材料和试剂

注意：请确保所有试剂和材料均不含RNase。我们通常使用公司认证的无RNase的解决方案和材料进行RIP分析。

微安® 光384孔反应板（赛默飞世尔科技，Applied Biosystems公司TM ，目录号：430984 9 ）
安全锁1.5毫升Eppendorf管（Eppend ORF ，货号：0030120086 ）
ThermoGrid TM 刚性试纸0.2 ml PCR管（Denville Scientific，目录号：C18064）
1.5毫升一次性比色皿（Stockwell Scientific，目录号：2410）
蛋白A-琼脂糖® 预溶胀（PAS）珠（GE Healthcare公司，目录号：17-1279-02）
适当的一抗可识别感兴趣的特定RBP。这里我们以抗DRB P76 / ILF3（NF90）抗体为例（Millipore，目录号：ABF1070）
一种适合物种的同型对照。对于NF90 RIP，我们使用正常的小鼠IgG对照（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2025）
DNase I（无RNA酶）（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM2222）
RiboLock RNase抑制剂（40 U /μl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：EO0381）
随机引物（100μM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：S O 142 ）
dNTP混合液（每种10 mM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0192）
Maxima TM 逆转录酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：EP0741）和5x RT缓冲液（随Maxima逆转录酶提供）
蛋白酶K溶液（20 mg / ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM2546）
无核酸酶的水（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9930）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：100100-15）
停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（100x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：78442）
TRIzol TM （Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9738）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：43815）
超纯的1M的Tris-HCl（pH值7.5 ）（赛默飞世尔科技，产品目录号：15567 - 027 ）
1 M KCl溶液（Sigma-Aldrich，目录号：60142）
1 M MgCl 2 溶液（Sigma-Aldrich，目录号：M1028）
0.5 M EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号AM9261）
5 M NaCl溶液（Sigma-Aldrich，目录号：71386）
20％SDS溶液（Sigma-Aldrich，目录号：05030）
GlycoBlue TM （15毫克/毫升）（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9515）
KAPA SYBR ® FAST ABI棱镜2倍的qPCR主混合物（卡帕Biosystems公司，目录号：KK4605），或的SYBR Green来自其他供应商
的Nonidet TM P-40（IGEPAL ® CA-630，Sigma，目录号：I8896）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）
异丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：I9516）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：51976）
伯乐（Bio-Rad）蛋白测定染料试剂浓缩液（用于布拉德福德（Bradford）测定）（伯乐（Bio-Rad）公司，目录号：5000006）
多核糖体提取缓冲液（PEB）（请参阅食谱）
NT2缓冲区（请参阅食谱）

设备

注意：其他类似设备也可用于此协议。

PCR条形管转子，微型离心机C1201（Denville Scientific，目录号：C1201-S [1000806]）
Ñ anoDrop TM 一个分光光度计（Thermo Fisher Scientific公司，目录号：ND-ONE-W）
Eppendorf恒温® R（的Eppendorf，目录号：022670581）
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5430R）
SmartSpec TM Plus （Bio-Rad实验室，目录号：1702525）或其他波长为595 nm的分光光度计
左轮手枪/旋转器（Thermo Fisher Scientific，目录号：88881001）
Veriti TM 96孔热循环仪（Thermo Fisher Scientific，目录号4375786）
384孔QuantStudio TM 5实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，目录号：A28140）
细胞培养罩和用于细胞培养的CO 2 培养箱

程序

注意：请务必优化您的条件。需要进行经验测试以优化RIP条件并获得最佳信噪比结果，这意味着与IgG IP对照相比，目标RNA的特异性RBP IP含量更高，而非特异性，非目标RNA均以IgG IP对照存在。 IgG和RBP IP样品。

第一天

蛋白A琼脂糖（PAS）珠的抗体涂层
每个反应使用60μlPAS珠子。
将试管颠倒几次，用1 ml的冰冷的NT2洗涤小珠1次，在2000 xg ，4°C下离心2分钟，然后将小珠重悬于60μlNT2缓冲液中。
将5μg目标抗体（在这种情况下为抗NF90）或对照IgG（在这种情况下为正常小鼠IgG）添加到60μlPAS珠子中。
笔记：

确保将目标抗体与物种兼容的对照IgG匹配。同种型对照用于确定由于免疫球蛋白同种型而不是特异性RBP而被免疫沉淀的特异性与非特异性信号（RNA）。
IP所需的抗体量取决于抗体质量和分析的RBP。应事先通过使用2、5、10和20μgAb对该方案进行IP来测试最佳抗体量。
加入200μlNT2缓冲液。
在4°C的旋转器上绑定过夜。

培养细胞的制备
根据需要准备细胞。对于RIP前一天的THP-1，应将细胞以0.5 x 10 6 / ml 的浓度铺板。对于两个IP反应（IgG对照IP和RBP IP），总共需要1 x 10 7个细胞。

注意：F 或贴壁细胞，一个10厘米的培养皿通常足以容纳两个IP 。

第二天

抗体包被的PAS珠的制备
加入1ml冰冷的NT2并且通过几次，离心颠倒试管洗珠为2分钟，在2000 ×g下，4℃，并重复一次。
最后一次旋转后，除去过量的NT2缓冲液，然后将磁珠重悬于50μlNT2缓冲液中。PAS / Ab珠子现在可以使用了，放在冰上。

