材料和试剂

Cohen Vannas剪刀（精细科学工具，目录号：15000-01）
无菌内衬窗帘（MEDLINE，目录号：NON21001）
#3把和5把镊子
鼻锥
（可选）Gelfoom？（辉瑞，产品编号：1575-9039605）
10μl移液管（Gilson，移液管，目录号：F144802）
硅橡胶薄膜（道康宁，目录号：501-1）。这种材料是专门为植入而设计的医用级硅橡胶板
手术胶带（Dynarex，手术胶带布，目录号：3562）
无菌不锈钢手术刀片（Integra Militex Kai，目录号：4-311）
10μl吸管尖端（实验室仓库，Micropete通用尖端，目录号：750001）
无菌纱布（Fisherbrand，目录号：22-362-178）
1/2毫升单针胰岛素注射器，29克x 1/2”（柯维定，目录号：8881600350）
成年C57BLK/6小鼠（3个月以上，也可使用替代动物株）
*凝血酶（45 mmol/L CaCl2中的25单位/ml）（MP Biochemicals，LLC，目录号：154163）
*纤维蛋白原（100 mg/ml）（西格玛，目录号：F3879）
*纤维连接蛋白（8 mg/ml）（Sigma，目录号：F1141）
盐酸丁丙诺啡（Rechitt Benckiser Healthcare（UK）Ltd.，丁丙诺啡注射液，目录号：rxburpnor5 via shopmedvet.com）
润滑眼膏（主要药品，lubrifeshtmp.m.，目录号：ndc 0904-6488-38）
5-0聚二氧烷（Keebomed，20 mm反向切割聚二氧烷缝合线）
异氟醚，美国药典（吡拉麦重症监护，材料编号：400648037）
70%异丙醇（Medline，中等酒精制备垫，目录号：MDS090735
碘（Medline，中制备垫聚维酮碘，USP，目录号：NDC 53329-944-30）
洗发水（Nair，Church and Dwight Co，目录号：70501345）

*注：这些成分的等份可提前6个月制成，并在-20°C下单独储存，直到使用前。它们必须在使用前立即混合，因为它们开始立即凝结。

设备

牵开器（精细科学工具，Mini Goldstein，目录号：17002-02）
电动理发器（WAHL，目录号：99160）
解剖显微镜（奥林巴斯东京，目录号：222855）
温水泵（Gaymar，产品目录号：TP-500）
2个加热垫（一个用于手术，一个用于康复）（熟练的医疗系统，目录号：V016）
制氧机（Supravet，纯生产线制氧机，产品目录号：OC6000）
异氟醚汽化器（Vetequip，汽化器-漏斗填充，目录号：911103）
进气室、软管、过滤器和连接器（Vetequip，双程序电路，目录号：921400）
棉头喷头（Medichoice，目录号：WOD1002）
杜蒙特3c（精细科学工具，目录号：11231-20）
安全手术刀手柄3（精细科学工具）

程序

手术准备
1. 对所有设备进行消毒，并在循环水加热垫上放置覆盖物，以保持无菌场，并在手术期间保持动物温暖。水由带温度控制装置的水泵循环。
2. 将小份凝血酶、纤维蛋白原和纤维连接蛋白解冻至室温。如果在室温下放置太久，纤维蛋白原将开始独立凝固，因此确保解冻和手术之间的时间最短。
  注意：解冻后6小时内，我们已成功使用这些产品。
3. 在麻醉诱导之前，称取动物体重并制备腹腔内注射的新剂量丁丙诺啡（0.05-0.1 mg/kg）。
4. 将动物置于异氟醚箱（100%氧气中约4%异氟醚）中约4分钟，诱导麻醉。
5. 然后将鼠标放在鼻锥上，放在一个单独的区域中，以准备腿部。
6. 用电动剪子和/或指甲去除后肢背部（脚踝到臀部）的毛发。用无菌棉花涂抹器涂抹眼膏。
7. 用酒精和碘酒连续擦拭手术部位三次（从肢体中部到边缘摩擦）。
8. 用镊子（脚趾夹）按压后爪，确定麻醉手术平面。等待处理，直到没有响应。
  
