材料和试剂

注意：如果没有另外说明，请在室温下存放所有材料和试剂。对于所有溶液，请使用通过反渗透获得的超纯水。

在大肠杆菌中生产PhyB-AviTag
50 ml锥形离心管（Corning，目录号：352070）
0.22μm的PES注射器过滤器小号（卡尔罗斯，目录号：P668.1）
BL21星（DE3）一枪具有化学活性的大肠杆菌（Thermo Fisher Scientific，目录号C601003），储存在-80°C
质粒pMH1105（可通过Addgene公司，质粒ID 131864. Addgene公司于质粒作为转化的大肠杆菌在穿刺培养格式净化从质粒。大肠杆菌用小量制备试剂盒，例如，向导加SV Miniprep试剂盒，临兆，目录号： A1330），将纯化的质粒DNA保存在-20°C。有关质粒序列，请参见表S1。
冰
光度计试管（VWR，目录号：634-0676）
液氮
溶源性肉汤（LB）（Luria / Miller，Carl Roth，目录号：X968.1）
硫酸链霉素（PanReac AppliChem，目录号：A1852）
异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG，Carl Roth，目录号：CN08.4）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（PBS，Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
D（+）-生物素（Carl Roth，目录号：3822.1）
NaHCO 3 （Sigma-Aldrich，目录号：31437-M）
三（2-羧乙基）膦（TCEP）盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：C4706）
N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸酸（HEPES，卡尔罗斯，目录号：9105.4）
氯化钠（卡尔·罗斯，目录号：9265.2 ）
咪唑（Carl Roth，目录号X998.3）
甘油（Carl Roth，货号：3783.2）
LB培养基（请参阅食谱）
50 mg / ml链霉素原液（请参阅食谱）
1 M IPTG储备溶液（请参阅食谱）
5 mM生物素储备溶液（请参阅食谱）
100 mM TCEP储备溶液（请参阅食谱）
裂解缓冲液（请参见食谱）

PhyB-AviTag的纯化
1.5 ml 微量离心管（Sarstedt ，目录号：72.690.001）
冰
Ni-NTA Superflow 色谱柱（Qiagen ，产品目录号：30761），储存于4°C
Spin-X UF 20离心浓缩器，10 kDa MWCO，PES（Corning，目录号：431488）
HiPrep 26/10脱盐柱（GE Healthcare，目录号：17508701），在4°C下储存
Bradford分析试剂（Bio-Rad，目录号：5000006），在4°C下储存
甘油（Carl Roth，货号：3783.2）
液氮
牛血清白蛋白（BSA，Sigma Aldrich，目录号：A6003-25G），储存于4°C
裂解缓冲液（请参见食谱）
洗脱缓冲液（请参见配方）
蛋白质缓冲液（请参阅食谱）
1 mg / ml BSA蛋白标准品（请参见食谱）

