材料和试剂

100 mm细胞培养皿（Falcon，目录号：353003）
60 mm细胞培养皿（Falcon，目录号：353002）
细胞培养6 孔板用于插入（Falcon，目录号：353502）
细胞培养插件（6孔，8μm ，Falcon ，目录号353093）
怀孕十三天的母鼠
胎牛血清（FBS，Gibco，目录号：10437028），在4 °C下可短期保存，在-20 °C下可长期保存，无需热灭活
siRNA：Nkx2-3（Dharmacon ，ON-TARGET Plus L-057189-01-0002），在-20 °C下保存; 控制（Dharmacon ，ON-TARGET Plus非目标控制池D-001810-05），在-20 °C下存储
70％乙醇
不含Ca 2+ 或Mg 2+的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（D-PBS（-），Wako，目录号：04529795 ），在室温下保存
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）/ F-12（Gibco，目录号：11330032），在4 °C下存储
L-谷氨酰胺（200 mM ，100x）（Gibco，目录号：25030081），-20 °C 储存
青霉素- 链霉素（L iquid ，Gibco，目录号：15140122），在-20 °C 储存
L-抗坏血酸（S Sigma-Aldrich ，目录号：A4544-25G），在室温下保存
含Plus试剂的Lipofectamine 3000（Life Technologies，目录号：L3000-015），在4 °C下储存
Opti-MEM（Gibco，目录号：31985062），在4 °C下存储
工作中中（请参阅食谱）
器官培养基（见食谱）
siRNA转染培养基（请参阅食谱）

设备

手术器械：镊子，剪刀，细剪刀，精密镊子（Dumont＃5镊子）（图1A）
紧凑型Greenough立体显微镜（蔡司，型号：Semi 305 EDU）（图1B）
鼠标解剖表
CO 2 培养箱（ASTEC，型号：SCA-80DS）
研究型倒置显微镜（奥林巴斯，型号：IX71）

图1.用于胚胎下颌骨分离和磨牙胚芽解剖的仪器。A.手术器械：镊子b。剪刀c。细剪刀d。精密镊子。B.紧凑型Greenough体视显微镜。

程序

制备
准备两个1 00 m m细胞培养皿，分别向其中添加约20 ml的D-PBS，以及两个60 mm细胞培养皿，并向每个中添加约6 ml的DP BS。然后，将四道菜放在冰上。
准备工作培养基（按照食谱1，置于冰上），并加入足以容纳20个胚胎的50 ml工作培养基。
准备两个60 mm细胞培养皿，加入约6 ml工作培养基，然后放在冰上。
准备器官培养基（遵循第2条配方，保持在4 °C ），每孔使用1.8 ml器官培养基。

胚胎下颌骨隔离（图2）

图2.分离下颌骨的程序

根据当地指南对怀孕13天的雌性小鼠实施安乐死。将鼠标放回解剖台上。
用70％的乙醇浸泡小鼠腹部皮毛。
用镊子（图1A-a）和剪刀（图1A-b ）剪皮肤，然后拉开皮肤露出腹壁。
用镊子（图1A-a）和细剪刀（图1A-c）切开腹壁。
使用镊子（图1A-A）来抬起子宫角和削减他们客场与精细剪刀（图1A-C）。放入装有冰冷D-PBS的100毫米培养皿中（图2）。
用清洁的剪刀在D-PBS皿中分离子宫。
通过用精密镊子在子宫上轻轻切片来分离每个胚胎（图1A-d）。
将胚胎转移到新的D-PBS皿中。
在下方用精密镊子将胚胎的头部和身体部位分开立体显微镜（图1B）置于60 mm D-PBS皿中。
从嘴角到耳朵的线切断下颌骨（图2）。接下来，将分离的下颌骨移到冰上的新的60毫米D-PBS皿中（视频1）。

视频1.下颌分离

下颌骨磨牙胚芽解剖和播种
在立体显微镜下将下颌骨转移到装有工作介质的60 mm皿中。
下颌臼齿可以在舌头一侧看到（图3A）。用精密镊子将包括周围间充质在内的牙胚与下颌骨小心地分开，并将它们放入盛有工作介质的新的60毫米皿中，置于冰上（图3B）。
向6孔板的每个孔中添加1.8 ml 器官培养基，然后将细胞培养插入孔中（图s 3C -3 D）。
将牙胚放在上皮朝下，间充质朝上的插入物上，以便在显微镜下容易看到上皮的一面。当牙胚以相反的方式放置时，很难观察到牙齿的形状。上皮看起来透明和间质中含有毛细血管可以看出。大约9种牙胚可以播种到1孔中（图3D）。
在5％CO 2 的湿润气氛下于37°C培养牙齿细菌。
每隔2或3天在显微镜下拍照。代表性的发育中的牙齿，唾液腺和头发如图4所示。
器官培养基应每3天更换一次。

图3.下颌磨牙胚芽剥离的过程。A.胚胎下颌骨。B.牙菌。C.器官培养板。D.盘子中的细菌。

图4.使用离体器官培养物发展上皮-间质组织

siRNA介导的敲除方法
使用Lipofectamine 3000试剂，根据制造商的规程（遵循食谱3），用500 nM siRNA 制备siRNA转染混合物。
下降8 微升直接在每个牙胚的顶部的siRNA转染混合物。在37 °C的5％CO 2的潮湿环境中培养牙齿胚芽2至7天。siRNA必须每2或3天添加一次。
为了观察，每隔2或3天在显微镜下拍照（图5）。

