材料和试剂

DNA LoBind和PCR管2 ml（Eppendorf，目录号：022431048）或类似产品
LightCycler ® 480 Mutiwell板96，白色（罗氏，目录号：04729692001）
LightCycler ® 480密封箔（罗氏，目录号：0477297501）
焦磷酸测序板（PyroMark ® Gold Q96 Plate，Qiagen，货号：979101）
PyroMark ® Q96 HS毛细管吸头（Qiagen，目录号：979104）
PyroMark ® Q96 HS试剂盒提示（Qiagen，目录号：979102）
PCR板96孔（Thermo Fisher，货号：AB0800）或类似产品
粘性PCR板（Thermo Fisher，货号：AB0558）或类似产品
聚乙烯胶PCR板（Corning，目录号：6524）或类似
铝粘合PCR板（Corning，目录号：6569）或类似产品
10/20 µl过滤嘴（雨淋，目录号：17002429）或类似产品
200/250 µl过滤嘴（雨淋，目录号：17002428）或类似的过滤嘴
1,000 µl过滤嘴（雨淋，目录号：17002426）或类似的过滤嘴
10 µl吸头（雨淋，目录号：17005091）或类似的吸头
250 µl吸头（Rainin，目录号：17005093）或类似产品
1,000 µl吸头（雨淋，目录号：17005089）或类似产品
EpiTect对照DNA甲基化（Qiagen，目录号：59655）
未甲基化和甲基化的DNA标准品（Zymo Research，目录号：D5014）
Qubit dsDNA HS分析（Thermo Fisher，目录号：Q33226）
Epitect Fast DNA亚硫酸氢盐试剂盒（Qiagen，目录号：59826）
EZ DNA甲基化金试剂盒（Zymo Research，目录号：D5005）或类似产品
HPLC纯化级的引物，阻断剂探针和焦磷酸测序引物（TIBMOLBIOL）
无核酸酶的水（Invitrogen，目录号：AM9937）
HotStar Taq聚合酶（随附各自的HotStar Taq缓冲液，Qiagen，目录号：203203）
UltraPure TM 琼脂糖（Thermo Fisher，目录号16500500）
dNTP Mix（Thermo Fisher，目录号：R0192）
SYTO TM 9绿色荧光核酸染料（Thermo Fisher，目录号：S34854）
PyroMark ®金SQA Q96试剂（Qiagen，目录号：972812）
链霉亲和素琼脂糖珠（GE Healthcare，目录号：17-5113-01）
变性缓冲液（0.2 M NaOH）
70％乙醇
氯化镁 2
盐酸
Tris基地
氯化钠
EDTA
吐温20
醋酸
结合缓冲液（参见配方）
退火缓冲液（请参见配方）
洗涤缓冲液（请参阅食谱）

设备

带层流柜的PCR前室和PCR后室
PCR前室中的20、200和1,000 µl以及多通道移液器（Rainin）或类似品和过滤器吸头
管涡
板和微管离心机（Eppendorf）或类似产品
用于96个盘子和冰桶的制冷剂块
量子位荧光计（Thermo Fisher）或类似
QIAcube（Qiagen）或类似
LightCycler ® 480仪器（Roche LifeScience）或类似产品
LightCycler ® 96仪器（Roche LifeScience）或类似产品
热循环仪（Eppendorf）或类似产品
Thermomixer（Eppendorf）或类似产品
PyroMark Q96真空工作站（Qiagen，目录号：9001529）
焦磷酸测序仪（PyroMark Q96 MD System，Qiagen）或类似产品

软件

使用MethPrimer（ http://www.urogene.org/methprimer/ ）设计PCR引物（Li和Dahiya，2002年）
核酸序列按摩器（ http://www.attotron.com/cybertory/analysis/ seqMassager。 htm ）
焦磷酸测序引物的设计可以手动进行，也可以使用商业PyroMark分析设计软件（Qiagen）进行
使用LNA oligo Tm预测工具（ http://www.exiqon.com/ls/homeoflna/Oligo-tools/tm-prediction-tool.htm ）