纯化的PhyB-AviTag的分析
1.5 ml 微量离心管（Sarstedt ，目录号：72.690.001）
黑色96孔板（Corning，目录号：3915）
紫外线透明96孔板（Greiner Bio-One，目录号：655801）
1毫升透明注射器（Carl Roth，目录号：H999.1）
PVDF膜（Merck Millipore，目录号：IPVH00010）
SDS-PAGE凝胶，10-15％（W / V）聚丙烯酰胺，p 根据repare 制造商的指令的迷你-PROTEAN利细胞SDS-PAGE系统（Bio-Rad）上，储存在4℃下
PageRuler 预染蛋白梯（Thermo Fisher Scientific，目录号：26616）
Avidin-HRP（Sigma-Aldrich，目录号：A7419），储存在-20°C
ECL试剂（Cell Signaling公司，目录号：6883），小号撕在4℃下
链霉亲和素琼脂糖（Merck Millipore，目录号：69203），在4°C下储存
BL21 Star（DE3）pLysS 单发化学感受态大肠杆菌（Thermo Fisher Scientific，目录号：C602003），储存在-80°C
质粒pHB111 （Beyer 等人，2018b），在-20°C下撕裂
SEC柱Superdex 200增加10/300 GL（GE Healthcare，目录号：28990944），在4°C下储存
凝胶过滤标准品（Bio-Rad，目录号：1511901），储存在-20°C
Tris（卡尔·罗斯，目录号：AE15.2）
十二烷基硫酸钠（SDS，Carl Roth，目录号：CN30.3）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
溴酚蓝的钠盐（卡尔罗斯，目录号：A512.1 ）
二水合醋酸锌（Sigma-Aldrich，目录号：96459 ）
醋酸（Carl Roth，目录号：T179.2 ）
2-丙醇（Carl Roth，目录号：CP41.3）
考马斯亮蓝R 250（Carl Roth，目录号：3862.2）
乙醇（Carl Roth，目录号：T171.3）
吐温20（Carl Roth，货号：9127.2 ）
氨苄西林钠盐（Carl Roth，目录号：K029）
氯霉素（PanReac AppliChem，目录号：A1806）
5个SDS加载缓冲区（请参阅食谱）
锌溶液（请参阅食谱）
考马斯解决方案（请参阅食谱）
脱色溶液（请参阅食谱）
阻塞缓冲区（请参见食谱）
洗涤缓冲液（请参见配方）
珠子缓冲液（请参阅食谱）
100 mg / ml氨苄西林储备溶液（请参阅食谱）
34 mg / ml氯霉素储备溶液（请参阅食谱）
蛋白质缓冲液（请参阅食谱）

设备

在大肠杆菌中生产PhyB-AviTag
500 ml和2 L带挡板的烧瓶，高压釜
Thermoshaker （TSC ThermoShaker ，Analytik的耶拿）
加热和冷藏的细菌振动培养箱（Innova 44R振荡器，轨道直径：2英寸，Eppendorf）
光度计（GE Healthcare ，型号：GeneQuant 1300 ）
带有JLA-8.1000转子（Beckman Coulter，型号：JLA-8.1000）和1 L离心烧杯（Beckman Coulter）的Avanti J-26 XP （Beckman Coulter，型号：Avanti J-26 XP）离心机，用于收获细菌
超低温冰箱（-80°C，三洋，型号：MDF-U54V ）

PhyB-AviTag的纯化
37°C的水浴（PEQLAB，型号：WB -4MS ）
高压均质机（SPX Flow Technology，型号：APV-2000 ）
带有JA-25.50转子（Beckman Coulter，型号：JA-25.50）的Avanti J-26 XP （Beckman Coulter，型号：Avanti J-26 XP）离心机和50 ml离心烧杯（Beckman Coulter），用于澄清裂解液
快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统（GE Healthcare，?KTAexplorer ）
离心机Biofuge 的Primo - [R （热科学，目录号：75005440 ）与转子（Thermo Scientific，目录号：75007588 ），用于离心浓缩器
1.5 ml微量离心管的离心机（Eppendorf ，带有转子FA-24x2的5425 离心机）

纯化的PhyB-AviTag的分析
Thermoshaker （TSC ThermoShaker ，Analytik的耶拿）
SDS-PAGE系统（Bio-Rad ，Mini-PROTEAN Tetra Cell ）
溴化乙锭琼脂糖凝胶成像系统（Gel iX Imager，Intas）
半干式电印迹系统（VWR ，PerfectBlue ）
化学发光成像系统（GE Healthcare ，ImageQ uant LAS 4000 Mini ）
用于1.5 ml微量离心管的离心机（Eppendorf，带有转子FA-24x2的离心机5425 ）
定制的LED面板具有660 nm（LED660N-03）和740 nm（LED740-01AU，均为Roithner Lasertechnik ）LED和可调强度。有关LED面板的更多信息，请参见Müller 等。（2014年）
光纤光谱仪（Avantes ，AvaSpec-ULS2048 ）用于测量光强度
绿色安全灯（欧司朗，Deco Flex LED灯带）
酶标仪（Tecan ，型号：Infinite M200 Pro ）
FPLC系统（GE Healthcare，?KTAexplorer ）