  < >
手术（整个手术在立体解剖显微镜下进行）
1. 然后将动物移入手术区域，放置在鼻锥上，为手术的其余部分提供异氟醚麻醉。用手术带将后肢固定在伸展位置（图1）。在这个例子中，我们使用的是左腿，但是同样的程序可以在右腿上或者在两个腿上执行。 < >
  图1。小鼠定向和切口部位。< /强> a.小鼠通过异氟醚麻醉并用腿固定。b.腿在伸展位置的特写。黑色虚线勾勒出坐骨神经（位于股骨内侧）的位置。
  < >
2. 触碰皮肤以确定股骨，然后向内侧移动2毫米，用细手术刀在皮肤上做一个小切口（图2）。< > < >
  图2。切口：< /强>通过在坐骨神经上方的皮肤做一个小切口。坐骨神经可通过股二头肌（箭头）看到。坐骨骨骨就在股骨的外侧。神经内侧有一条平行的血管。一旦肱二头肌收缩，坐骨神经就会很明显，因为它是后肢最大的神经。
  < >
3. 使用超细波恩剪刀（FST目录号14084-08）在大腿中部钝性解剖肌肉（股二头肌），暴露坐骨神经。牵开器可用于确保足够的可视性，但在典型的手术中不需要。小心地将神经与结缔组织分离（图3）。使用一对5钳小心地分离神经。
  < >
  图3。坐骨神经显露。< /强>股二头肌钝性解剖，一对牵开器插入坐骨神经与皮肤和肌肉。< BR> < >
4. 在坐骨神经下方放置一小块（约4 mm x 4 mm见方）硅橡胶薄膜（图4）。
  < >
  图4。硅橡胶平台。< /强>坐骨神经下放置一小片硅橡胶垫。
  < >
5. 用锋利的显微切片器切断坐骨神经，使薄膜完好无损（图5）。< > < >
  图5。神经损伤。< /强>坐骨神经用小手术剪完全切断，在硅橡胶垫上留下两个残端。
  < >
6. 在光滑、无菌的表面以1:1:2的比例快速混合纤维蛋白原/纤维粘连蛋白/凝血酶，每次使用新鲜的针头。我们建议按此顺序混合以保持一致性。
7. 将大约10μl的混合物快速放置在硅橡胶膜上的坐骨神经上（图6）。在下一步之前，等待胶水变粘（通常约2分钟）。< > 注：这里我们放置20μl用于演示，但是10μl足以将神经残端固定在一起。如果神经残端不是都被胶水覆盖，那么可能需要添加更多，尽管这不太可能。 < BR> < >
  图6。神经修复。< /强>坐骨神经然后用含有纤维蛋白原（2 mg/ml）、纤维连接蛋白（25 mg/ml）和凝血酶（12.5单位/毫升）的鸡尾酒粘在一起。< > < >
8. 确保没有过多出血，分层缝合伤口，肌肉腹部缝合宽松，皮肤缝合紧密（图7和图8）。
  < >
  图7。肌肉闭合。使用可吸收缝合线将股二头肌缝合在一起。
  < >
  图8。皮肤闭合。使用可吸收缝合线重新调整和缝合皮肤。
  < > 注：也可以使用伤口夹进行步骤。 < BR/> < >
手术完成

将鼠标从异氟醚中取出并保持在加热垫上，直到鼠标清醒并自由移动。
< > 在此过程中，神经被修复，近端和远端残端之间有连续性（图9）。轴突在8周内成功地穿过切割残端之间的间隙，并最终重新连接和重新神经肌肉（Willherm等人，2012年；Rotterman等人，2019年）。 < >
图9。损伤后8周的神经修复。这些图像显示，多聚甲醛固定剂灌注的小鼠在损伤后8周神经修复成功。在这一时间点，神经完全改型，轴突重新支配下下肢后部肌肉。

笔记

纤维连接蛋白、纤维蛋白原和凝血酶混合物凝结迅速，应在手术前每天新鲜制备。如果为多个手术制作大的等分试样，请确保每次使用新鲜的移液管尖端提取溶液，因为即使接触混合也可能导致等分试样过早凝固。
如果出血过多，在继续手术前用明胶海绵止血。修复区域必须相对干燥，以确保纤维蛋白胶适当凝固。
如有必要，手术后可使用额外的胶水进一步固定神经。纤维蛋白胶需要稳定两个神经残端，如果两个神经残端没有完全安全或覆盖，可以添加更多的纤维蛋白胶。
锐利的剪刀是必要的神经切断，以确保最小的羽毛神经末梢，并没有近端和远端神经残端之间的间隙。
神经修复术后最初是脆弱的。在麻醉状态下移动老鼠时要小心，不要干扰腿。结缔组织在术后几天内迅速将修复固定。
作为对照，假手术应该通过暴露神经并将其从结缔组织中解放出来来进行。放置没有纤维蛋白胶和/或神经切断的硅橡胶垫也可以作为适当的shams。< >