从培养细胞中制备核糖核蛋白（RNP）裂解物
收集用于两个IP反应的1 x 10 7个细胞所需的THP-1细胞体积，并在25°C下于1000 xg 离心5分钟。
用PBS洗涤并在25°C下以1,000 xg 再次离心5分钟。
注意：最好立即使用新鲜的裂解液。

轻轻甩动试管，松开最终的细胞沉淀，然后加入1 ml冰冷的PEB缓冲液，其中补充了RNase抑制剂和蛋白酶抑制剂。
移液几次（不要涡旋）混合，放在冰上10分钟。
自旋为在10,000 15分钟XG ，4℃。将上清液（RNP裂解物）转移到新鲜的微量离心管中。
（可选步骤）预清除（对于RIP紧随其后的是RT-PCR，不是必需的）。
在10°g IgG1抗体对照中于4°C旋转30分钟，以上清液上清。
加入50μlPAS，在4°C旋转孵育30分钟。
在4°C 下以2,000 xg 旋转2分钟。将上清液保存在新管中。这是您预先清除的裂解液。
通过Bradford分析测量裂解液的蛋白质浓度。使用这些细胞时的典型的浓度是〜5微克/微升。每个RIP需要500-1,000μg裂解液。

RNP的免疫沉淀
将预涂的PAS / Ab（约50μl）分装到微量离心管中。
为每个反应使用以下添加剂制备预混料：
300μlNT2缓冲液

10μl0.1 M DTT（请勿将DTT直接添加到沉淀物中，因为这会减少抗体，并且IP无效）

10微升RiboLock

33μl0.5 M EDTA

加入500μgRNP裂解物。
注意：IP所需的裂解物量取决于RBP，细胞类型和所用抗体。裂解物的最佳量应该预先通过与250，500，和1测试IP来确定，000微克的材料制成。

加入NT 2缓冲液至1 ml。
孵育用于在4℃下用旋转1-2小时。
在2,000 xg （2 m in，4 °C）下旋转。丢弃上清液。
用1 ml冰冷的NT2缓冲液每次洗涤5次* 。洗涤之间旋转：2,000 xg ，2分钟，4°C。
注意：（可选）在最后一次洗涤过程中取100μl珠，以通过W 酯印迹分析验证IP （更多详细信息，请参见下面的注释）。

最后一次洗涤后，轻轻加入100μl的NT2缓冲液，其中含有5μlDNase I（2 U /μl）。在37°C下保持10分钟。
注：我t是关键不是严厉重悬珠- 只需在37弹出移液器和地点的内容℃的微妙纷飞。重要的是不要在这一步摇动！

加入1 ml NT2缓冲液并以2,000 xg 旋转2分钟，弃去上清液。
每个反应使用以下试剂制成预混液：100μlNT2、2.5μl蛋白酶K（20 mg / ml），1 μ升10％SDS。将100μl此预混液添加到每个PAS颗粒中。
在温和搅拌下于55°C孵育20分钟。
旋在2000 ×g下，2分钟，收集上清液（〜100微升）到新的管中。
到珠子中，添加200μl的缓冲NT2，旋在2000 ×g下，2分钟，收集上清液（〜200微升），并用上述上清液结合。丢弃珠子。
向合并的上清液（100μl加200μl）中加入700μlTrizol试剂。
在25°C下涡旋1分钟。
根据Trizol制造商的说明提取RNA。

RNA提取和RT-qPCR分析
向每个样品中添加200μl氯仿。
用手剧烈摇动试管10秒钟，然后在4°C下以13,000 xg离心15分钟。
将上层水层转移至装有1 ml异丙醇和1μl糖蓝的新鲜微量离心管中。
注意：Ť 他上层水层的Trizol的初始体积的通常的70％。

通过在25 °C 下孵育10分钟，然后在4°C下以13,000 xg离心15分钟来沉淀RNA 。
丢弃上清液，并用1 ml冰冷的70％乙醇洗涤沉淀一次。
在4°C下以13,000 xg离心5分钟，并弃去上清液。
在25°C下风干RNA沉淀5-10分钟。
将RNA溶于20μl无核酸酶的水中。
注意：请勿测量OD260，因为浓度非常低，这可能会浪费您的大部分样品。只需直接使用5-10μl即可制备cDNA。