程序

注意：如果不是另有说明，执行在室温下的所有步骤。

在大肠杆菌中生产PhyB-AviTag
用编码PhyB （1-651）-AviTag-His6的质粒pMH1105 以及生物合成酶HO1和PcyA 转化大肠杆菌BL21 Star （DE3）：
在冰上解冻的大肠杆菌BL21 Star（DE3）细胞的等分试样1（50 μl）。

b 向解冻的细菌中加入1 μl浓度为10-1,000 ng / μl的pMH1105质粒DNA，并轻轻敲打试管进行混合。

c 在冰上孵育20分钟。

d 在42°C 的恒温摇床/加热块中孵育45 s。

e 在冰上孵育2分钟。

f 加入500 μl LB培养基，并在37℃750 rpm 的恒温振荡器中孵育1小时。

g 将细菌转移到装有10 ml LB培养基的50 ml锥形离心管中，该培养基中补充有100 μg / ml链霉素。

h将细菌于37°C，150 rpm下孵育过夜（?15 h）。

第二天，在500 ml带挡板的烧瓶中接种100 ml补充了100μg/ ml链霉素的LB培养基，并进行过夜培养（预培养）。
在37 °C，150 rpm下孵育4小时。
在每10毫升预培养（表达培养）的2升带挡板的烧瓶中接种6 瓶补充有100微克/毫升链霉素的1升LB培养基。
在30°C，150 rpm下生长，直到达到OD 600 为0.6-0 .8 。使用比色皿和光度计，使用与空白相同的LB介质测量600 nm处的光密度。
通过向每种表达培养物中加入1 ml 1 M IPTG储备液来诱导蛋白质生成（最终浓度= 1 mM ）。
向每种表达培养基中加入10 ml 5 mM生物素溶液（终浓度= 50 μM）。
在黑暗中于18°C，150 rpm孵育20小时（请参见注释1）。
收获细菌（表达培养应略带绿色，图1A）通过离心在6，500 ×g下为在4℃下10分钟。
在裂解缓冲液（每1 L表达培养液30 ml裂解缓冲液）中重悬细菌沉淀（应为绿色，图1B ）。
将等分试样的细菌重悬于50 ml锥形离心管中，在液氮中骤冷并储存于-80°C。

D：\ Reformatting \ 2019-12-30 \ 1902972--1283 Wolfgang Schamel 837223 \ Figs jpg \图1.jpg

图1 A的图片PHYB - shRNA表达克隆产生性大肠杆菌培养收获前，B.相应的细菌沉淀和C.纯化PHYB-shRNA表达克隆蛋白。培养物带有绿色阴影，而细菌沉淀则明显为绿色。纯化的PhyB-AviTag （3 mg / ml）具有青绿色。

PhyB-AviTag的纯化
在37°C水浴中解冻带有重悬细菌的试管，融化后立即将其转移到冰上。
在高压均质机/法语压榨机中以1,000-1,500 bar的压力将细菌裂解3个周期（请参见注释2）。
通过在4°C下以30,000 xg离心30分钟来澄清裂解物。
净化PHYB-shRNA表达克隆从通过固定化金属亲色度上清液使用FPLC /甜蜜素含量（IMAC）AKTA 在4℃系统? （见注3）：
a 将Ni-NTA Superflow 色谱柱连接到系统。对于纯化过程，请使用5 ml / min的流速。监测280 nm处的吸光度。

b 将裂解物上样到色谱柱上。每次运行负载约90 ml裂解液（约等于3 L表达培养物）。

c 用100 ml（等于20柱体积（CV））裂解缓冲液洗涤色谱柱。

d 用50 ml（等于10 CV）的洗脱缓冲液洗脱蛋白质。收集馏分（约2 ml）并合并含有青绿色馏分的PhyB-AviTag （图1C）。

可选：使用离心浓缩器以8,000 xg 浓缩蛋白质。一次脱盐操作即可更换多达10 ml PhyB-AviTag 的缓冲液（请参阅下一步）。
使用FPLC / ?kta 系统将PhyB-AviTag的缓冲液交换为蛋白质缓冲液：
a 将HiPrep 26/10脱盐柱连接至系统。对于缓冲液交换，请使用10 ml / min的流速。监测280 nm处的吸光度和电导率。