LightCycler 480软件（Roche LifeScience）或类似产品

Gradient LightCycler 96软件（Roche LifeScience）或类似产品

PyroMark ® CpG软件（Qiagen）或类似软件

统计或图形软件，例如Excel ®或类似的

程序

E- ice -COLD-PCR分析方法的发展包括分析方法的设计，E- ice -COLD-PCR反应的优化，感兴趣的样品以及E- ice -COLD-PCR分析的数据分析（图1）。

图1.包括三个主要步骤的E- ice -COLD-PCR分析方法的发展概况。 1）亚硫酸氢盐转化DNA的分析设计，2）优化E- ice -COLD-PCR条件和3）E- ice -COLD-PCR分析以量化目标样品中DNA甲基化的存在和水平。

分析设计
分析设计包括针对目标甲基化序列的PCR和焦磷酸测序引物的设计，以及针对甲基化CpG的最佳富集的LNA阻断剂探针的设计，这在很大程度上取决于目标区域中CpG位点的频率和间隔，可能是提出的协议中最关键的一步。
PCR引物的设计
1. 我们建议设计至少2个PCR引物组。
2. 使用MethPrimer软件为硅亚硫酸氢盐转化的DNA的目标区域设计PCR引物。最佳PCR引物大小应在20个碱基左右，且解链温度（Tm）在60°C附近。E- ice -COLD-PCR扩增子的扩增产物大小应保持相对较小（最大100-180个碱基对）。
3. 将PCR引物放置在包含四个或多个已转化胞嘧啶的区域，以确保与亚硫酸氢盐转化的DNA互补。它们应优先不包含CpG站点或限制为一个CpG站点。如果不能完全避免CpG位点，则它们不应出现在3'末端的最后五个碱基中，以避免特定DNA甲基化模式的优先扩增。
4. PCR引物不应包含回文，互补序列，简并碱基或肌苷。
5. 使用序列比对工具（例如BLAST或BLAT）和相关的dbSNP资源，检查扩增产物中是否存在单核苷酸多态性（SNP）。必须避免在目标群体中具有显着频率的扩增引物靶向的序列中的遗传变异，并应重新设计扩增引物。
6. 如果在正链上未发现引物，请使用核酸序列按摩器创建反向互补链，并重复设计过程。
7. 一个PCR引物需要在5'端进行生物素化，以便随后进行焦磷酸测序反应，而要进行生物素化的引物取决于下一步设计的焦磷酸测序引物的含义。
焦磷酸测序引物的设计
1. 焦磷酸测序引物可以手动设计，也可以使用商业PyroMark分析设计软件进行设计。我们建议设计至少2个焦磷酸测序引物，以确保最佳的测定性能。
2. 焦磷酸测序引物不应与潜在可变的位置重叠，并且不得产生引物二聚体或发夹结构。
3. 将焦磷酸测序引物置于距扩增产物末端至少五个碱基的位置。焦磷酸测序引物3'末端的最后连续的4-5个碱基应与扩增产物中的独特序列互补，以避免在合成测序过程中由于非特异性退火而引起的背景信号。
4. 将焦磷酸测序引物设计在感兴趣的可变区旁边的非多态区域中。如有必要，许多核苷酸分配可用于接近目标区域，以确保进行特定的退火。
5. 在分配顺序中使用简并碱基指示多态位置。
阻塞探针设计
