材料和试剂

50ml离心管（例如 Falcon管）
1.5 ml微量离心管
2 ml微量离心管
不锈钢勺
葡萄浆果皮
注意：
1. 使用镊子从葡萄浆果中分离的皮肤（图1A，视频1）。将皮肤置于15或50ml管中并在液氮中冷冻立即（图1B，视频1）。将它们储存在-80℃。我们推荐准备约20片（约1克皮肤）因为浆果中有变化。
2. 此方法可应用于所有葡萄品种。
液氮
蛋白酶K溶液（20mg/ml）（Siyaku，Wako Pure Chemical Industries，目录号：160-22752）
氯化锂（LiCl）（2M，10M）（Siyaku，Wako Pure Chemical Industries，目录号：127-01165）
注意：DEPC处理和高压灭菌。
2 M乙酸钾（KOAC）（Siyaku，Wako Pure Chemical Industries，目录号：160-03175）
注意：DEPC处理和高压灭菌。
10mM Tris-HCl（pH7.5）（Siyaku，Wako Pure Chemical Industries，目录号：207-06275）
注意：DEPC处理和高压灭菌。
1M氯化钾（KCl）（Siyaku，Wako Pure Chemical Industries，目录号：163-03545）
注意：DEPC处理和高压灭菌。
乙醇[70％，99.8％（v/v）]（Siyaku，Wako Pure Chemical Industries，目录号：057-00456）
RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN，目录号：74903或74904）
无RNase水
硼酸钠十水合物（硼砂）（Siyaku，Wako Pure Chemical Industries，目录号：194-01415）
乙二醇四乙酸（EGTA）（Dojindo，目录号：346-01312）
1％（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）（Siyaku，Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-07145）
1％（w/v）脱氧胆酸钠盐（Siyaku，Wako Pure Chemical Industries，目录号：192-08312）
10mM二硫苏糖醇（DTT）（Siyaku，Wako Pure Chemical Industries，目录号：045-08974）
1％（w/v）Triton X-114（Sigma-Aldrich，目录号：X114）
2％（w/v）聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）（Sigma-Aldrich，目录号：PVP40）
重复处理并高压灭菌的焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma-Aldrich，目录号：D5758）
热硼酸盐提取缓冲液（参见配方）

设备

破碎机（自动机）（Tokken，型号：TK-AM5-H）
摇动水浴（42℃）（TAITEC CORPORATION，型号：带有PERSONAL-11的THERMO MINDER SM-05）
用角度转子离心50ml管（SAKURA，型号：50A-7，用50F-8A）
用角度转子离心1.5ml管（SAKURA，型号：SS1500X，含15M-24AM）
真空设备（EYELA，型号：CVE??-2000）

程序

从样品中提取RNA
1. 如图1和视频1所示准备葡萄浆果皮。
  
  图1.制备葡萄浆果皮。将葡萄皮与浆果（A）分离，在液氮（B）中冷冻
  
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  strong>视频1.准备葡萄浆果皮
2. 使用破碎机（1,300rpm，30秒）（图2A-B，视频2），用液体N 2粉末冷冻的葡萄浆果皮。
  
  图2.破碎机（A）和粉状葡萄浆果皮（B）
  
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  视频2.使用破碎机的粉末冷冻的葡萄浆果皮肤与液体N
  
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3. 使用冷勺将0.2 g粉末组织放入50 ml离心管中（图3A，视频3）
  
