C，Becton，Dickinson＆Company）

程序

通过后室静脉窦静脉注射腺相关病毒（AAV）的方案（图2）
在这里，我们描述了Vicente-Gutierrez 等人设计的实验方法。（2019）使用AAV-PHP.eB-gfa-ABC 1 D-GFP构建体。该协议的详细说明是在成年小鼠的星形胶质细胞中特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）。但是，这种方法可以是目标别人细胞和组织类型非常有用。在那种情况下，分别使用分别不同于AAV - PHP.eB 和gfa-ABC 1 D的衣壳或细胞特异性启动子，有必要进行验证，例如AAVs单位的有效数量，注射途径或给药途径等老鼠的年龄。

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图2 。注射星形胶质AAV（AAV-PHP.eB-gfa-ABC 1 D-GFP）后通过流式细胞术区分星形胶质细胞与其他成年小鼠神经细胞的方法

为所有使用的小鼠准备独特的AAVs悬液。
不Ë 小号：

由于高度浓缩的AAV悬浮液，粒子聚集是一个常见的问题。通过增加悬浮AAV的溶液的离子强度，可以最大程度地减少这种现象。为此，向PBS溶液中添加非离子表面活性剂（如普朗尼克F-127）（Penaud-Budloo等人，2018）。使用含有0.001％Pluronic F-127的PBS溶液作为载体溶液以及AAV悬浮液的稀释液。
接着步骤一步协议指的是使用一个单一的AAV构建体。但是，我们建议使用两种类型的对照条件，即amely：1）注射了媒介溶液（PBS + 0.001％Pluronic F-127）的小鼠，以及2）注射了在同一溶液中制备的空AAV构建体（无GFP）的小鼠所需病毒浓度的载体溶液。两只对照小鼠都将有助于消除感染后任何可能的有害反应，并易于区分注射AAV-GFP的小鼠中的GFP表达。
所有操作均应在II级防护层流柜内进行。与自动增值服务接触的产品必须进行净化依靠+ O ň TM 卫可® 。
计算同一天要注射的小鼠数量，并计算所有小鼠所需的AAV悬浮液的最终体积。给每只成年小鼠注射50 µl AAV悬浮液。因此，AAV悬浮液的总体积计算为V T = 50 µl x注射小鼠的数量。
每只成年小鼠在媒介溶液（PBS + 0.001％Pluronic F-127 ）中制备5 x 10 10 AAV-PHP.eB-gfa-ABC 1 D-GFP 病毒基因组。该浓度基于我们以前的经验，尽管建议检查每种AAV血清型和/或每种启动子在靶组织中目的蛋白的表达。应考虑到AAV 悬浮液的体积（V AAV ）可能会根据浓缩AAV悬浮液的库存稀释度而变化。
将载液（PBS + 0.001％Pluronic F-127 ）加入微量离心管的AAVs悬浮液（V AAV ）中，使其体积等于（V T - V AAV ），得到的体积为50μl。注入每只成年小鼠。这确保了5×10个所需的工作稀释度10 VI 每50μl的AAV悬浮液的RAL基因组。
用工作稀释液中的媒介物+ AAVs 悬浮液涡旋微量离心管10-15 s。
离心反应管全速20秒（〜21 ，000 X 克在微量）以回收所制备的AAV悬浮液的总量。
为每只小鼠准备单独的一次性30针注射器，其中装有50 µl AAVs悬液。
装入每个注射器时，请使用自动移液器以确保准确性。
通过重复吸液（约9次）匀浆，然后将50 µl等分试样装入每个注射器。
注意：装入注射器时，避免形成气泡。准确加载注射器而不会产生气泡的一种简单方法是在均质后在一块封口膜上准备50 µl的液滴。然后，将斜角向下的每个注射器从封口膜装入。

小鼠应先用6％的七氟烷麻醉，然后用气体分配塔和气化器在补充有O 2 和NO 2 （分别为0.4 L 和0.8 L / min）的空气中以3％的浓度进行麻醉。
注意：七氟醚应由经过麻醉管理的专业人士管理。七氟醚给药期间应监督呼吸，并在出现肌肉僵硬迹象时降低剂量。

通过眼眶后静脉窦向每只麻醉动物中注入50 µl等分试样，并将每只动物放回其家笼中（有关这种静脉内给药途径的具体建议和注意事项，请参见Yardeni 等，2011）。
注意：此管理途径需要特定的培训。为避免迫使或使压力穿过眼眶，将针小心地以大约30°的角度向下倾斜到内侧can。给药后通常在注射部位观察到一小滴血，可以用医用纱布清洗。每只小鼠的整个过程持续时间少于10分钟，包括注射，麻醉和从麻醉作用中恢复。