致谢

这项工作得到了国家神经疾病研究所和中风补助金P01NS05228和R56NS099092的资助。NS057 196至A.W.E.和鲁思·L·基尔施泰因国家研究服务奖F31 NS0955 28 T.M.R. E.T.A奖学金由国家科学基金会研究生奖学金DGE1444 932支持。 < > 这项协议是从原来的建议使用纤维蛋白修复人类周围神经（Egloff和纳拉卡斯，1983）和啮齿动物（西非）。1988年）和进一步发展纤维蛋白/纤维蛋白原/凝血酶复合物以增强轴突生长，应用于中枢神经系统损伤（guest等人，1997年）。

相互竞争的利益

相应的作者（f.j.a.）声明，作者与本文所述作品没有财务或非财务竞争利益。

伦理学

动物护理、程序和安乐死是在作者所在大学的机构动物护理和使用委员会事先批准的情况下，按照国家卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行的。

工具书类

Adel，M.，Abdo Elgamal，D.，Bakry，R.，Abdelkader，M.，Elshazly，M.和Kamel，A.（2017年）。在sprague-dewly大鼠模型中，股神经的缝合与纤维蛋白胶微神经吻合术比较。临床、组织学和统计学特征的比较性实验评估。acta chir plast59（2）：65-71。
克鲁兹，N.I.，德布斯，N.和菲奥尔，R.E.（1986）。大鼠坐骨神经修复中纤维蛋白胶的评价
Egloff，D.V.和Narakas，A.（1983年）。神经与人纤维蛋白吻合。临床初步报告（56例）ann chir main2（2）：101-115.
Grinsell，D.和Keating，C.P.（2014年）。损伤后周围神经重建：临床和实验治疗的回顾。Biomed Res Int2014:698256。
Guest，J.D.，Hesse，D.，Schnell，L.，Schwab，M.E.，Bunge，M.B.和Bunge，R.P.（1997年）。in-1抗体和酸性fgf纤维蛋白胶对受损皮质脊髓束轴突对人雪旺细胞移植物反应的影响。J Neurosci Res50（5）：888-905。
Hóke，A.和Brushart，T.（2010年）。特刊简介：外周神经系统再生的挑战和机遇。实验神经病学223（1）：1-4。

Jensen，T.S.，Gottrup，H.，Sindrup，S.H.和Bach，F.W.（2001）。神经病理性疼痛的临床图像。欧洲药理学杂志429（1-3）：1-11。

Kelsh，R.，You，R.，Horzempa，C.，Zheng，M.和McKeown Longo，P.J.（2014年）。纤维连接蛋白对先天免疫应答的调节：III-1和EDA结构域之间的协同作用。PLOS ONE9（7）：E102974。

Koulaxouzidis，G.，Reim，G.和Witzel，C.（2015）。纤维蛋白胶修复可在体内小鼠模型的早期周围神经再生过程中增强轴突延长。神经再生res10（7）：1166-1171。

Lundborg，G.（2002年）。促进创伤后神经再生。j周围神经系统7（3）：139-140。

MacGillivray，T.E.（2003年）。纤维蛋白密封剂和胶水。J Card Surg18（6）：480-485。

莫斯森，M.W.（2005）。纤维蛋白原和纤维蛋白的结构和功能。j血栓血象学3（8）：1894-1904。

蒙迪，G.S.（1920）。周围神经损伤。Can-Med Assoc J10（3）：294-296。

Nishihira，S.（1988年）。运动神经修复的实验研究：尼龙缝线与双组分纤维蛋白粘合剂技术的比较。nihon jibiinkoka gakkai kaiho91（8）：1208-1212。

