材料和试剂

2 ml螺帽管（Sarstedt ，目录号：72.694.006）
50 ml锥形管（Greiner Bio-One，目录号：7.210 261）
500 微升自动进样器卡环小瓶（Sigma，目录号：27422）
自动进样器样品瓶盖（Sigma，目录号：24757）
25毫升不锈钢研磨罐（Retsch ，目录号：02.462.0119）
12毫米不锈钢磨球（Retsch ，目录号：05.368.0032）
锡称量舟，5 x 9 毫米（Santis Analytical AG，货号：SA76981103）
0.22 μ 米无菌PES膜过滤器（生命系统设计AG，目录号：99255）
金属锅铲
塑料称量纸（HuberLab ，目录号：12.9702.080 ）
锥形管（Grenier Bio，目录号：7.210 261）
尼龙网，60 微米孔径（Sefar公司Nitex ，目录号：3A03-0060-110-00）
正方形培养皿板（Greiner Bio-One，目录号：7.688.102）
均质珠（取决于材料的数量）：
小玻璃珠（2.85-3.45 mm珠，Roth，目录号：A557.1）
大型金属球（12 毫米珠，Retsch ，目录号：05.368.0032）
CarboPac PA20色谱柱（3 x 150 mm， Thermo Fis her Scientific，目录号：060142）
CarboPac PA20保护柱（3 x 30毫米，Thermo Fis her Scientific，目录号：060144）
拟南芥拟南芥
乙醇（苏黎世联邦理工学院HCI商店，目录号：02000107）
氯仿（Sigma，目录号：25693）
甲醇（苏黎世联邦理工学院HCI商店，目录号：02000342）
丙酮（Sigma，目录号：24201-4X2.5L-GL-R）
（可选）酶促淀粉降解
淀粉葡糖苷酶（Sigma，目录号：10102857001）
α- 淀粉酶（Sigma，目录号：10102814001）
硫酸（Sigma，目录号：258105）
超纯水（Milli-Q或同等水平）
单糖分析标准：
L-岩藻糖（Sigma，目录号：F2252-5G）
D-葡萄糖（Sigma，目录号：G7528-1KG）
D-半乳糖（Sigma，目录号：48260）
D-木糖（Sigma，货号：W360600-SAMPLE）
D-甘露糖（Sigma，目录号：63579）
L-阿拉伯糖（Roth，目录号：51 18.2）
L-鼠李糖（Sigma，目录号：W373011-SAMPLE-K）
D-半乳糖醛酸一水合物（Sigma，目录号：48280）
D-葡萄糖醛酸（Sigma，目录号：G5269-10G）
（可选）替代内部标准
D- 七庚糖（CarboSynth ，目录号：MS139006）
D-核糖（Sigma，目录号：R7500-5G）
氢氧化钠，在水中的50％溶液（Sigma，目录号：415413）
无水乙酸钠（Sigma，目录号：32319-1KG-R）
Lugol 解决方案（Sigma，目录号：32922-6X1L）
液氮

设备

冷冻干燥机（基督，阿尔法2-4）
微量离心机（Eppendorf，型号：5424 R）
样品浓缩器（Stuart，型号：SBHCONC / 1）
高压灭菌器兼容机架（Karter Scientific，目录号：125A7 ）
微量天平（Mettler Toledo MX5）
组织匀浆器（Retsch MM200）
微量离心管摇床（Eppendorf ThermoMixer F1.5）
旋转管（Labinco LD79，目录号：79000）
高速真空离心机（Eppendorf Concentrator Plus）
高压灭菌器（Thermo Fis 她的科学，Sterico ，Varioklav ）
加热块（Stuart，型号：SBH130D）
自动进样器（Dionex ，型号：AS-1）
Dionex ICS-5000（Dionex，型号：DC-5）
ED电化学检测器（无电池，产品编号：072042）
ED Cell（无参比电极或工作电极，产品编号：072044）
聚四氟乙烯（PTFE）一次性电极上的金（Au）（产品编号：066480）