b 用200 ml蛋白缓冲液平衡色谱柱。

c 在色谱柱上最多上样10 ml IMAC（浓缩）洗脱液。

d 用200 ml蛋白质缓冲液洗涤色谱柱。收集前50 ml的馏分（?4 ml），并合并含有280 nm吸收峰的绿松石色馏分的PhyB-AviTag （不包括电导率峰的馏分）。

使用离心三浓缩浓缩液以8,000 xg 浓缩蛋白质至1-5 mg / ml的浓度。使用BSA作为标准品，通过Bradford分析确定蛋白质浓度（请参见注释5）。
可选：冻结蛋白质（请参阅注释6）：
a 添加甘油至蛋白质终浓度为10％（v / v）。

b 在1.5 ml微量离心管中分装蛋白质溶液，在液氮中骤冷并保存在-80°C。

c 必要时，在水浴或加热块中于37°C解冻蛋白质。蛋白质融化后，将蛋白质以20,000 xg离心5分钟以沉淀沉淀物，并将上清液储存在4°C。

纯化的PhyB-AviTag的分析
PhyB-AviTag的SDS-PAGE分析（有关代表性结果，请参见图2）：
一个混合80μl的蛋白溶液（?0.2毫克/毫升）与20μl5×SDS上样缓冲液并培育在95 ℃进行5分钟，在Thermoshaker / 加热块。

b 通过SDS-PAGE（10-15％（w / v）聚丙烯酰胺凝胶）分离蛋白质样品，并继续进行锌和考马斯染色（步骤C1c ）或检测生物素化的蛋白质（步骤C1d ）。

c 锌和考马斯染色：

孵育的凝胶在一个标准的溴化乙锭的琼脂糖凝胶成像系统锌溶液和发色团藻蓝胆素（PCB）照射时用UV光的形象化锌-诱导的荧光15分钟。
在考马斯溶液中将凝胶孵育1小时。
将凝胶在脱色溶液中孵育过夜。
d 生物素化蛋白的检测：

通过电印迹将蛋白质转移到PVDF膜上。
通过在封闭缓冲液中孵育1小时来封闭膜。
用封闭缓冲液中1：2,000稀释的抗生物素蛋白HRP孵育膜。
用洗涤缓冲液将膜洗涤3次，每次5分钟。
可视化抗生物素蛋白HRP使用ECL试剂和交流，他miluminescence成像系统。

D：\ Reformatting \ 2019-12-30 \ 1902972--1283 Wolfgang Schamel 837223 \ Figs jpg \图2.jpg

图2. PhyB-AviTag 和GFP-PIF6的SDS-PAGE分析。通过SDS-PAGE（15％（v / v）聚丙烯酰胺）分离PhyB-AviTag 纯化过程的不同部分和纯化的GFP-PIF6，并对发色团藻蓝藻素（PCB，Zn 2 +- 染色），蛋白质（Coomassie -染色）和生物素（抗生物素蛋白HRP）。P，大肠杆菌裂解物的不溶部分；S，裂解物的可溶部分；F ，Ni-NTA柱的流通量；W，洗柱；E，洗脱液柱。M，蛋白质大小标记。预期的PhyB-AviTag 质量：74 kDa 。预期的GFP-PIF6质量：40 kDa 。