Raslan，A.，Ernst，P.，Werle，M.，Thieme，H.，Szameit，K.，Finkensieper，M.，Guntinas Lichius，O.和Iringchev，A.（2014年）。大鼠面神经修复后再生运动神经元胆碱能和谷氨酸能突触输入减少：对运动功能恢复的潜在影响。脑结构功能219（3）：891-909。

Rotterman，T.M.，Akhter，E.T.，Lane，A.R.，Macpherson，K.P.，Garcia，V.V.，Tansey，M.G.和Alvarez，F.J.（2019年）。周围神经损伤后脊髓运动回路突触可塑性依赖于小胶质细胞活化和ccr2机制。j neurosci39（18）：3412-3433。

Schoenecker，J.G.，Johnson，R.K.，Lesher，A.P.，Day，J.D.，Love，S.D.，Hoffman，M.R.，Ortel，T.L.，Parker，W.和Lawson，J.H.（2001）。小鼠局部接触牛凝血酶可诱发系统性自身免疫。am j pathol159（5）：1957-1969。

Taylor，C.A.，Braza，D.，Rice，J.B.和Dillingham，T.（2008）。肢体创伤中周围神经损伤的发生率。am j phys med rehabil87（5）：381-385。

Wang，W.，Degrugillier，L.，Tremp，M.，Prautsch，K.，Sottaz，L.，Schaefer，D.J.，Madduri，S.和Kalbermaten，D.（2018年）。纤维蛋白神经导管和改良缝合位置的神经修复。Anat Rec301（10）：1690-1696。

Wilhelm，J.C.，Xu，M.，Cucoranu，D.，Chmielewski，S.，Holmes，T.，Lau，K.S.，Bassell，G.J.和English，A.W.（2012年）。c运动可调节bdnf在神经元和雪旺细胞中的表达，促进神经再生。J Neurosci32（14）：5002-5009。

3364 免疫细胞浸润，特别是细胞毒cd8α淋巴细胞浸润，在糖尿病肾病的发生发展中起着重要作用。虽然cd8α的浸润可以通过其细胞因子的产生来评价，但其在肾脏的定位尤为重要。目前的方案描述了使用vectastain abc试剂盒进行cd8α免疫染色。该方案适用于大多数市售抗体，包括糖尿病小鼠肾脏中的cd8α抗体。【背景】糖尿病肾病（dn）是糖尿病的一种并发症，是终末期肾病最常见的病因。dn的病理改变与肾脏免疫细胞浸润程度密切相关，尤其是毒性cd8α淋巴细胞浸润。因此，一种灵敏可靠的cd8α淋巴细胞定位方法将有助于糖尿病肾病及其他炎症相关领域的研究（li等，2018）。

材料和试剂

注射器
过滤器（Tisch Scientific，Millex，注射器驱动过滤装置，0.22微米）
石蜡切片
玻璃染色瓶（IMEB，SKU:SD-09）
检测小鼠组织上主要抗体的M.O.M试剂盒（Vector Laboratories，Inc.，目录号：PK-2200）
注：本试剂盒包括一级和二级抗体稀释用的封闭液和稀释液（保存在4°C下）。
生物素化山羊抗鼠igg抗体（载体实验室，目录号：BA-9200，4℃保存）
Vectastain Elite ABC HRP试剂盒（Vector Laboratories，目录号：PK-6101，储存温度4°C）
请在程序部分或食谱部分提及Vectastain Elite ABC HRP工具包。
生物素化山羊抗鼠IgG抗体（载体实验室，目录号：BA-9400，4°C保存）
大鼠抗鼠cd8α抗体[abd-serotec（现为bio-rad实验室），目录号：mca2694，储存于-20°C]
正常山羊血清[ Sigma Aldrich（现Millipore，Sigma），目录号：G9023-10ML，存储在-20°C]
甲苯胺蓝O（Sigma-Aldrich，目录号：T3260-5G）
0.1 m磷酸盐缓冲液（Albochemicals，SKU:b0787mv4w2）
二甲苯
乙醇
甲醇
h2o2
美国公共广播电视公司
永久计数（Fisher Scientific，目录号：SP15-100）
三羟甲基丙氨酸
封闭溶液（见配方）
备用溶液（见配方）
复染工作液（见配方）
DAB溶液（见配方）