软件

Chromeleon 8（Thermo Fisher Scientific）
可通过https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/CHROMELEON7付费获得

微软Excel
可通过https://www.office.com付费使用

GraphPad棱镜
可通过https://www.graphpad.com付费使用

Spyder5（Anaconda3）
可从https://www.anaconda.com免费获得

Python 3.6
可在https://www.python.org免费获得

程序

A. 生成和准备植物材料

的Gr 流在所希望的条件下的植物
注意：可以从任何所需的生长方法中收集植物样品。我们建议采用以下体外方法从光生（每天循环）幼苗或暗生下胚轴产生的拟南芥材料中分离。

气体或液体将种子灭菌并在4°C下分层2-3天。
板：准备?MS + 1％蔗糖+ 0.9％琼脂方形培养皿；消毒尼龙网并放在琼脂板上; 在平板顶部播种约100-120粒种子；在所需的时间点将材料收集在50 ml锥形管中；加工前去除种子。
对于光照生长的植物，植物生长在升飞行持续14天，长日照条件下（16岁以下小时光照，8 小时黑暗）的光为拟南芥（130-150优化μE 米-2 小号-1 在20-22）° C。
对于深色的胚轴，每盘播种多行种子（不播种尼龙）。将种子在光照下播种2-4小时；覆盖几层铝箔，并在20-22°C的恒温箱中生长5天。
离开工厂的黑暗HARVES 24-48小时之前婷耗尽淀粉储备; 如果不可能的话，可以在植物材料均质化之后进行酶促淀粉降解（进行至S tep A5 ）。
如果分析气生植物组织（含叶绿素），收获材料在足够的70％的乙醇，以完全浸没的植物材料，并且直到叶绿素耗尽继续交换乙醇和液体不再具有绿色的任何痕迹颜色。
如果包含非叶绿素植物部分是要被分析，收获及闪烁冷冻样品用液氮，然后继续在磨削小号TEP A5。

除去乙醇，并使用冷冻干燥机将物料干燥2天（如果需要，可以更长）。
使用组织均质器，直径为12 mm的金属球和金属容器研磨所有植物材料。
笔记：

如果仅产生少量物质，则可以将根部收获到微量离心管中，并使用带有机架的组织均质器用于微量离心管，并使用玻璃珠进行研磨。在这种情况下，分装≤ 200 毫克的植物材料，以确保彻底均化。
收集植物材料时，必须避免收集琼脂，土壤或样品中含有糖的任何生长培养基（NB琼脂将有助于半乳糖定量）。尼龙网可如上所述使用，以防止琼脂粘附到根部。

B. 淀粉降解，如先前所述（Hostettler 等，2011），进行了如下修改：

等分试样地面的植物材料高达?0.5毫升在2 ml微离心管中。
加入1 ml 80％乙醇（v / v），并在95°C加热样品10分钟。将每个样品涡旋10-15 s，使其充分混合。
室温（RT）于3,000 xg离心5分钟; 丢弃上清液。
注意：除非另有说明，所有离心步骤均应在室温下进行。

继续以下洗涤步骤：每次洗涤在ThermoMixer中摇动10分钟，以3,000 xg离心5分钟，涡旋以在洗涤之间重新悬浮沉淀，弃去上清液，然后添加下一种洗涤溶液：1 ml 50％（ v / v）乙醇，1 ml 20％（v / v）乙醇，1 ml水，最后是1 ml 80％（v / v）乙醇。
注意：在步骤B4之后，最后的洗涤应该基本清除，但沉淀可能仍是绿色的。

在室温下使用高速真空离心机或在60°C的烤箱中干燥沉淀至少30分钟或整夜，直至完全干燥。重悬于400μl 水中并涡旋混合。
在95 °C下煮沸10-15分钟- 请勿在冰上冷却。
准备9份淀粉葡糖苷酶和1份α-淀粉酶的消化混合物。
注意：消化混合物的体积计算需要根据样品的总数，牢记20 微升所述混合物的每样品所需。一个样品需要18 微升的amyloglucosiades 和2 微升α淀粉酶。

