用料

行为任务
套料

棉方（5 厘米x 5厘米，任何商业品牌）
挖洞

手工制作的塑料黑色试管，长20 厘米，直径7.5厘米（试管的开口端从地面抬起2.5厘米（使用两个螺钉），以防止试管内含物意外移位。触及地板，如图˚F igure 1）

图1. 自制塑料黑管用作洞穴

电生理学
用于灌注系统的塑料管（软管Master Flex，目录号：065009-16; Tygon E-3603和Tygon管，Cole Parmer，目录号：06460-34 ）
记录室和平台（Homemade，请参见图8）
毛细管玻璃管（硼硅酸钙标准壁，长丝，长度= 10 cm，Warner Instruments，目录号：G150F-4 ）
带监视器的摄像机（DAGE-MTI，目录号：CCD-100）
双刃剃须刀片（任何商业品牌）

试剂种类

Na 2 ATP（Sigma-Aldrich，目录号：34369078）
LiGTP（Sigma-Aldrich，目录号：85737048）
葡萄糖酸钾（Sigma-Aldrich，目录号：299274）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：67425）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：7365459）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S9378）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P4504）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9625）
氯化镁（MgCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S8875）
氯化钙（CaCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：C3881）
D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D8270）
氰基丙烯酸酯（任何商业品牌）
戊巴比妥
膜片钳记录的细胞内解决方案（请参阅食谱）
Ë xternal解决方案（人工脑脊液（学联））（见食谱）
内部解决方案（请参阅食谱）

设备

行为任务
套料

带木屑床上用品的单个柜子（26 厘米x 48 厘米x 20厘米）
挖洞

独立笼（26 厘米x 48 厘米x 20厘米），带木屑寝具

电生理学
蠕动泵（DYNAMAX，型号：Rp-1）
在线溶液加热器（自动温度控制，Warner Instruments，型号：TC-324C）
温度控制器（哈佛仪器，型号：TC-202A）
放大器（Axon仪器，型号：Axo-clamp 2B放大器）
连接器块（National Instruments，型号：BNC-2110）
数字化仪（国家仪器，Digidata BNC-2110）
显微操纵器（萨特仪器公司，型号：MP-225）
空气表序列号＃119564，TMC和法拉第笼（H omemade）
显微镜（NIKON，型号：E600-FN ）
火焰状/棕色微量移液器（萨特仪器公司，型号：P-97 ）
弧菌（Thermo Scientific，型号：Microm HM-650V）

软件

控制放大器和数字转换器的任何可用软件，例如pCLAMP TM 软件。在我们的实验中，我们使用了由LabView，National Instruments 开发的软件

程序

行为任务（两种方案都在同一个行为室中执行，所有动物都执行两项任务）
套料

在黑暗阶段（12小时光照/ 12小时黑暗周期）之前一小时的凌晨08:00开始嵌套协议。将动物放入只装有木片被褥（约2厘米）的独立笼子中。60分钟后，在床上用品上放置一个棉质正方形（5 厘米x 5厘米）（图2，请参见笼子的角）。动物天生就利用棉花来筑巢。第二天早上（08:00 am），执行巢的评估。

图2. 将动物放在带有木片寝具的单独笼子中，然后在60分钟后放置一个棉方格（比例尺= 5厘米）

挖洞

将每种动物放入一个单独的小容器（26 厘米x 48 厘米x 20厘米）中，并用充满200克食物颗粒的挖洞管（这些颗粒是通常作为饮食提供的标准小鼠食物颗粒）。这些动物可以取水，但除了管中的动物外，其他都不能取食。
在黑暗阶段前三个小时的上午06:00开始测试。记录测试的前2小时后排出的食物颗粒的数量。
然后挖洞2小时的颗粒重量通过从最初的200克中减去来定量。挖洞管中重新装满小球，然后继续测试。如图3所示，对12h后的沉淀颗粒重量进行最终定量。

图3. 黑色塑料管，颗粒在0、8 am和9 pm的时间移位

电生理学
膜片钳（应获得道德认证）

用戊巴比妥（63 mg / k g，替代品氯胺酮和xylazin）深度麻醉动物，以每次融合（30 ml）的经调制的aCSF 融合碳酸钠（95％O 2 和5％CO 2 ）进行血管内麻醉。输液结束时，将动物断头并在冰冷的aCSF中取出大脑。要获得矢状切面切片（图s 4和5），请去除小脑和脑干，分离脑半球并以30 °角的内侧部分将它们粘在一起（图s 4和5）。第一，胶脑到一张滤纸，然后，胶滤纸（用脑）的琼脂块（图小号4和5，琼脂尺寸倾向于根据脑大小发生变化）。在整个过程中，应将脑组织浸入正常的aCSF中，并持续注入碳素。