E- ice -COLD-PCR的封闭探针含有锁定核酸（LNA）核碱基，以非常强烈地退火至互补序列。为了检测和分析高甲基化的分子，LNA碱基将与未甲基化的CpGs（em）即互补于亚硫酸氢盐转化后通过PCR扩增产生的胸腺嘧啶。甲基化的CpG（亚硫酸氢盐转化和PCR扩增后的胞嘧啶）将产生错配（异源双链体），并且封闭探针将在临界温度下从靶链解离，从而允许扩增和优先富集甲基化的亚硫酸氢盐转化的CpG，同时抑制未甲基化的亚硫酸氢盐的扩增。转换后的CpG。
1. 我们建议设计至少3个LNA阻断探针，以评估每个目标区域。
2. LNA阻断剂探针应在探针中心未甲基化的CpG位点包含两个以上紧密相邻的LNA碱基，并在3'末端包含一个磷酸基团，以避免在E- ice期间阻断剂探针发生任何伸长 -COLD-PCR反应。
  注意：LNA阻断剂探针也可以设计为阻断甲基化的亚硫酸氢盐转化的DNA，以富集未甲基化的亚硫酸氢盐转化的DNA分子。热力学上有利于未甲基化DNA的富集，因为与亚硫酸氢盐转化后的甲基化DNA相比，未甲基化的DNA具有较低的解链温度。因此，富集未甲基化DNA的检测设计可能具有更大的灵活性。
3. LNA阻断剂探针的长度应在40到65个碱基之间，并在3'端与扩增引物之一重叠5至6个核苷酸。
4. 如果不可能覆盖扩增产物中存在的所有CpG位点，则LNA阻断剂探针应覆盖最多连续的CpG位点，至少代表扩增产物总CpG位点的45-50％。封闭探针在探针序列下方的每个未甲基化的亚硫酸氢盐转化的CpG位点均应包含LNA碱基。
  注意：阻断剂探针序列应与非疾病相关细胞群（例如白细胞）中存在的DNA甲基化模式互补。如果在对照个体的样品中特定的CpG位点被高度甲基化，则应将其纳入设计中，以避免富集非信息性甲基化分子。
5. 不要在封闭序列5'或3'末端的最后六个核苷酸中掺入LNA碱基。
6. 确保LNA阻断剂探针和PCR引物不会产生引物二聚体。
7. 使用LNA寡核苷酸Tm预测工具验证对阻断剂探针的Tm的预测。Tm应高于70°C。可以通过增加LNA碱基的长度和/或数量来调节LNA阻断探针的Tm。如有必要，在未甲基化的亚硫酸氢盐转化的CpG位点（即）的两个碱基处都掺入LNA碱基，A与亚硫酸氢盐处理后未甲基化的胞嘧啶的T互补，而C与CpG二核苷酸的G）。如果LNA阻断剂探针下方的CpGs少于三个，则该策略可能特别有用。
  注意：计算的Tm只是温度的估计值，可能与E-ice-COLD-PCR实验中的实际行为不同。如果无法增加阻断探针的长度或阻断探针内LNA碱基的数量，则可以使用68°C至70°C的预测温度。
亚硫酸氢盐转化
按照设计，方案的下一步是要分析的样品的亚硫酸氢盐转化。
1. 在带有过滤器尖端的PCR前室中工作。
2. 根据制造商的说明，使用Qubit荧光计定量分析样品的DNA含量。
  注意：该方法目前在我们的实验室中使用，可以定量循环的无细胞DNA（Mauger等，2015）。几种可商购的方法也可用于定量DNA以及基于qPCR的测定，这些方法还将提供有关无细胞DNA片段大小的信息（Mauger等人，2015）。
3. 使用未甲基化和甲基化的DNA标准液来控制亚硫酸氢盐转化的效率（请参见注释1）。
4. 如果至少有200 ng通过荧光定量的DNA可用，则根据制造商的说明，使用QIAcube自动化系统（Qiagen）上的EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit进行亚硫酸氢盐转化，洗脱体积为40 µl。