添加380 微升0.22M的醋酸钠至20 微升的制备9:1 淀粉葡糖苷酶：α淀粉酶混合物; 与400μl 样品合并。
注意：如果要处理更大的样品量，可以将样品重悬在更大体积的水中。对于消化，只需将等份样品与消化混合物合并，然后按照指示进行即可。

在37°C下消化至少2小时。
用Lugol 溶液将一小部分植物材料染色，检查是否残留淀粉。
注意：Lugol 染色建议的步骤：

混合20 微升80样品微升的100％乙醇。
在90°C下煮沸5分钟。
以5,000 x g离心5分钟。丢弃上清液。
添加25 微升的Lugol 溶液; 检查的colo UR 5分钟后的变化。
Lugol 溶液可以全浓度使用，而无需稀释所购溶液。
颜色更改为深蓝色/黑色颜色表示淀粉存在。
如果观察到颜色变化，请继续消化过夜，然后再次使用Lugol 检查。继续消化直至不再观察到颜色变化（图1）。
一旦未观察到颜色变化，请继续执行步骤A11。
将样品以5,000 xg离心5分钟，然后保留不溶部分。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902838--1288克拉拉·桑切斯-罗德里格斯819822 \ Figs jpg \ fig1.jpg

图1. Lugol 染色表明存在或不存在淀粉。一。充分浓度的Lugol 单独具有淡黄色颜色（左管），而复方碘直接加入到淀粉从玉米中提取示出强烈的暗棕色/紫色的颜色变化（右管）。B.两个管都包含细胞壁AIR材料；左侧的试管没有经过淀粉降解，而右侧的试管则没有。下列中描述的方法小号TEP A10，加入25 微升全浓度的Lugol 会弄脏含淀粉暗棕色/紫色空气样品颜色，如在右管观察到。如果将Lugol 添加到样品中后仍保持黄色，则说明不存在淀粉，可以继续进行S tep A11。

C. 清洁和生产最终细胞壁衍生的不溶性酒精（AIR）制剂

将等分试样在2 ml微量离心管中解淀粉，直至0.5 ml。
添加1.5毫升的1：1 甲基的ANO1 ：氯仿（体积/体积）混合物中以样品并涡旋以彻底混合。使用设置为15 rpm的试管旋转器或任何标准试管混合器将样品混合2 h。
在室温下以10,000 xg离心5-10分钟，然后除去上清液。
加入1.5 ml RT丙酮并涡旋充分混合。使用设置为15 rpm的试管旋转器或任何标准试管混合器混合30分钟。
在室温下以10,000 xg离心5-10分钟，然后除去上清液。
使用高速真空离心机或在60°C的烤箱中于室温下干燥最终沉淀至少30分钟或过夜，直至完全干燥。最终产物是细胞壁来源的不溶性酒精残留物（AIR）。

D. 如Yeats 等人所述进行样品和标准水解。（2016a ）（参见图2 中这个手稿）。简要地，该方法总结如下：

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902838--1288克拉拉·桑切斯-罗德里格斯819822 \ Figs jpg \ fig2.jpg

图2 。单个HP LC的梯度曲线可洗脱所有细胞壁单糖。每个颜色块对应一个特定的洗脱液，如右图例所示。y轴的主要特征（左侧）为百分比，是指每种洗脱液占流经色谱柱的最终混合洗脱液所占的百分比，总含量始终等于100％。二次y轴（右）表示体积（米升每洗脱液用完/分钟），与全混合洗脱，其中每个单独的洗脱剂有助于的百分比。x轴指示所指示的洗脱液组合物应进行的时间量（分钟）。