图4. 要获得矢状切面切片（请参见矢状切面，红色虚线），分离大脑半球，并以其中间部分以30 ° 角将其胶合。首先，将大脑粘在一块滤纸上，然后将滤纸（与大脑）粘在琼脂块上（参见矢状切面顺序）。琼脂块用胶水粘在适配器托盘上（R =鼻侧，D =背侧，C =尾侧，V =腹侧）。

将脑半球连接到琼脂块上后，将组织放入浸没在冰冷的aCSF中并浸入碳源的适配器托盘中。要获得海马结构的矢状旁切切片（厚度为350-400 µm），请将托盘连接到一个玻璃纤维切片机上。切成片（背腹侧）和腹侧含海马的切片，每个半球切成4-6片（图5）。立即将它们转移到巢式烧杯中，并在室温下与冒泡的aCSF 一起孵育1小时（图6）。

图5. 矢状切面序列。用剃须刀分开大脑半球（A），将大脑粘在一块滤纸上（B），然后将滤纸（用大脑）粘在琼脂块上（C到E）。最后，将板转移到振动刀的切片室中，并降低刀片支架（F）。释放切片后，将其转移到带有恢复aCSF的巢式烧杯中。

图6.将矢状切面片在室温下在充满了碳原的aCSF中孵育至少一小时，以进行恢复。巢式烧杯可以根据Papouin 等人的方法制备。，2018。

恢复后，将切片转移到位于配有光学组件的显微镜中的记录室中，以执行微分干涉对比（DIC）（Eclipse E600FN；尼康，纽约州梅尔维尔，图7）。

图7.电生理全细胞膜片钳设置和显微镜

在记录室（图小号8和9），将切片在井中，这可能包含多达至3ml循环aCSF中与碳合鼓泡，在32±0.5的温度℃。总共30 ml的aCSF以17-20 ml / min的流速连续循环通过记录室（图8和9）。

图8. 切片架和记录室。切片夹由弯曲且扁平的不锈钢丝制成，并与水平尼龙纤维（相距约3 mm）交叉。记录室由丙烯酸制成（测量长度以厘米为单位，厘米）。

图9. 将包含海马体的脑片安装并固定在记录室上。将包含海马结构的脑切片放置在记录室上，并用固定器固定，使记录区域自由放置电极，但在高速（17-20 ml / min）灌注时固定以保持稳定的记录。

用玻璃移液器（Warner Instruments，G150F-4； Handem，CT）在P-97拔轮器（Sutter Instruments，Novato，CA）上进行录音。电极电阻为2-5MΩ。用内部溶液填充移液器。
视觉膜片钳技术是当前钳位模式下的全细胞配置（图10）。生物信号通过Axoclamp 2B放大器（Axon Instruments，Foster City，CA）进行测量。始终将记录重点放在位于CA1锥体区域的神经元上（CA1的神经元异质性最少，并且锥体细胞排列在定义明确的层中，请参见Mondragón-Rodríguez 等人，2018a）。一旦全细胞结构实现，超极化和去极化电流脉冲被施加到评估所记录的神经元的固有性质（图小号10和11）。在当前的注射方案期间，神经元保持原始静止电位（在神经元之间变化）。然而，当细胞具有-70 mV的膜电位时重复相同的步骤，这主要是通过施加超极化电流来实现的（对于全细胞膜片钳视频，请参见Sunstrum and Inoue ，2019）。

图10. 通过差分干涉对比（DIC）显微镜观察到的CA1锥体细胞层的图像。全细胞配置中的视觉膜片钳技术是通过位于细胞体上的吸液管电极（用虚线突出显示）实现的（分别在左侧和右侧放大10倍和40 倍）。

电生理变量

获得全细胞构型后立即测量静息膜电位（跨膜电压，Vm）。
触发频率的度量是一秒钟去极化电流的超阈值脉冲期间神经元产生的动作电位（AP）的数量（图11）。为了比较所有神经元，将引起至少一个AP（流变碱）所需的最小去极化电流注入乘以2，以量化由电流注入引起的AP的频率。
通过除以T2 / T1来计算火警频率适应性，其中T2是火车的最后两个AP之间的时间，T1是同一火车的前两个AP之间经过的时间。大于1的值表示适应AP触发，而接近或小于1的值表示无适应AP触发或加速。
使用欧姆定律通过除以注入电流感应的电压变化来测量膜电阻。针对五个超极化电流脉冲执行此测量。