5. 如果只有少量ng循环的无细胞DNA，请使用EZ DNA甲基化金试剂盒根据制造商的说明进行亚硫酸氢盐转化，洗脱体积为30 µl（请参阅注释1）。
6. 准备已知亚硫酸氢盐转化的甲基化和未甲基化标准DNA的系列稀释液：100％，75％，50％，20％，10％，5％，2.5％，1％，0.5％，0.25％，0.1％和0％。
  注意：应使用市售的标准亚硫酸氢盐转化的甲基化和未甲基化DNA进行E-ice-COLD-PCR的优化，并建立E-ice-COLD-PCR富集的标准曲线。
E- 冰 -COLD-PCR反应
E-
-COLD-PCR反应的优化包括三个主要步骤：确定PCR引物组的退火温度（Ta），确定PCR 的临界温度（Tc）。 LNA阻断剂探针和设计的LNA阻断剂探针的浓度梯度（图1，图2和图3）。
1. 评估至少三种不同的LNA阻断剂探针，因为E- -COLD-PCR的富集取决于扩增引物组，临界温度和LNA阻断剂探针的最佳组合。
2. 订购所有具有HPLC纯化等级的PCR引物，LNA阻断剂探针和焦磷酸测序引物。我们建议使用相同数量的合成引物对项目中的所有样品进行分析。对于LNA阻断剂探针的新合成，请通过使用LNA阻断剂探针的浓度梯度来验证富集。新的合成可能显示出略微不同的富集效率。
3. 在带有层流柜和过滤嘴的专用PCR前专用室中工作。
4. E- ice -COLD-PCR已针对从2 ng亚硫酸氢盐转化的DNA（相当于约700个DNA分子）开始的少量样品进行了优化。对于更高的DNA输入量（≤25 ng），我们建议减少反应的循环次数和/或PCR引物的数量。
5. 典型的E- ice -COLD-PCR反应条件是添加1.6mM MgCl 2 的1x HotStar Taq缓冲液（Qiagen），每种dNTP 200 µM，2.0 U HotStar Taq聚合酶，200 nM正向和反向引物2 µM SYTO9，0-100 nM封闭探针，体积为25 µl。
  注：HotStar Taq聚合酶目前在我们的实验室中用于E-ice-COLD-PCR分析和标准亚硫酸氢盐焦磷酸测序分析。可以使用其他可商购的DNA甲基化酶，但应验证该酶扩增E-ice-COLD-PCR产物的效率以及与亚硫酸氢盐转化的DNA的相容性。
6. 我们建议一式三份分析每个样本，并使用阴性和阳性对照。
7. E- ice -COLD-PCR循环条件包括在95°C下进行10分钟初始变性步骤，然后进行6个循环，分别在95°C下30 s和Ta°C下20 s（请参阅步骤C中的”确定退火温度”，然后在72°C下10 s，然后执行52个周期，分别是95°C下20 s，70°C下30 s，Tc°下20 s。 C（请参见过程C中的”临界温度的确定”），在Ta°C下20 s，在72°C下10 s，然后进行熔解曲线分析，每度采集20次，温度从65到95°C，最后冷却至40°C（图2）。
  注意：尤其是对于大量输入样品，应确定E-ice-COLD-PCR反应所需的循环数。
8. 我们建议在进行焦磷酸测序分析之前，使用熔解曲线分析验证E- ice -COLD-PCR反应（图4A）。
  