注射后等待三周，直到有时间表达AAV构建体。然后，可以使用荧光流式细胞术选择感兴趣的星形胶质细胞群。
注意：在第一周内，应收集任何含AAV的废物，包括被褥和老鼠的粪便，并将其放入生物危害袋中。然后应将废物高压灭菌以使AAV失活。注射后，所有小鼠应隔离至少3周，以避免可能的免疫反应，并允许转基因表达。

测量脑单细胞悬浮液中线粒体活性氧（mROS ）的协议
应在成年小鼠的星形胶质细胞中感染表达GFP 的AAV-PHP.eB-gfa-ABC 1 D-GFP构建体后三周进行。遵循下面描述的方案的步骤，使用荧光商业探针MitoSOX 提取大脑并准备用于测量mROS的单细胞悬液（Lopez-Fabuel 等人，2016; Vicente-Gutierrez 等人，2019）。

获取脑组织单细胞悬液的方案：

使用颈脱位法将小鼠牺牲，避免使用任何可能窒息ROS产生并导致随后的ROS测量偏倚的窒息方法。
提取大脑，并在必要时隔离感兴趣的大脑区域。
在室温（RT）下，用PBS冲洗大脑组织并将其浸入1 ml EBSS溶液中（配方1 ）。
按照酶和机械分解程序（最初由Almeida和Medina，1998年描述）从大脑组织制备单细胞悬液：
吸出EBSS解决方案的总量。
用显微外科手术剪刀或手术刀刀片切开大脑或脑部切片，获得〜3 mm 2 块。
为整个大脑添加500μl解离溶液（配方2 ），或为小块相应地缩放体积。
在37孵育 ℃下 10分钟，在摇动以允许发生温和的酶解离。
用10％的胎牛血清（FBS）中和胰蛋白酶以中止酶解。
离心组织（5分钟，500 x g ）并丢弃上清液。
加入1 ml的重悬溶液（第3条），然后用巴斯德移液器重悬沉淀，重复进行移液（10-15次），以实现平滑的机械分解。
将悬浮液静置5分钟，然后将上清液（包含单细胞）转移到新试管中。
向剩余的沉淀物中再添加1 ml重悬溶液，并重复均质过程（S teps B4g-B4h），以获得最终体积约2 ml的单脑细胞悬液（如有必要，重复一次）。

线粒体ROS丰度的测量：

将每个样品分成4等份：一个将用作MitoSOX 染色的阴性对照，另外三个将作为测试样品的技术重复样品。阴性对照应重悬于适当体积（每10 6个脑细胞1毫升）的HBSS溶液中（配方4 ）。以下步骤涉及测试样品的处理。
与荧光探针MitoSOX 一起孵育成人脑细胞悬浮液（每个样品至少使用3个技术重复样品）。
准备MitoSOX 工作溶液；HBSS缓冲液中的3 µM MitoSOX 试剂（配方4 ）。
离心脑细胞悬浮液以获得沉淀（5分钟，500 x g ）。
在大约10 6个脑细胞中加入1 ml MitoSOX 工作溶液后，通过轻轻并手动摇动试管来重悬沉淀。
注意：对细胞进行计数，以使MitoSOX 溶液的最终体积适应细胞总数。

根据制造商的规定，将细胞在避光的37°C下孵育30分钟。
孵育后，用2 ml温暖的HBSS缓冲液洗涤细胞一次。
离心脑细胞悬液以去除任何多余的MitoSOX （5分钟，500 x g ）。
使用适当的体积重悬于HBSS缓冲液中，以获取要在流式细胞仪中分析的单细胞悬液。
注意：从整个大脑中获得的每个重复样本的适当体积为500 µl，并针对较小的区域相应地缩放体积。考虑到“事件”是单个细胞，该体积允许最终稀释以评估FACScalibur 容许的小于300 事件/秒。

对于流式细胞仪，请使用大约510 nm激发光和一个荧光通道，该通道能够检测580 nm发射的氧化MitoSOX 试剂（BD FACSCalibur TM 流式细胞仪中的FL-3 ）。
流式细胞仪：
注意：流式细胞仪需要事先培训才能设置信号荧光补偿，并使流式细胞仪的参数适应脑细胞的大小和复杂性。

使用装有对照样品的试管，以校准用于检测单个或组合污渍的每个通道所需的电压调整。每个通道的补偿避免了荧光信号在不同通道中的干扰。本协议中用于校准目的的对照样品为：
非染色细胞。Ç ELLS无任何染色（无MitoSOX 从车辆注射的小鼠（无GFP）导出）。