图11. 记录的全细胞神经元诱发放电模式的特征。注入一秒钟的30 pA去极化电流脉冲（下部迹线）会感应出一系列动作电位（上部迹线），这些电位表现出适应现象（在稳定刺激期间降低发射频率）。

亚阈值振荡

为了表征亚阈值振荡，请将膜电位提高到刚好低于阈值的水平以触发AP（尽管会产生零星的电位）。将膜电位保持在可以观察到最大幅度亚阈值振荡的值，同时触发尽可能少的AP。在表示这样的电压˚F igure 12。

图12.将膜电位提高到刚好触发动作电位的水平以下（参见箭头）

数据分析

行为任务
套料

拍摄图像并评估巢的构造。根据Deacon（2012）提出的类别，定义了三个类别，以下为示例：

如果巢穴没有明显制成，则分配类别1（图13A，> 90％完整的棉花）。当将嵌套部分撕裂（将50％至90％的棉花切碎）时，将其分配为2类，无论是否带有可识别的嵌套（图13B）。当形成（接近）完美的火山口形巢壁时，将其划分为类别3，该巢壁的壁高高于小鼠的体重，从而使动物在巢中卷曲时，其周长超过50％（图13C，> 90％切细）棉）。总而言之，量化将显示从1到3的嵌套等级，具体取决于类别（图13）。

注意：在盲实验中，所有动物的基因型都将保留（掩盖），直到实验完成。

图13. 未明显制作出嵌套（A，请参见棉方形），嵌套被部分撕裂（B，请参见棉方形）和接近完美的嵌套（C，请参见棉方形）

挖洞

量化移位粒料的重量（g）AFTE - [R 2小时一次，然后，12小时后（参见图3）。

电生理学
膜片钳

以9 KHz的采样频率进行记录。使用增益为0.01 MU的HS-2头载物台（Molecular Devices）。通过耦合到BNC-2110连接器（National Instruments）的模拟数字卡对信号进行采样，以将生物（模拟）信号转换为数字信号。使用采集软件仪器（LabView环境，National Instruments，Austin，TX）在线监视记录的信号，并将其存储在计算机中以供以后分析。

离线分析录音。值得一提的是，我们总是每只动物记录一个切片或每片神经元。对于膜电势的经典功率谱分析，使用快速傅立叶变换算法和Clampfit中的汉明窗对五秒钟的片段进行分析（分子设备，图14）。将从1到60 Hz的功率谱进行积分并归一化以进行控制，这意味着对控制功率谱进行了积分，并且该值可任意设置为100％。

图14. 对于膜电位的功率谱分析，使用快速傅里叶变换算法和Clampfit中的汉明窗来分析片段

预期成绩

对于预期的结果，请参见Orta-Salazar 等。，2013年和Mondragón-Rodríguez 等人。，2018a。

菜谱

膜片钳记录的细胞内解决方案
140 mM葡萄糖酸钾

10毫米EGTA

2毫米氯化镁2

10毫米HEPES

2 mM Na 2 ATP

2 mM LiGTP

p ħ7.4

È xternal溶液（人工脑脊髓液（ACSF））
119毫米氯化钠

3毫米氯化钾

1.5 mM氯化钙2

1毫米氯化镁2

25毫米碳酸氢钠3

30 mM D-葡萄糖

p ħ7.4

内部解决方案
140 mM 葡萄糖酸钾

1 毫米CaCl 2

10 毫米EGTA

2 毫米氯化镁2

4 mM Na 2 ATP

4 mM LiGTP

10 毫米HEPES

pH值7.4

致谢

感谢Jessica Gonzalez Norris的校对和IgnacioMartínezGarcía的技术支持。这项研究是支持通过;提高妇女地位总署德Asuntos德尔个人Académico（批准IN202018和DGAPA IN204519 和）由国家科学技术委员会（补助金; 269021和A1-S-7540）。美国国立卫生研究院和塞姆斯基金会（Semmes Foundation）向美国少数民族健康和健康差异国家研究院授予G12MD007591。S MR 被墨西哥CONACYT授予Cátedra职位。该协议改编自Peña 等人。（2010年）和迪肯等人。（2012）。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争的经济利益。

伦理

实验程序已获得墨西哥国立自治大学神经生物学研究所生物伦理委员会的批准。批准ID-091 / 2015-20 18 。

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