  图2. E- ice -COLD-PCR分析的不同步骤的示意图，包括三个主要步骤：初始变性，标准PCR扩增和E- ice -COLD-PCR扩增
退火温度的测定
最佳退火温度应在温度梯度热循环仪中确定，使用亚硫酸氢盐转化的100％，50％，0％DNA甲基化的DNA 对照以及阴性对照。
1. PCR反应条件与用于E- -COLD-PCR的条件相同，但未添加LNA阻断剂探针。
2. 梯度PCR程序包括在95°C下进行15分钟变性的步骤，然后进行52个循环，分别在95°C下进行30 s，在Ta梯度下进行20 s和在72°C下进行10 s，最后在72°C进行延伸C.＆nbsp;
3. 在PCR后室中，将10 µl PCR产物以及阳性和阴性对照置于2％的琼脂糖凝胶上。
4. 选择最佳退火温度时要考虑到预期的大小，PCR产物条带的强度以及反应的特异性。尽管对于E- ice -COLD-PCR并非绝对必要，但应通过焦磷酸测序来验证PCR反应过程中不存在强烈的扩增偏差。
  注意：由于亚硫酸氢盐转化后完全未甲基化和甲基化分子之间的GC含量不同，通常会在大多数未甲基化分子的情况下观察到优先扩增。可以使用不同的引物对和/或酶进行PCR扩增来减弱这种优先扩增，但是在许多情况下这种优先性仍然存在（Warnecke等，1997）。
5. 通过焦磷酸测序分析PCR产物，以验证正确的序列已被扩增，并且焦磷酸测序引物独特地退火且不会产生任何背景噪音。最佳焦磷酸测序引物应产生亚硫酸氢盐转化的DNA标准品预期高度的信号（焦磷酸测序峰），并且阴性对照（无模板，基因组DNA）上没有可观察到的信号。
临界温度（Tc）的确定
1. 使用70°C至90°C之间的温度梯度定量PCR识别临界温度。
  注意：使用支持梯度的qPCR循环仪可以快速确定临界温度和相关的封闭探针浓度。如果没有梯度qPCR热循环仪，则必须使用不同的温度进行几个独立的反应。另外，也可以使用标准的热循环仪进行优化，并在琼脂糖凝胶上分析PCR产物，然后对产生反应条件的测序反应进行测序，以产生PCR产物。
2. 我们建议在第一次测试中使用浓度分别为0、25和50 nM的LNA阻断剂探针。
3. 通过使用亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA对照的连续稀释液控制转化为亚硫酸氢盐转化的未甲基化的DNA，以产生0％，10％，25％，50％和100％的DNA甲基化度以及一个阴性对照来控制反应。
4. 我们建议一式三份地分析样品，特别是如果对DNA甲基化水平进行定量分析（因为各个扩增之间存在某些差异）。
5. 通过比较E- -COLD-PCR反应与标准qPCR反应（不添加LNA阻断剂探针），使用焦磷酸测序来定量DNA甲基化的富集（图4C）。
6. 对于某些组合（LNA阻断剂探针，LNA阻断剂探针的浓度和/或一种LNA阻断剂探针的Tc），可能不会遇到富集，PCR产物或引物二聚体的存在。在这种情况下，请降低用于Tc测定的阻滞剂浓度。
7. 对于所有重复样品，应以不同百分比的甲基化DNA作为输入（未甲基化的DNA除外）以及相同浓度的LNA阻断剂探针的不同浓度，应明确获得DNA甲基化的富集。在最佳Tc下，应获得高富集度，但可产生高质量的热解图（无分配伪像和足够的峰强度），并且应避免非特异性扩增E- ice -COLD-PCR反应（请参阅注释2）。
  注意：重要的是要避免完全封闭未甲基化的DNA，因为在这种情况下，由于低质量的样品而导致的扩增失败与完全未甲基化的样品是无法区分的。对于所有样品，均应获得PCR扩增产物，其中含有甲基化分子的甲基化分子应富集。
LNA阻断剂探针浓度的测定
1. 使用封闭探针的浓度梯度为0、20、40、60、80和100 nM。
2. 将标准亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA的系列稀释液（分别为0％，0.5％，1％，5％，10％，20％和100％）稀释到未甲基化的DNA以及阴性对照中。
3. 一式三份地分析样品。
4. 分析E-ice -COLD-PCR，未甲基化和/或甲基化DNA的扩增和富集，引物二聚体形成和重复序列可再现性的每个反应的解链曲线（图4A）。
5. 阻滞剂探针的最佳浓度应通过分析热解图来获得，并在没有任何非特异性反应的情况下选择具有最高富集度的浓度。
6. 应该在预定浓度附近的较窄浓度范围内测试另一个浓度梯度，以找到LNA阻断剂探针的最佳浓度。
  