估计生物素化效率（有关代表性结果，请参见注释7）：
一个转移400μl的链霉亲和琼脂糖浆液（相当于200个微升结算珠）成的一个1.5 ml的微量，在500，通过离心管中并沉淀小珠XG 3分钟。

b 除去上清液，将珠子重悬于1 ml珠子缓冲液中，然后通过离心再次沉淀成珠子，从而洗涤珠子。重复此洗涤步骤3次。

c 除去上清液，然后将磁珠重悬于200 μl磁珠缓冲液中。

d将微珠缓冲液中的PhyB-AviTag 稀释至?80 μg / ml的浓度，然后将200 μl 等分试样装入6 x 1.5 ml的微量离心管中。

e 将每100 μl的磁珠悬浮液添加到3 个装有PhyB-AviTag 的试管中，并将每100 μl的磁珠缓冲液添加到其余3个试管中。

f 每隔15分钟混合试管孵育1小时。

g 离心沉淀颗粒珠，并将200 μl上清液分别转移到新的1.5 ml 微量离心管中。

h 离心沉淀球，并将100微升上清液分别转移到黑色96孔板的孔中。

i 用740 nm的光（强度：100 μmol /（m 2 · s））照射蛋白质3分钟。

j 仅用绿色安全光将板转移至暗处，并将其转移至酶标仪中，并测量6个样品的植物色素荧光（激发：635 nm，发射：680 nm）。估计非生物素化的PhyB-AviTag 的比例，作为珠子和缓冲液样品的荧光商。

PhyB-AviTag光开关的光谱分析（代表性结果请参见图3）：
a 将200 μl 蛋白缓冲液中的PhyB-AviTag （浓度：?1 mg / ml）转移至可透过紫外线的96孔板的孔中。

b 用660或740 nm的光（强度：100 μmol /（m 2 · s））照射蛋白质3分钟。

? 转印板到的只有绿色安全暗光进入酶标仪并测量吸收光谱（250 - 900纳米，步长：1个纳米）。

d 使用相同的样品对其他照明波长重复测量。

D：\ Reformatting \ 2019-12-30 \ 1902972--1283 Wolfgang Schamel 837223 \ Figs jpg \图3.jpg

图3. PhyB-AviTag光开关的光谱分析。PHYB-shRNA表达克隆（1毫克/毫升，从未冷冻的甲。和冷冻和解冻乙。被照射3分钟以要么660或740纳米的光（强度：100μ 摩尔/（米2 · s））在获取吸收光谱之前（左图）。A中的吸收光谱。和B 。将它们各自在对应的740nm光谱的280nm吸光度处归一化为1以补偿轻微的蛋白质浓度变化。通过从相应的740 nm光谱中减去660 nm光谱来计算差分光谱（右图）。显示了主峰和等吸收点的峰波长。冷冻和融化PhyB-AviTag 一次不会影响其吸收光谱。

通过尺寸排阻色谱法（SEC，代表性结果参见图4）分析光依赖性PhyB-AviTag / PIF6相互作用：
一个生成和作为用于描述净化GFP-PIF6 PHYB-shRNA表达克隆具有以下修改：

将质粒pHB111 （编码GFP- PIF6（1-100）-His6 [ Beyer 等，2018b ] ）转化为大肠杆菌BL21（DE3）pLysS，并选择含有100 μg / ml氨苄青霉素和34 μg / ml氯霉素的转化细胞。
诱导后，在收获前于30°C和150 rpm孵育6小时。
b 通过Bradford分析确定PhyB-AviTag 和GFP-PIF6的蛋白质浓度（请参阅步骤B）。

c 将PhyB-AviTag （终浓度：?2 mg / ml）与等摩尔量的GFP-PIF6混合在蛋白质缓冲液中（总体积：800 μl），并将溶液平均分配到2 x 1.5 ml 微量离心管中。有关这两种蛋白质的分子量，请参见图2的图例。

d SEC分析：

用铝箔油保护SEC色谱柱免受光照，并将其连接到配备200 μl样品定量环的FPLC / ?kta 系统。
用30 ml蛋白质缓冲液平衡柱。
将蛋白质溶液从一个微量离心管中装入透明注射器中，并用660 nm或740 nm的光（强度：100 μmol /（m 2 · s））照射蛋白质3分钟。
仅用绿色安全光在黑暗中将蛋白质注入样品定量环，然后开始SEC运行。使用1 ml / min的流速，并监测280 nm，488 nm（GFP）和671 nm（PhyB-AviTag ）的吸光度。一旦蛋白质完全在避光柱上（通常在几毫升之后），就可以再次打开室内灯。
通过使用凝胶过滤标准品进行一次运行来校准色谱柱。