仅对MitoSOX 通道呈阳性的细胞（BD FACSCalibur TM 流式细胞仪中的FL-3 ）。用MitoSOX 培养的注射有媒介物的小鼠的细胞。

仅对GFP通道呈阳性的细胞（BD FACSCalibur TM 流式细胞仪中的FL-1 ）。
从任何小鼠衍生的细胞注射的AAV-GFP（AAV-PHP.eB-GFA-ABC 1 d-GFP）而不与孵育MitoSOX 。

注意：正如所提到小号TEPS B5，最好是分割每采样1个复制（小鼠/脑区域），以获得非染色阴性对照样品，以消除不需要的测量MitoSOX 信道。

最后，应评估先前校准过的两个通道的测试样品：
首先，将电压设置为正向（FSC：单元大小）和侧面散射（SSC：单元复杂度），以使总体居中，并在点图XY图中正确显示样品。
使用对照样品校准和补偿通道（请参见上面的步骤B7a）。
校准后，使用确定的参数通过每个试管，并记录至少〜100,000-200,000个事件（此数字可能会因GFP阳性种群的预期百分比而异）。

数据分析

使用FlowJo 或类似软件来定量脑样本中MitoSOX 信号的强度。首先，观察前向（尺寸）和侧面（复杂度）散射标度，排除碎片或双峰事件的单元上的门。然后，使用用于执行标准补偿的阴性对照样品测量GFP和MitoSOX 信号的阈值（图3）。一旦建立了这些限制，就可以确定感兴趣的门中包括的事件的荧光强度值的平均值。

建议对每个样品至少使用三个技术重复，以获得每个生物学重复的稳健平均值。结果表示为信号强度的任意单位。

图3代表流式细胞仪分析中使用的工作流程，该流程显示了星形胶质细胞中表达线粒体标签过氧化氢酶（mCAT ）的亚型的小鼠星形胶质细胞mROS 含量较低（见Vicente-Gutierrez 等，2019）。

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图3 。流式细胞仪工作流用于脑细胞实验，以测量AAV-PHP.eB-gfa-ABC 1 D-GFP 感染小鼠后仅表达GFP的星形胶质细胞中的线粒体ROS（mROS ）（使用MitoSOX ）（原始数据包含在Vicente- Gutierrez et al。，2019）。

菜谱

考虑到其中一些解决方案是可商购的。

厄尔' 小号巴兰土木工程署盐溶液（EBSS）缓冲液
116毫米氯化钠

5.4毫米氯化钾

1.5 mM硫酸镁4

26毫米碳酸氢钠3

1.01毫米NaH 2 PO 4· 2H 2 O

4 mM葡萄糖

P 苯酚的制备红10毫克/ 大号pH 7.2的

解离/ 分解解决方案
EBSS溶液补充了0.3％（p / v）的牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich）

DNase I 20μg / ml（罗氏（Roche））

胰蛋白酶0.025％p / v（Sigma-Aldrich）（Almeida和Medina ，1998）

重悬液
EBSS溶液补充了0.3％（p / v）的牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich）

DNase I 20μg / ml（罗氏（Rome ））（Almeida和Medina ，1998）

HBSS缓冲区
134.2毫米氯化钠

5.26 毫米氯化钾

0.43毫米KH 2 PO 4

4.09 mM碳酸氢钠3

0.33 mM Na 2 HPO 4 ·2H 2 O

5.44 mM葡萄糖

20毫米HEPES

20毫米CaCl 2 ·2H 2 O

pH值7.4

致谢

我们感谢由萨拉曼卡大学的M. Carabias -Carrasco，L。Martin，E。Prieto-Garcia和M. Resch以及分子成像中心的G. Bonvento 实验室提供的技术援助和小鼠护理。（MIRCen ），法国巴黎大学CNRS UMR 9199 提供了AAV和有用的建议。我们还要感谢NICOLO 博诺拉和丹尼尔Jimenez- 布拉斯科谁参与了涉及此过程中的试点工作。

这项工作是由MINECO（SAF2016-78114-R），萨洛德·卡洛斯三世研究所（CB16 / 10/00282），NIH / NIDA（1R21DA037678-01），Ayudas EquiposInvestigaciónBiomedicina 2017FundaciónBBVA，FundaciónRamónAreces和Junta de资助的卡斯蒂利亚·莱昂（Escalera de Excelencia CLU-2017-03）。该协议最初由Vicente-Gutierrez 等人描述。（2019）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

我们按照欧盟指令86/609 / EEC和建议2007/526 / EC所执行的所有动物程序，有关用于实验和其他科学目的的动物的保护，在西班牙立法中根据指令RD1201 / 2005强制执行。所有方案均已获得萨拉曼卡大学生物伦理委员会的批准。

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