通过在0.2 ml PCR试管中制备20μl反应液来使用5μlRNA溶液进行逆转录，其中含有5μl准备好的RNA，1μl随机引物，4μl5x RT缓冲液，1μlRiboLock，1μldNTP混合物和1μlMaxima逆转录酶。用无核酸酶的水调至20μl。
混合并离心几秒钟。
对于cDNA合成，请使用以下热循环仪参数：25°C持续10分钟，50°C持续30分钟，以及85°C持续5分钟（Maxima逆转录酶的制造商说明）。
用无核酸酶的水将cDNA稀释至最终体积为100μl（1：5稀释）。
使用以下混合物在384孔板中准备10μlqPCR反应：5μl2x SYBR Green PCR混合物，1μlcDNA和4μl引物混合物（正向和反向引物）。使用特异性引物对感兴趣的mRNA以及为f 或1倍或2的mRNA编码管家蛋白（例如，HSP90，ACTB，UBC 或GAPDH 的mRNA）。
用光学粘合剂膜覆盖培养板，并使用Plate Spinner将培养板离心10 s，以将反应沉降在孔的底部。
将QuantStudio 5实时PCR系统用于qPCR，在95°C下设置3分钟的循环，在95°C下5 s的40个循环加上60 °C下20 s的循环。首次使用引物组时，分析解离曲线以验证引物组在这些条件下是否最佳。

数据分析

如上所述，可以通过多种分子方法来分析用该RIP协议分离的RNA，包括定量RT-PCR（如果已知RBP的RNA结合靶点），微阵列或RNA-seq分析（用于深入的无偏方法）。）。在这里，我们介绍了RIP协议，然后进行了RT-qPCR 分析（图1A）。

图1.核糖蛋白免疫沉淀（RIP）分析。A.核糖核蛋白免疫沉淀（RIP）分析规程的示意图。B. 通过使用抗NF90抗体的RIP分析，测试了RBP NF90（这里用作例子）与ACTB 和BAFF mRNA的结合。以下RNA提取，丰BAFF 和ACTB 使用mRNA的特异性引物，通过RT-qPCR分析评估NF90 IP和IgG IP对照样品中的mRNA（ACTB：CATGTACGTTGCTATCCAGGC和CTCCTTAATGTCACGCACGAT; BAFF：CACAATTCAAAGGGGCAGTAA和ACTGAAAAGGAGGGAGTGCAT; UBC：ATTTGGGTCGCGGTTCTTG 和TGCCTTGACATTCTCGATGGT ）。将这些结果标准化为每个样品中UBC mRNA 的水平，然后绘制为相对于IgG IP样品中观察到的BAFF 和ACTB mRNA水平的NF90 IP中mRNA的富集。C.在使用抗NF90或IgG抗体进行IP后，IP物质中NF90的存在通过W 酯印迹分析得到了证实。

具体丰富的mRNA分析应以适当的“背景”控制RNA进行标准化，一个TRAN 脚本，不感兴趣的RBP明确关联，并允许用户监测样品输入的均匀度。通常使用编码大量管家蛋白的mRNA，例如UBC，GAPDH 或TUB mRNA，这是非特异性转录本。良好的背景对照RNA 的鉴定在样品输入均匀时应在IgG对照和RBP IP中产生相似的Ct值，这对于获得高质量结果至关重要。在图1B所示的示例中，我们使用UBC mRNA进行背景控制。

要从qPCR数据计算每个RIP反应的富集倍数，请先将目标RNA的Ct值标准化为对照（“看家”）mRNA的Ct 。数据的常规表示是通过显示RBP IP中的RNA相对于IgG IP的“倍富集”（后者通常显示为“ 1”，表示IgG同种型对照中的背景mRNA水平）。为了计算倍数富集，将归一化的RIP分数值（标准化为“看家” mRNA的目标RNA的ΔCt）归一化为非特异性背景（IgG分数的类似ΔCt计算），以得出ΔΔCt值。此ΔΔCt的线性转化导致倍富集，在我们的示例中针对BAFF mRNA与NF90的结合进行了绘制（图1B ）。还为阴性对照（不结合NF90 的转录本（在这种情况下为ACTB mRNA））计算了倍富集，并且发现该对照mRNA并未显着富集（图1B）。

笔记

（*）取最后一次洗涤（在100微升的珠小号TE p E7 ）通过验证IP W¯¯ 西部时代印迹分析，短暂离心，除去上清液，并添加微升SD 30 ■装载缓冲器向珠。在100 °C下煮沸10分钟，将等分试样加到SDS-PAGE 凝胶上进行W 酯印迹分析。如果IP成功，则与IgG对照相比，在感兴趣的RBP被免疫沉淀的泳道中会出现更强的信号（图1C）。

菜谱

注意：在无RNase的条件下准备所有溶液至关重要。

多核糖体提取缓冲液（PEB）
20 mM Tris-HCl，pH 7.5

100毫米氯化钾

5毫米MgCl 2

0.5％Nonidet P-40

每次添加新鲜的蛋白酶和RNase抑制剂

NT2缓冲区
50 mM Tris HCl ，pH 7. 5

150毫米氯化钠

1毫米氯化镁2

0.05％Nonidet P-40

注：PL 易于保持NT2无污染和无RNase。如果RIP无法正常工作，则最好将NT2重新制作。

致谢

JM，MG和MLI得到了NIA IRP，NIH的支持。MLI还得到了国家研究委员会– 意大利遗传与生物医学研究所（CNR-IRGB）的支持。该协议改编自JD Keene实验室先前发表的文章。该协议已由Gorospe实验室（NIA IRP，NIH）的不同研究人员进行了测试和优化。感谢D Tsitsipatis和G Delogu对稿件的仔细审查。

利益争夺

没有利益冲突或利益冲突声明。

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