使用微量天平和锡称量舟，将每个技术复制品称量1±0.1 mg AIR到2 ml螺帽管中；记录最终重量（分析步骤所需）。
笔记：

如果需要在两次采样之间清洁用于称量AIR的刮刀，请勿使用任何种类的纸巾/纸巾。使用塑料称量纸在两次样品之间用100％乙醇彻底擦洗。
我们建议每次水解至少每个样品进行两次技术重复（即，仅对基质进行水解的样品进行2次技术重复，对进行Saeman 水解+基质水解的样品进行2次技术重复），每次实验分析均进行3次生物学重复。
在样品水解之前，可以将内标（七庚糖或核糖）直接添加到称量的AIR等分试样中。允许内部标准，以完全干燥30分钟或更长的时间在必要时，无论是在室温下或用样品浓缩。
对于我们的测定，我们向AIR材料中添加了150μg 的七庚糖；但是，必须根据所选仪器的工作范围进行测量的样品稀释度来优化此量。
标准（核糖或七庚糖）的添加不是强制性的。但是，它们提供了确定性的附加度量，以确保水解和定量的一致性。
七羟庚糖在该分析中效果更好，因为我们观察到了一个与核糖具有相同保留时间的“背景”峰。但是，如果仪器或样品稍有不同，则可以使用核糖。应在水解所有样品和标准品之前进行测试。
一个样品组将经受Saeman 以及基质水解作用，而第二个样品组将仅经受基质水解作用。
注意：以前，此方法是使用高压灭菌法作为水解方法来描述的（Yeats 等，2016a ）。我们确认这是一次可水解多达50个样品的有效方法。但是，如果在121°C下加热1小时完成水解，则我们也确认了HPLC分析和定量的有效性。但是，使用高压灭菌法完成水解时，数据更加一致（图3 ），这可以减少误差。此外，使用加热块水解似乎半乳糖醛酸的水解可能是不完全的，尽管所有其他单糖值似乎在两种方法中都保持一致。也可以在较低温度（80-100 °C）下使用加热块以延长水解时间，但是应对此进行测试和优化。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902838--1288克拉拉·桑切斯-罗德里格斯819822 \ Figs jpg \ fig3.jpg

图3. 样品水解可以使用加热块或高压釜完成，但有微小差异。来源于光生长的野生型Col-0幼苗的细胞壁AIR的单糖洗脱曲线。每种水解方法每个样品至少要进行两次技术重复。条形表示2个生物学重复的平均值±标准误差。

为了进行标准曲线分析，请制成100μg 储液，其中包含用于定量的所有单糖以及适当的内标。根据测定范围稀释成适当的标准浓度。
是推荐的浓度，以产生标准曲线，如下所示：注0.05 微克，0.1 微克，0.5 微克，1 微克，2 微克，5 微克。

为了在水解和计算特定的单糖-校正因子考虑糖特异性的损失，通过结合500准备两个恢复标准微升的100 微克具有900标准混合物微升水。
一种回收标准品与基质水解样品（水+酸，在121°C下水解1小时）处于相同条件下。
第二回收标准用酸处理，但不进行热水解。
水解完成后，让样品在室温下冷却，并以20,000 xg 离心1分钟以沉淀任何不溶物。上清液用于下一步骤。

E. HPLC分析

进样前根据需要稀释样品上清液（根据起始材料和检测器的灵敏度，可以使用1：10、1：20、1：50或1：100稀释液），然后移入自动进样瓶中。
笔记：

适当的标准液和稀释液可能会根据样品或检测器的灵敏度而有所不同；建议在完成所有材料处理之前彻底测试标准液和样品稀释液以优化条件。
强烈建议将样品分析的顺序随机化，并每隔10-15个样品运行一次标准液，以确保测量的灵敏度和准确性始终如一。
制备洗脱液；用氦气吹扫并保持在氦气下，或按照制造商的指示进行吹扫（Rohrer，2017）。含有乙酸钠任何洗脱液必须使用0.22被过滤微米PES过滤器。在添加50％氢氧化钠溶液之前，必须将所有洗脱液吹扫至少10分钟，然后在添加后至少吹扫至少10分钟。
洗脱液A =水