  图3.焦磷酸测序法检测E- -COLD-PCR对DNA甲基化水平的富集，其作用是不同LNA阻断剂浓度下甲基化DNA输入的作用。显示了在 AIM2 基因启动子上DNA甲基化的富集（Mauger et al。，2018），并表明富集取决于LNA阻断剂探针的浓度。
通过E-ice-COLD-PCR标准曲线定量DNA甲基化
E- ice -COLD-PCR是一种用于检测低丰度甲基化DNA的富集方法，因此，在存在DNA甲基化的情况下，主要产生定性结果，但也可用于定量分析使用标准曲线测定DNA甲基化水平。
1. 通过比较CpG位点的标准曲线与使用不带阻断剂探针的标准qPCR获得的标准曲线来控制E- -COLD-PCR的最佳条件。
2. 分析六次重复的已知甲基化程度（100％，75％，50％，20％，10％，5％，2.5％，1％，0.5％，0.25％，0.1％和0％）的标准品的系列稀释度（请参阅注释2）。
3. 一式三份地分析样品。
多重E-ice-COLD-PCR
如果可用样品数量有限（例如用于分析循环中的无细胞DNA），则可以并行进行E-
em -COLD-PCR反应多重分析（Sefrioui等， 2017年； Mauger等人，2018年）。
1. E- ice -COLD多重检测的PCR条件应与单纯检测相同，不同之处在于应降低每种PCR引物的浓度（例如：双链体的一半）（Mauger <等等。，2018年）。
2. 使用相同的Ta和Tc进行多重E- ice -COLD-PCR反应。
  注意：不同测定的临界温度可能不相同，在这种情况下，应选择临界温度，以使多重测定中包括的所有靶标得到最佳富集（Mauger等人，2016）。
3. 通过比较单纯形测定法和标准qPCR所得的富集度来优化多重PCR，只需稍微改变阻断剂浓度和/或临界温度即可。
4. 使用熔解曲线分析来分析多路复用实验。扩增不应产生引物二聚体。
焦磷酸测序法
通过焦磷酸测序分析E-
-COLD-PCR反应（Tost and Gut，2007; Busato et al。，2018）。在PyroMark Q96 MD系统上进行焦磷酸测序反应之前，要进行样品制备步骤，包括纯化和变性E- ice -COLD-PCR产品以获得单链产品，然后进行杂交焦磷酸测序引物。
注释：
1. E-ice-COLD-PCR反应目前在我们的实验室中通过焦磷酸测序进行分析，因为它可以缩短周转时间，但是可以通过Sanger或NGS测序来分析扩增产物，或者如果不需要有关单个CpG位置的详细信息，则只需通过包括的高分辨率熔解分析。
2. 该协议使用PyroMark Q96 MD系统，但是也可以根据制造商的说明，在更新的PyroMark Q24 Advanced系统上执行焦磷酸测序分析。
样品制备
1. 我们建议在专用的PCR后房间中工作。
2. 通过转移10 µl E-ice -COLD-PCR反应，加入40 µl结合缓冲液和2 µl Sepharose微珠并用水补足至80 µl在新的PCR板上制备PCR板。
  注意：用于焦磷酸测序样品制备的不同缓冲液也可从Qiagen商购获得。我们通常会自己准备。
3. 密封PCR板，并在室温下搅拌（1,400 rpm）孵育反应10分钟，使琼脂糖凝胶珠捕获生物素化的扩增产物。
4. 在孵育过程中，通过将4 pmol焦磷酸测序引物稀释到每孔12 µl退火缓冲液中来制备焦磷酸测序板。可以在同一板上使用几种焦磷酸测序引物。
  注意：对于多重实验，由于酶混合物的热不稳定性，焦磷酸测序是在低温下进行的，因此可能有必要在标准PCR反应中分别分别扩增每种富集的PCR产物。测序引物可能与多个扩增区域同时退火，从而导致高背景信号。
5. 通过添加约180 ml的70％乙醇，180 ml的变性溶液，200 ml的洗涤缓冲液和200 ml的水来准备真空工作站。
6. 打开工作站的真空吸尘器，在抽吸设备中创建真空吸尘器。
7. 通过浸入水中几秒钟来清洁过滤器的尖端。
8. 从平板振荡器上取下PCR板，并从PCR板上取下密封条。从PCR板中吸出剩余的结合缓冲液。珠子留在尖端的过滤器上。
9. 将过滤器的尖端浸入连续的70％乙醇浴中5秒钟，变性溶液5秒钟，洗涤缓冲液10秒钟。翻转工具并释放真空。
10. 将过滤器的尖端浸入焦磷酸测序板的退火混合物中，并轻轻摇动以将小珠释放到孔中。
11. 将焦磷酸测序板在放置在加热装置上的热板上于80°C孵育2分钟。
12. 让焦磷酸测序板在室温下冷却，以使测序引物退火。
焦磷酸测序反应
1. 在焦磷酸测序板冷却期间，对在焦磷酸测序仪上运行的焦磷酸测序进行编程。
2. 使用该软件计算焦磷酸测序运行所需的试剂量。将试剂分配到适当的吸头中，然后将吸头放到药筒中，以免形成气泡。
3. 将试剂盒和密封的焦磷酸测序测试板放入焦磷酸测序仪中。执行点胶测试，以确保点胶针头正常工作。液滴应清晰可见且均匀。
4. 将焦磷酸测序板放入焦磷酸测序仪中，然后开始焦磷酸测序运行。运行的长度与分配的数量成正比（每分钟1个）。
5. 在某些情况下，与序列的一部分相对应的信号可能会丢失。运行分配测试，以检查某些提示是否被阻塞。
6. 焦磷酸测序运行结束后，取出滤芯，并用纯水冲洗以清洁吸头。

