材料和试剂

微流控芯片制造
使用软光刻法由聚二甲基硅氧烷（PDMS）（Dow Corning，Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit）和载玻片制造微流体装置（图1）。微流体装置的标称通道宽度和深度分别为90μm和35μm。除了下游分支通道之外，基本设计类似于Shintaku等人（2014）使用的微通道。我们已经在支持信息中提供了设备的CAD文件。

图1.通道几何结构示意图。图中的字母（a到f）标识各个通道部分。 Vi（对于I = 1至5）是指施加到放置在各个储存器中的铂电极的电压。数字还指储层。例如，1 = 1，2 = nNA，3 = cNA，4 = B和5 = V.B B.。芯片中的通道部分的长度。
提取用试剂
在UltraPure DNase-/RNase-free去离子（DI）水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：10977）中制备以下溶液。在无DNA/RNA和无DNA酶/无RNA酶环境下（例如，无尘室条件下）制备缓冲液。
1. 细胞（A20，小鼠B细胞淋巴瘤）
2. 氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
3. TritonX-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
4. Tris（Sigma-Aldrich，目录号：93362）
5. 盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：258148）
6. 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（Sigma-Aldrich，目录号：437190）
7. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：PHG0001）
8. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：SO389）
9. 前导电解质（LE）（参见配方）
10. 拖尾电解液（TE）（参见配方）
11. 细胞悬浮缓冲液（参见配方）
RT-qPCR和qPCR的试剂
这里描述的试剂用于类似于Kuriyama等人（2015）的实验，其中我们对细胞质的核和细胞质RNA的gDNA进行定量。然而，我们注意到，本文所述的一般裂解，分馏和制备方案适用于其它研究（例如，来自单细胞的RNA的核对细胞质级分的分析）。
1. TaqMan RT-PCR混合物（2x）*
2. TaqMan ^？基因表达测定
3. TaqMan ^？ RT酶混合物（40x）*
4. （Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM，目录号：4392653）
5. 引物组（正向引物，反向引物）（TaqMan 探针）
6. 去离子水
7. RT-qPCR主混合物用于两个反应的细胞质RNA分析（参见配方）
8. qPCR主混合物用于一次反应的gDNA分析（参见配方）
  *注意：TaqMan /sup> 单步试剂盒含有两种试剂。

设备

显微镜
装配有CCD照相机的相差显微镜能够通过等速电泳（ITP）监测聚焦的裂解和细胞质核酸级分[参见Garcia-Schwarz等人的在线电影（2012）片上ITP实验。它还有助于监测核的迁移及其从ITP区中的胞质部分的分馏。避免使用基于荧光的可视化，例如插入染料，这可能会干扰下游测定的特异性和严格性。
高压定序器
电压定序器（例如LabSmith，Inc.，型号：HVS448-3000D）通过ITP自动裂解，提取和分级分离。
注意：当前的测量有助于监测ITP区迁移和细胞核的分馏。

将电压序列发送到电压定序器。
将电压输出连接到将放置到储存器的铂丝电极

程序

微流体系统的填充和制备
每个实验应该从一个新的微流体系统开始，以避免污染样品。洗涤方案进一步净化微流体系统和相关的铂丝电极。通过用洗涤溶液（见下文）填充储库细胞质核酸外（cNA），核核酸外（nNA）和真空（V）并在储槽输入（I）和分支（B） Y连接和单个真空管线。洗涤溶液和过程如下（视频1）：
1. 1M NaOH与0.1％Triton X-100一起温育1分钟。将铂丝电极浸入同一溶液中清洗铂丝电极。
2. 1M HCl和0.1％Triton X-100洗脱1分钟。将铂丝电极浸入同一溶液中清洗铂丝电极。
3. 用0.1％Triton X-100去离子水1分钟。将铂丝电极浸入同一溶液中清洗铂丝电极。
4. 通过对储层I和V施加真空1分钟来干燥微通道。
5. 加载LE到油藏cNA，nNA和V，并对油藏I和B应用真空约1分钟。
  
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  视频1.填充和准备微流体系统
  
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加载单细胞和提取（视频2）
这里描述的协议终于与20微升细胞质RNA样本。使用括号中的体积也可获得10μl细胞质RNA样品的方案。
1. 从所有容器中除去残余溶液，并向容器B中加入20μl（10μl）LE至容器cNA，nNA和V，以及20μl（10μl）TE。
2. 加载2微升（1微升）细胞悬浮液（约5细胞/微升）进入库I.从这个低浓度溶液引入单个细胞通过应用真空到库V.
3. 目视确认在通道的区域a中，在储存器I和交叉接合处之间的隔离的单个细胞，并将20μl（10μl）TE缓冲液添加到储存器I中。
4. 将铂丝电极放入储层I，B，cNA和nNA，并启动裂解，提取和分馏的电压序列。
5. 用1μl微量移液管从DNA Out中提取细胞核，转移到含有19μlqPCR主混合物的PCR管中。
6. 从RNA Out中提取20μl（10μl）RNA样品，转移到PCR管中
7. 将9μlRNA样品与11μlRT-qPCR主混合物混合
8. 用20μl总测定体积进行RT-qPCR和qPCR分析
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  视频2.加载单个单元格和提取
  
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食谱

前导电解质（LE）（pH 8.1）
50 mM Tris
25 mM HCl
0.4％PVP
拖尾电解液（TE）（pH 8.3）
50 mM Tris
25 mM HEPES
0.4％PVP
细胞悬浮缓冲液（pH 8.3）
50 mM Tris
25 mM HEPES
225mM蔗糖〜5个细胞/μl细胞
RT-qPCR主混合物用于两次反应的细胞质RNA分析 20.0μlTaqMan RT-PCR混合物（2x）^*
2.0μlTaqMan 基因表达测定
1.0μlTaqMan RT酶混合物（40x）^*
^{注意：TaqMan ^{> TM}一步试剂盒含有两种试剂。}
qPCR主混合物用于一次反应的gDNA分析
10.0μlTaqMan RT-PCR混合物（2x）
1.0μl引物组（正向引物，反向引物和TaqMan 探针）^*
8.0μl去离子水
^{注意：现有的引物组可以从TaqMan ^{> 拷贝数测定。}}

致谢

我们衷心感谢国家科学基金会在CBET-1159092下的资助。 H. S.承认来自日本促进科学协会的资助22686021,26289035和26630052. H. S.得到京都大学约翰门方案和日本Marubun研究促进基金的研究金的支持。

参考文献

Garcia-Schwarz，G.，Rogacs，A.，Bahga，SS和Santiago，JG（2012）。芯片等速电泳用于分离离子和纯化核酸。
（61）：e3890。

Kuriyama，K.，Shintaku，H。和Santiago，JG（2015）。 Isotachophoresis for fractionation and recovery of cytoplasmic RNA and nucleus from single cells. 36（14）：1658-1662。
Shintaku，H.，Nishikii，H.，Marshall，LA，Kotera，H。和Santiago，JG（2014）。从单个细胞的芯片上分离和分析RNA和DNA。 Anal Chem 86（4）：1953-1957。