  图3. RNA样品的制备。A.将粉末状组织放入管用冷勺; B.通过涡旋混合样品。
  
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  视频3.准备RNA样本
  
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4. 加入2ml热硼酸盐萃取缓冲液（42℃）（视频3）
5. 立即加入10μl蛋白酶K溶液（20 mg/ml）（视频3）
6. 通过涡旋混合样品，直到充分混合（约20秒）（图3B，视频3）
7. 将管在42℃下在振荡水浴中孵育1.5小时
8. 在室温下以8,000rpm（8,000xg）离心10分钟。
9. 将上清转移到三个1.5ml管（600μl/管）
10. 向每个管中加入114.3μl1M KCl以调节终浓度为160mM
11. 在冰上孵育管1小时。
12. 在4℃下以10,000rpm（12,000xg）离心30分钟以除去碎屑。
13. 将上清液单独转移到1.5ml微量离心管中
14. 弃去沉淀并在步骤B中使用转移的上清液（见下文）。
RNA纯化（去除多糖）
1. 向每个管中加入178.5μl10M LiCl以调节终浓度为2M
2. 在冷室中在冰上孵育过夜。
3. 在4℃下以10,000rpm（12,000xg）离心30分钟。
4. 立即倾析并弃去上清液。
5. 每管加入200μl冷的2M LiCl
6. 通过涡旋悬浮颗粒，直到充分混合（约20秒）
7. 在4℃下以10,000rpm（12,000xg）离心10分钟。
8. 立即倾析并弃去上清液。
9. 重复步骤B5-8两次（共三次）。
10. 如果颗粒含有颜料，重复步骤B5-8直到颗粒变为无色
11. 在室温下将沉淀悬浮在100μl10mM Tris-HCl（pH7.5）中
12. 收集悬浮液在一个1.5毫升微量离心管，并用10毫米Tris-HCl（pH 7.5）调整到400微升。
13. 在4℃下以10,000rpm（12,000xg）离心10分钟以除去不溶性物质。
14. 将上清液转移到1.5ml微量离心管中
15. 加入40μl的2M KOAC调节终浓度0.2μM
16. 在冰上孵育15分钟。
17. 在4℃下以10,000rpm（12,000xg）离心10分钟。
18. 将上清液转移到2ml微量离心管中
19. 加入1.1ml的99.8％乙醇，并保持在-20℃过夜以沉淀RNA。
RNA净化和浓缩
1. 在4℃下以10,000rpm（12,000xg）离心30分钟以沉淀RNA。
2. 滗析和丢弃乙醇。
3. 用70％（v/v）乙醇洗涤沉淀
4. 在4℃下以10,000rpm（12,000xg）离心10分钟。
5. 滗析和丢弃乙醇。
6. 在真空下除去残留的乙醇。
7. 将沉淀悬浮在100μl无RNA酶的水中
8. 储存在-80°C，直到用于qRT-PCR或保持在4°C直到进一步纯化。
进一步净化和浓缩RNA用于微阵列分析
1. 使用RNeasy Plant Mini Kit根据供应商的方案进一步纯化RNA
2. 加入350μlRLT缓冲液，彻底混匀
3. 加入250微升99.8％乙醇，通过吸移混匀
4. 将样品应用于装有收集管的RNeasy微型离心柱
5. 以8,000rpm（8,000×g）离心15秒
6. 在新管上转移色谱柱。
7. 加入500μlRPE缓冲液，并以8,000rpm（8,000×g ）离心15秒。
8. 加入500μlRPE缓冲液，并以8,000rpm（8,000×g ）离心2分钟。
9. 弃去流出物并在新管上转移色谱柱。
10. 以10,000rpm（12,000xg）离心1分钟。
11. 弃去流出物并在新管上转移色谱柱。
12. 加入100μl水并以8,000rpm（8,000×g ）离心1分钟。
13. 加入100μl水并以8,000rpm（8,000×g ）离心1分钟。
14. 收集滤液，加入500μl99.8％乙醇
15. 保持在-20°C过夜以沉淀RNA
16. 重复步骤C1-6。
17. 将沉淀悬浮在10μl无RNA酶的水中。
18. 储存于-80℃直至用于微阵列分析。

食谱

热硼酸盐萃取缓冲液
0.2M硼酸钠十水合物（Borax）
30mM乙二醇四乙酸（EGTA）
1％（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）
1％（w/v）脱氧胆酸钠盐 10mM二硫苏糖醇（DTT） 1％（w/v）Triton X-114 2％（w/v）聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）注意：
1. 高压灭菌后，将硼砂，EGTA，SDS和脱氧胆酸钠盐以1.5x混合物储存。
2. 过滤DTT并在-80℃下以1M溶液储存。
3. 高压灭菌后将PVP-40作为20％（w/v）溶液贮存。
4. 在使用前添加DTT，Triton X-114和PVP-40。

致谢

这项工作得到了来自生物技术研究推进机构（BRAIN）的促进生物工业创新的基础和应用研究计划以及来自日本促进学会的科学研究助学金of Science（JSPS）。
我们感谢Wan博士和Wilkins博士的"热硼酸盐法"的显示方法。
我们也感谢Azuma博士和Nakao先生帮助我们制作数字和视频。

参考文献

Suzuki，M.，Jasinski，M.，Martinoia，E.，Nakabayashi，R.，Suzuki，M.，Saito，K.and Shiratake，K。（2015a）。 ABCG/PDRtype ABC转运蛋白在葡萄浆果皮中的分子克隆和表征 Adv Hortic Sc??i 28：53-63。
Suzuki，M.，Nakabayashi，R.，Ogata，Y.，Sakurai，N.，Tokimatsu，T.，Goto，S.，Suzuki，M.，Jasinski，M.，Martinoia，E.，Otagaki， Matsumoto，S.，Saito，K。和Shiratake，K。（2015b）。葡萄浆果皮肤中的多元学显示紫外线-C辐射对芪合成途径的特异性诱导。 a> 植物生理学 168（1）：47-59。
Wan，C.Y。和Wilkins，T.A。（1994）。改良的热硼酸盐方法显着提高了来自棉花的高质量RNA的产量（ Gossypium hirsut L.）。 Anal Biochem 223（1）：7-12。