数据分析

使用LightCycler 480软件分析E- ice -COLD-PCR反应。
用亚硫酸氢盐转化的未甲基化和甲基化的DNA标准液和阴性对照的系列稀释液比较每个样品的解链曲线，以验证E- ice -COLD-PCR的扩增并检查引物是否不存在二聚体。
在多重E-ice -COLD-PCR反应中，可以为每个反应获得未甲基化和/或甲基化DNA的峰（图4A）。
使用PyroMark MD软件分析焦磷酸测序数据。
导出要使用统计或图形软件（例如Excel®）处理的结果。
使用每个样品的CpG位点的胞嘧啶和胸腺嘧啶峰强度计算每个CpG位点的DNA甲基化百分比（图4B）。
使用标准亚硫酸氢盐转化的未甲基化和甲基化的DNA的系列稀释液，为每个CpG位点建立标准曲线。计算每条标准曲线的方程式和标准偏差（请参见注释3）（图4C）。
使用标准曲线和通过焦磷酸测序获得的DNA甲基化百分比对每个样品的DNA甲基化百分比进行定量（图4B和4C）。
为每个样品计算所分析的所有CpG位点的平均DNA甲基化百分比。
每个样品一式三份，计算DNA甲基化百分比的标准偏差。

图4.通过E- ice -COLD-PCR分析DNA甲基化。 A。双链E- ice -解链曲线示例COLD-PCR反应分析 AIM2 和 RARB2 基因中的甲基化，每个扩增子均显示未甲基化和甲基化的峰。B. E- 冰 -COLD-PCR后 RARB2 的热解图示例。C. RARB2 启动子中5个CpGs位点的E- ice -COLD-PCR和qPCR标准曲线示例。

笔记

我们目前在实验室中使用EZ DNA甲基化金（Zymo Research）和Epitect Fast DNA亚硫酸氢盐试剂盒（Qiagen）。可以使用几种市售试剂盒，但对于不同的样品类型，它们的效率可能不同（WormØrntoft et al。，2017）。
qPCR反应的标准曲线（无阻滞剂）也可用于通过E- ice -COLD-PCR估算富集度（图4C）。
由于E- -COLD-PCR反应的富集，E- ice -COLD PCR标准曲线可以在高水平的DNA甲基化时饱和。因此，无法针对高DNA甲基化水平使用这些标准曲线进行定量。在这种情况下，可以进行不富集的qPCR反应来定量高水平的DNA甲基化（图4C），或者可以使用较低浓度的LNA阻断剂来进行其他E-ice -COLD-PCR反应探针。