洗脱液B = 50 mM 氢氧化钠

洗脱液C = 100 mM氢氧化钠，100 mM乙酸钠

洗脱液D = 200 mM氢氧化钠

将每种标准品，回收标准品和标准品的10μl 注入配有3 x 50 mm CarboPac PA20保护柱的3 x 150 mm CarboPac PA20 色谱柱。
将色谱柱温度保持在36 °C，流速为0.4 ml / min。
使用以下洗脱曲线洗脱所有单糖和标准品（图4 ，表1 ）：0-18 分钟4.8％B，95.2％A；18-20 分钟线性梯度到下一个条件；20-30 分钟50％D，50％A; 30-40 分钟线性梯度下一个条件；40-56 分钟100％C; 56-56.1 min 线性梯度到50％D; 56.1-60 分钟50％D; 60-60.1 分钟更改为下一个条件；60.1-80 分钟，4.8％B，95.2％A使柱回到起始条件：

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图4.单个HPAEC-PAD运行中细胞壁单糖的洗脱曲线。四个独立的注射被呈现：1 微克/ ml的标准混合物使用核糖作为内标（蓝色），1 微克/毫升使用标准混合物景天庚酮糖作为内标（黑色），和野生型Col-0中基质水解的一例（使用加热块水解）（粉红色），以及野生型Col-0 Saeman 水解+基质水解曲线的实例，其中添加了七庚糖作为内标（使用加热块水解）（棕色）。样品水解后（粉红色），出现一个背景峰（*），该峰明显与核糖峰（蓝色）重叠。

笔记：

随着更多样品的运行，峰的保留时间可能会发生变化，因此可能需要定期进行“色谱柱冲洗”并监测色谱柱性能。
短“列冲洗”期间被结合到梯度分布（?5分钟的100mM的NaOH在56分钟的）; 但是，也可以定期运行冲洗程序，如下所示：30分钟100％洗脱液C，然后30分钟100％洗脱液D，经过短暂的平衡步骤（约10-15分钟）回到起始条件（95.2％洗脱液A ，4.8％洗脱液B）。
如果观察到色谱柱性能发生重大变化，则必须立即采取措施，按照制造商的说明完全冲洗色谱柱。简而言之，我们通过执行以下操作完成了列冲洗：
通过关闭电极/检测器并旋松色谱柱出口来断开色谱柱与检测器和常规机器的连接。
用2 M NaOH （允许流通液滴入废液容器）洗涤柱1小时；直到压力达到调节流速相似的水平在样品分析期间运行压力（在这种情况下，?2 ，200磅）。
用起始条件（在本方案中为4.8％洗脱液B，95.2％洗脱液A）重新平衡色谱柱30分钟；再次，调整流速直到样品分析过程中压力达到与运行压力相似的水平，然后将流过的液体收集在废物容器中。
重新连接? olumn到该系统，并且运行一个水样品，随后使用普通的梯度分布与样品分析继续之前的标准。
对于此分析，已充分参考制造商的技术说明（Basumallick 和Rohrer，2017年）。