D：\ Reformatting \ 2019-12-30 \ 1902972--1283 Wolfgang Schamel 837223 \ Figs jpg \图4.jpg

图4. 通过尺寸排阻色谱法（SEC）分析光依赖性PhyB-AviTag / PIF6相互作用。A，B. 用660或740 nm的光（强度：100 μmol /（m 2 ）照射200 μl等摩尔的PhyB-AviTag （2.2 mg / ml）和GFP-PIF6（1.2 mg / ml）的混合物3分钟。· s）），并在黑暗中由SEC分析。从未分析冷冻的PhyB-AviTag 和GFP-PIF6 A.以及冷冻和解冻的蛋白质B.。冻结和解冻PhyB-AviTag 和GFP-PIF6一次并不影响它们的光依赖性相互作用。C.作为对照，单独分析200 μl从未冷冻的PhyB-AviTag （2.2 mg / ml）。的吸光度，在280nm处（总蛋白），488纳米（最大吸收GFP-PIF6的）监测，并在671纳米（等吸光点PHYB-shRNA表达克隆）。用凝胶过滤标准品对柱的校准用虚线表示。

笔记

保护PhyB-AviTag （从诱导大肠杆菌中的蛋白质产生开始）免受强光照射，例如直射阳光。如有可能，请在可能的情况下（例如，在孵育期间）遮蔽实验室，在昏暗的室内光线下工作，并保护PhyB-AviTag 免受光照（例如，用铝箔覆盖）。在绿色安全光（最小的吸收工作PHYB-shRNA表达克隆）时，只需要photostate 的PHYB-shRNA表达克隆不应改变。日常房间光开关PHYB-shRNA表达克隆通常类似660纳米的光在PFR 状态，其中它与PIF6相互作用。
每次通过高压均质器/法国压榨机的样品加热样品时，在下一次通过之前，将裂解物在冰上冷却。作为高压均质机/法国压榨机的替代品，细菌也可以通过超声处理来裂解。
代替使用FPLC / ?kta 系统进行IMAC和缓冲液交换，重力流色谱柱s可以用于小体积/小体积。
还原剂TCEP在磷酸盐缓冲液中不是特别稳定。因此，在使用前，始终将原液中的TCEP直接添加到PBS中。尽管TCEP在HEPES缓冲区中更稳定，但仍然建议始终在使用前直接添加TCEP。
使用所述的纯化方案，PhyB-AviTag 的典型产量是每1 L表达培养物约4 mg纯化蛋白。如果需要大量的PhyB-AviTag ，则每10 L高细胞密度发酵运行可产生多克级的蛋白质（H?rner 等人，2019b）。
PhyB-AviTag 和GFP-PIF6可以在黑暗中于4 °C 储存至少两周。在黑暗中于-80°C下，蛋白质可以存储数年。冻存10％（v / v）甘油的蛋白质，避免重复冻融循环。将PhyB-AviTag 和GFP-PIF6在-80°C下保存过夜不会影响它们的光依赖性相互作用以及PhyB-AviTag 的光谱（图s 3 和4）。
在步骤C 2 部分中描述的生物素化效率的估计表明，PhyB-AviTag的生物素化率为?80 ％。如果需要更高的生物素化作用，请考虑另外编码大肠杆菌生物素连接酶（BirA ）的质粒的共转化。确保使用具有兼容复制起点的质粒。所述PHYB-shRNA表达克隆质粒pMH1105是基于商业矢量pCDFDuet （Novagen公司与CloDF13衍生的复制子CDF（CDF）ORI ）（霍纳等人，2019b）。