设备

烧杯（Nalgene，目录号：1542106）
轨道振动筛（标签，目录号：3520）
常规光学显微镜（Wetzlar，Leitz Orthoplan）
烤箱

程序

注：在本方案中，染色不需要抗原检索。

选择石蜡切片
1. 如果可能的话，选择合适的载玻片（包括完整的组织切片），载玻片的日期（实验）和编号（块和载玻片）。
2. 用染色日期、抗体和稀释液、寄主物种用铅笔标记载玻片。
3. 将玻片放入玻璃染色罐中，小心不要刮伤其他玻片/组织。
  注意：一定要将玻片日期、编号、抗体、稀释度信息和开始时间记录在染色簿上，并用小表格填写。
幻灯片的预处理
1. 脱烷烃：在二甲苯中浸泡玻片：2 x 15分钟。
2. 100%乙醇（ETOH）：3 x 10分钟。
3. 新制备的100%甲醇，0.3%h2o2：20分钟去除内源性过氧化物酶（200毫升100%甲醇+2毫升30%h2o2）。
4. 再水化：以95%、90%、80%、70%、60%、50%和30%乙醇浸泡玻片1分钟。
5. PBS:3 x 10分钟。
阻止非特异性反应
1. 从玻璃容器中取出玻片，用纸巾擦去玻片上多余的PBS，小心不要干扰组织。
2. 每片加入500μl封闭液（或根据组织大小），使溶液覆盖所有组织。
3. 将载玻片放入底部有ddh2o的载玻片室中，在室温下放置1-2小时。
原代抗体
1. 从培养箱中取出玻片，丢弃封闭溶液，用纸巾擦拭吸收残留溶液，小心不要让组织干燥。
2. 每片加入500μl一级抗体溶液（或根据组织大小），使溶液覆盖所有组织。
3. 将载玻片放入同一载玻片室，底部为ddh2o，盖上载玻片室，在4℃下孵育过夜。
次级抗体
1. 将3个烧杯和染色罐装满PBS。
2. 一级抗体溶液倾析，如果不回收。依次冲洗3个烧杯，然后放入染色罐。
3. 将染色瓶置于室温下，至少更换5次PBS，间隔10分钟。最好将染色瓶放置在轨道振动筛上，该振动筛设置为慢速运动（60转/分）。
4. 每片加入500μl二级抗体溶液（或根据组织大小），使溶液覆盖所有组织。
5. 将载玻片放入室温下的载玻片室中1小时。
三级抗体
1. 重复步骤5a-5c。
2. 加入500μl三级抗体溶液（或根据组织大小），使溶液覆盖所有组织。
3. 在室温下将滑梯放入滑梯室45分钟。
4. 重复步骤5a-5c。
DAB反应
1. 从染色罐中倒出PBS。
2. 轻轻地将DAB溶液倒入染色罐中10分钟。
3. 将DAB溶液倒入指定的废物容器中。在水容器中加入少量漂白剂，使DAB溶液失去活性。
4. 立即用h2o清洗玻片两次，以停止显色。
5. DAB反应产物为棕色。
反固定
1. 从染色罐中倒出h2o。
2. 把甲苯胺蓝工作液倒进罐子里。当组织既有蓝色也有棕色时，将复染液倒入容器中以停止复染。需要5-10分钟。
3. 用h2o:3 x 1分钟清洗载玻片。
4. 甲苯胺蓝染色细胞核呈蓝色。
脱水二甲苯渗透量
1. 脱水载玻片，30秒间隔，30%，50%，70%，80%，90%，95%和100%。重复100%ETOH。
2. 二甲苯浸泡2次。
3. 攀登。
4. 将玻片放在平坦的表面上，并放在40°C的烤箱中，直到玻片干燥。
用显微镜检查玻片并记录结果。

软件

imagej（https://imagej.net/downloads“target=”\u blank“>https://imagej.net/downloads）