表1.植物细胞壁单糖洗脱梯度步骤

时间（分钟）

洗脱液A（％）

洗脱液B（％）

洗脱液C（％）

洗脱液D（％）

0-18

95.2

4.8

0

0

20

50

0

0

50

30

50

0

0

50

40

0

0

100

0

56

0

0

100

0

56.1

0

0

0

100

60

0

0

0

100

60.1

95.2

4.8

0

0

80

95.2

4.8

0

0

数据分析

所有标准曲线和样品峰均使用Chromeleon 8.0软件进行积分，并使用Microsoft Excel进行分析（如Yeats 等人所述）。（2016年a ）。Grap hPad Prism用于统计分析和生成图形。
为了便于将数据输入Microsoft Excel，可使用Chromeleon中的自定义峰调用分析方法和Python脚本将积分曲线值复制到经过排序的转置Excel电子表格中。随后可以将值复制到与Yeats 等人中描述的方法类似的分析表中。（2016年a ）。
来自Chromeleon 运行的原始数据必须另存为Excel电子表格，与Python脚本位于同一文件夹中。
可以在Chromeleon中直接调整峰调用，以将输出限制为仅分析所需的糖。
的Python脚本可以被修改以分析所有细胞壁菅RS，因为如果以及葡糖胺需要，或其它附加的糖。
注意：如果使用Python脚本进行分析，请根据脚本中第9行的输入参数调整Chromeleon 软件将调用的峰数，以反映Chromeleon 软件将调用的峰数。

结论：

该协议可用于高效定量所有细胞壁单糖，例如使用HPAEC-PAD梯度图。该定量将允许可靠地表征单糖组成，并允许确定来自植物细胞壁的结晶和非结晶部分的葡萄糖的比例。例如，使用野生型（Col-0），以及表征充分的纤维素缺乏突变体和prc1-1，我们证明了该方法足以解决细胞壁突变体之间的差异（图5）。另外，该分析已经在最近的研究中用于量化源自结晶纤维素的葡萄糖的差异（Kesten 等，2019）。该方法简单，可靠和一致，可用于更好地了解生物学背景下细胞壁单糖的组成变化。过去的方法依赖于多种水解方法或HPLC梯度来分别定量中性细胞壁单糖，糖醛酸和纤维素。因此，该分析代表了总细胞壁单糖分析的简化替代方案。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902838--1288克拉拉·桑切斯-罗德里格斯819822 \ Figs jpg \ fig5.jpg

图5 。使用这种水解和分析方法，可以将细胞壁突变体与野生型区分开来。来自暗生长的Col-0或缺乏纤维素的prc1-1 下胚轴的细胞壁AIR的单糖洗脱曲线。每种水解方法每个样品至少要进行两次技术重复。条形代表2或3个生物学重复的平均值（分别对于Col-0或prc1-1 ）±标准误差。

致谢

非常感谢S. Zeeman（ETHZürich）和T. Yeats（康奈尔大学）的技术建议，C. Kesten （ETHZürich）的科学讨论，以及S. Dora（ETHZürich）和A.GarcíaMoreno（马拉加大学））在此协议的开发和优化过程中提供技术支持。如前所述，该协议是从Yeats，T.，Vellosillo ，T.，Sorek ，N.，Ibá?ez，AB和Bauser ，S. （2016 ）改编和修改的。生物协议6（20）：e1 978 。这项工作得到了瑞士国家基金会对CS-R的资助。（SNF 31003A_163065 / 1; AM）。

利益争夺

没有利益冲突或利益冲突。

参考文献

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DJ科斯格罗夫（2005）。植物细胞壁的生长。Nat Rev Mol Cell Biol 6（11）：850-861。
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Hostettler，C.，K ? 灌装，K.，Santelia，D.，Streb，S.，Kotting，O.和塞曼，SC（2011）。叶绿体中淀粉代谢的分析。方法分子生物学775：387-410。
Kesten ，C.，Gámez-ArjonaFM，Menna，A.，Scholl，S.，Dora，S.，Huerta，AI，Huang，H.，Tintor，N.，Kinoshita，T.，Rep，M.，Krebs ，M.，舒马赫，K.，S á nchez-罗德里格斯，C。（2019）。病原体引起的pH变化调节植物的生长防御平衡。EMBO Journal：e101822 。
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Yeats，T.，Vellosillo ，T.，Sorek ，N.，Ibá?ez，AB和Bauer，S.（2016 a ）。一步两步水解和hpaec-pad快速测定植物细胞壁中的纤维素，中性糖和糖醛酸。生物协议6（20）：e1978。
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