图5.通过添加Nkx2-3 siRNA的形态变化

数据分析

使用本协议，可以从一只E13胎儿ICR小鼠中解剖大约24个牙胚。在相同的培养基和培养条件下，从1天到最多2周可以观察到牙齿，唾液腺和头发的发育（图4）。可以使用ImageJ软件包（Wayne Rasband ，美国国立卫生研究院）来分析器官的大小和形状。mRNA和蛋白质表达也可以通过使用传统的RNA和蛋白质分离方法来分析。

笔记

安乐死应根据当地指南进行。
两次使用之间，应使用70％的乙醇擦拭镊子和剪刀。
为避免细菌污染，从腹部取出时，请勿让毛皮与子宫接触。
将下颌骨和上颌骨通过眼耳之间的线分开，以免损坏下颌牙胚。
解剖期间经常更换清洁的D-PBS或工作介质。
牙胚播种时，请注意不要用镊子尖端接触刀片的膜片。
确保在长期培养期间不要将牙胚浸入器官培养基中。
孔径为0.4- μm的细胞培养插入物也可以在该系统中使用。

菜谱

工作MEDI UM
DMEM / F-12补充：

1％青霉素链霉素

机关文化中介UM
DMEM / F-12补充：

20％胎牛血清

180 微克/ ml的抗坏血酸

2毫米L-谷氨酰胺

1％青霉素链霉素

siRNA转染培养基（用于10个牙胚）
的Opti -MEM，50 微升+ 的Lipofectamine 3000，6 微升
Opti-MEM，50ul + siRNA，50 pmol
混合在一起并在室温下孵育混合物5 分钟

在每个牙胚上涂抹8μl 混合物

致谢

这项工作得到了科学研究补助金的部分支持（KY为18H03012、17K19765、15H05688； KM为16H07065，SF 为17H01606）。该方案最初发表在J Biol Chem （Han et al.2018 ）中。

利益争夺

作者没有要宣布的与财务或研究相关的利益冲突。

伦理

所有动物实验均获得了九州大学动物实验中心伦理委员会的批准（协议编号A26-208-0 ，2018 年4月1 日- 2020年第31比赛）。

参考文献

Bringas ，P.，Jr.，Nakamura，M.，Nakamura，E.，Evans，J。和Slavkin ，HC（1987）。使用化学成分确定的培养基在体外发育过程中釉质形成的超微结构分析。扫描Microsc 1（3）：1103-1108。
S.Fukumoto，Miner，JH，Ida，H.，Fukumoto，E.，Yuasa，K.，Miyazaki，H.，Hoffman，MP和Yamada，Y.（2006年）。层粘连蛋白α5是牙齿上皮细胞的生长和极性以及牙芽和形状的发育所必需的。生物化学杂志281（8）：5008-5016。
Han，X.，K. Yoshizaki，K.，Miyazaki，K.，Arai，C.，Funada ，K.，Yuta，T.，Tian，T.，Chiba，Y.，Saito，K.，Iwamoto，T.， Yamada，A.，I. Takahashi和S.Fukumoto（2018）。转录因子NKX2-3介导牙釉质结中p21表达和ectodysplasin-A信号传导，从而促进牙齿发育中的牙尖形成。生物化学杂志293（38）：14572-14584。
Heywood，BR和Appleton，J.（1984）。大鼠切牙成牙本质细胞在器官培养中的超微结构。口腔生物学杂志29（4）：327-329。
Shih，HP和Sander，M.（2014年）。胰腺离体发育：在带有纤连蛋白涂层的玻璃微孔的可渗透培养插入物中培养胚胎胰腺外植体，或将其植入三维Matrigel TM中。方法分子生物学1210：229-237。
孙G.，刘W.，范Z.，张D.，韩Y.，徐L.，齐J.，张S.，高，BT，白X.，李，J.，Chai，R.和Wang，H.（2016）。具有基质胶和神经营养因子的三维培养系统可在体外保留螺旋神经节神经元的结构和功能。Neural Plast 2016：4280407。
Tabata，MJ，Kim，K.，Liu，JG，Yamashita，K.，Matsumura，T.，Kato，J.，Iwamoto，M.，Wakisaka ，S.，Matsumoto，K.，Nakamura，T.，Kumegawa ， M.和Kurisu ，K。（1996）。肝细胞生长因子参与鼠磨牙中牙胚的形态发生。发展122（4）：1243-1251。
Yamada，M.，Bringas ，P.，Jr.，Grodin ，M.，MacDougall，M.，Cummings，E.，Grimmett ，J.，Weliky ，B。和Slavkin ，HC（1980）。化学定义的胚胎小鼠牙齿器官的器官培养：形态发生，牙本质发生和牙釉质发生。J Biol Buccale 8（2）：127-139。
Yamada，A.，Futagi ，M.，Fukumoto，E.，Saito，K.，Yoshizaki，K.，Ishikawa，M.，Arakaki，M.，Hino，R.，Sugawara，Y.，Ishikawa，M.，Naruse ，M.，K.Miyazaki，T.Nakamura，T.和Fukumoto，S.（2016年）。连接蛋白43是唾液腺分支形态发生和FGF10诱导的ERK1 / 2磷酸化所必需的。生物化学杂志291（2）：904-912。
山本，S 。，福本，E 。，吉崎，ķ 。，岩本，Ť 。，山田，A 。，田中（K.），铃木（H.），相泽（A。），S。，新垣（M.），汤浅（K.），冈田（Oka），K 。，柴，ÿ 。，野中，K 。和Fukumoto，S. （2008）。血小板衍生的生长因子受体通过成纤维细胞生长因子表达调节唾液腺形态发生。生物化学杂志283（34）：23139-23149。