数据分析

免疫染色阳性细胞可用游离图像J定量。根据这个方案，cd8α阳性细胞主要存在于肾间质。潜在的背景和没有特定的绑定是最小的。enos-/-db/db小鼠在8周龄时自发发展为糖尿病肾病。这些小鼠在8至20周龄时用厄洛替尼（一种表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂）或载体（水）治疗。每只小鼠取6张照片，取平均值作为一只小鼠cd8α阳性细胞密度。从经载体处理的eNOS-/-db/db小鼠和经厄洛替尼处理的eNOS-/-db/db小鼠（图1）中，对4只小鼠肾脏中CD8A阳性细胞的数量进行了定量分析。 < >
图1。erlotinib抑制egfr活性可降低enos-/-db/db小鼠肾脏cd8α淋巴细胞的浸润。a.载体或erlotinib处理的enos-/-db/db小鼠肾脏cd8a染色的代表性图像。b.定量数据（n=4，p<；0.001）。该值以平均值±标准差表示。采用studentt检验进行统计分析。

食谱

封闭溶液
如果主要抗体是在小鼠（mab）中产生的，则使用m.o.mtm试剂盒（vector laboratories，inc，burlingame，ca）的封闭溶液。对于在非鼠宿主中产生的主要抗体，用来自次要抗体宿主的10%正常血清（在pbs中）阻断载玻片。例如，如果一级抗体是在兔子体内产生的，而二级抗体是在山羊体内产生的，则用10%的正常山羊血清（在PBS中稀释）堵住玻片。
1. 用M.O.MTM试剂盒中的稀释剂稀释单克隆抗体
2. 二级抗体宿主pbs中1%正常血清中非mab原代抗体的稀释
3. 用m.o.mtm试剂盒中的稀释液稀释生物素化山羊抗鼠igg（h+l）（1:200稀释）。用PBS稀释所有其他生物素化二级IgG（1:200稀释，载体实验室）
4. 使用前至少30分钟制备三级抗体并室温保存。向2毫升PBS中加入16μL试剂A，混合，然后加入16μL试剂B并混合。根据幻灯片的数量，准备适当体积的溶液
DAB解决方案
1. 将60 mg DAB（校准并储存在冰箱中）溶于200 ml 50 mm Tris HCl中，pH值7.4
2. 然后加入80μl的30%h2o2
3. 避光
将储备溶液埋入容器
1. 将100 mg甲苯胺蓝加入200 ml 0.1 m磷酸盐缓冲液中，pH7.2
2. 在黑暗中搅拌直到完全溶解。可能需要1-3天
3. 室温避光储存
埋入工作溶液
1. 使用10毫升注射器和0.2微米过滤器（Tisch Scientific，Millex，注射器驱动过滤装置，0.22微米）将30毫升储备溶液过滤到烧杯中
2. 加入170毫升0.1米磷酸盐缓冲液，pH值7.2
3. 室温下避光储存
  注意：工作溶液可以使用两次。

致谢

作者要感谢范德比尔特大学医学院（退休）的詹姆斯·麦卡纳博士对该方案的巨大贡献。这项工作得到了NIH拨款，DK51265，DK95785和DK62794（RCH，MZZ），DK103067（RCH）和范德比尔特奥布莱恩中心（P30DK114809）（RCH，MZZ），弗吉尼亚州功勋奖00507969（RCH）和范德比尔特肾病中心的支持。本研究方案来源于1997年在JHC发表的先前研究论文（McKanna和Zhang，1997）和许多其他出版物（例如，Zhang等人，1997年；Zhang等人，2018年）。

相互竞争的利益

相应的作者声明不存在利益冲突。

工具书类

Li，Z.，Li，Y.，Overstreet，J.M.，Chung，S.，Niu，A.，Fan，X.，Wang，S.，Wang，Y.，Zhang，M.Z.和Harris，R.C.（2018年）。抑制表皮生长因子受体激活与改善2型糖尿病肾病和胰岛素抵抗相关。糖尿病67（9）：1847-1857。

McKanna，J.A.和Zhang，M.Z.（1997）。大鼠脑内脂皮质素1的免疫组化定位对ph、冷冻和脱水敏感。j组织化学-细胞化学45（4）：527-538。

Zhang，M.Z.，Wang，J.L.，Cheng，H.F.，Harris，R.C.和McKanna，J.A.（1997）。大鼠肾单位发育中的环氧化酶-2。

Zhang，M.Z.，Wang，S.，Wang，Y.，Zhang，Y.，Ming Hao，C.和Harris，R.C.（2018年）。肾髓质间质cox-2（环氧合酶-2）在预防盐敏感性高血压和维持肾内髓质/乳头结构完整性方面至关重要。高血压72（5）：1172-1179。