菜谱

注意：如果没有另作说明，在室温下储存所有的解决方案。对于所有溶液，请使用通过反渗透获得的超纯水。

LB培养基
a 称取25 g L B并加满1 L水

b 高压釜

50 mg / ml 链霉素原液
一个称重2.5克硫酸链霉素和填充到50ml水

b 通过0.22 μm的PES针头过滤器过滤，并等分保存在-20°C下

1 M IPTG储备溶液
一个称重11.9克IPTG 和填充到50ml水

b 通过0.22 μm的PES过滤器过滤，并等分保存在-20°C下

5 mM生物素储备溶液
将PBS加热至?50°C

b将84毫克生物素溶于70毫升加热的PBS中

c 通过0.22 μm的PES过滤器过滤。在进行细菌培养之前，始终准备新鲜并冷却至< 37°C

100 mM TCEP储备溶液，pH 8.0
a 在pH 9.0的水中新鲜制备0.5 M NaHCO 3 （用NaOH调节）

b 称量2.87 g TCEP盐酸盐并用0.5 M NaHCO 3 溶液填充至100 ml

c 用NaOH调节pH到8.0

d 一次性储存在-20°C下

裂解缓冲液，pH 8.0（用NaOH调节）
100毫米HEPES

500毫米氯化钠

20 mM咪唑

5％（v / v）甘油

0.5mM的TCEP [ 从TCEP储备溶液添加（见配方5）可怕使用前ctly（见注4）]

储存在4°C（添加TCEP之前）

洗脱缓冲液，pH 8.0（用HCl调节）
50毫米HEPES

500毫米氯化钠

500 mM咪唑

5％（v / v）甘油

0.5mM的TCEP [ 附加从TCEP原液（见配方5）直接ù之前SE（见注4）]

储存在4°C（添加TCEP之前）

蛋白质缓冲液
PBS

0.5 mM TCEP [ 直接在使用前从TCEP储备溶液中添加（请参见配方5）（请参见注释4）]

1 mg / ml BSA蛋白标准品
一个称量500毫克BSA和填充至500ml加水

b 一次性存放在-20°C下

5个SDS加载缓冲区
0.31 M Tris-HCl（来自1 M Tris-HCl储备溶液，pH 6.8）

50％（v / v）甘油

10％（w / v）十二烷基硫酸钠

12.5％（v / v）2-巯基乙醇

0.05％（w / v）溴酚蓝钠盐

将i 次使用的等分试样储存在-20°C

锌溶液
1 mM醋酸锌二水合物

考马斯解决方案
10％（v / v）乙酸

25％（v / v）2-丙醇

0.1％（w / v）考马斯亮蓝R 250

脱色溶液
10％（v / v）乙酸

20％（v / v）乙醇

阻塞缓冲区
含3％（w / v）BSA的PBS

洗涤缓冲液
含0.05％（v / v）吐温的PBS 20

磁珠缓冲
含1％（w / v）BSA的PBS

100 mg / ml氨苄西林原液
一个称重5克氨苄青霉素钠盐和填充到50ml水

b 通过0.22 μm的PES过滤器过滤，并等分保存在-20°C下

34 mg / ml氯霉素储备溶液
a 称重1.7克氯霉素，并用乙醇填充至50毫升

b分装在-20°C下

致谢

我们要感谢洛伦茨Gerbeth ，胡安妮塔·罗德里格斯和卡佳鲁格质粒pMH1105，凡妮莎施瓦布的克隆生产的pHyb启动，转录水平分析和GFP-PIF6，和J.施密特，D. Sch?chtele 和J. 斯默（技术弗莱堡大学生物学院的实验室），用于设计和建造量身定制的照明设备。这项工作由德国研究基金会（DFG）根据卓越计划（BIOSS-EXC-294）和卓越战略（CIBSS-EXC-2189-项目ID 390939984）资助。

利益争夺

作者没有宣布任何利益冲突。

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